生物技术课件——02基因工程常用工具酶.ppt

Mg 2+
AGCTAT
E.coli DNApolI
TCGATA AGCTAT
噬菌体侵染细菌
仍有少量phage λ (K)可在 E. coli B中生存， 是因为这些phage对自身进行了修饰。
普通的phage λ (K) 1
10-4（限制作用）
大肠杆菌K
大肠杆菌B
1 修饰的phage λ (K)
2.1.1.2 R-M系统
细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构 成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restrictionmodification system)。
用甲基化酶进行甲基化的作用
✓ 封闭DNA链中的某些识别位点，保护多余的限制 性酶切位点。
✓ 构建新的酶切位点
2.3 DNA连接酶（ligase）
能够催化DNA中相邻的3’-羟基和5’-磷酸基团 末端之间形成3′, 5′-磷酸二酯键的酶。
T4 DNA连接酶：可连接带匹配粘性末端的 DNA分子，也可使平端的双链DNA分子相互 连接。
大肠杆菌DNA连接酶：只能连接带匹配粘末 端的DNA分子。
2.3.1 DNA连接酶作用特点
DNA连接酶需要在一条DNA链的3’－末端具有游离 羟基（－OH），另一条链5’－末端具有磷酸基 （－P）时才可发挥作用。
3’－OH和5’－P需彼此相邻，且各自位于与互补链 上互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端。
2.1.7 限制性核酸内切酶的应用
重组DNA前的切割 构建新质粒 构建物理图谱 DNA分子杂交 用限制性内切酶消化受体DNA 制备DNA探针 亚克隆以用作序列分析 基因定位，DNA同源性研究
2.2甲基化酶(methylase)
Ⅱ类R-M系统由限制性核酸内切酶和甲基化酶两 种酶分子组成。大多数限制酶都已分离出相应的 甲基化酶。
T4DNA连接酶 Mg2＋，ATP
3’…TGCTTAAGCA…5
反应系统：ATP，Tris－HCl，MgCl2，DTE（二硫赤藓糖醇），ATP， pH7.5，4～15℃
也可以连接两条平起末端的DNA分子，但反 应速度较慢。
5’…CGAOH PCGTA…3’ T4DNA连接酶 3’…GCTP HOGCAT…5’ Mg2＋，ATP
同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列 也不相同，但切割后DNA分子产生的粘性末 端相同的限制性核酸内切酶。
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
BamHⅠ
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
BglⅡ
5’-TGATCA-3’
3’-ACTAGT-5’
BclⅠ
BamHⅠ BclⅠ BglⅡ三种酶可 产生相同的5’GATC粘性末端， 由这种同尾酶产生的DNA片 段可因粘性末端的互补而彼 此再连接起来。
甲基化酶也称修饰酶(modification enzyme)，用来 修饰限制酶的识别序列，在该序列位点的胞嘧啶 （C）5-氨基上加一个甲基，使得该序列可以被限 制性内切酶识别而免于切割。
甲基化酶分两类：
✓ 维持性甲基化酶：用于在新合成的DNA链上进行 甲基化的酶。甲基化位置与模板链上的相同。
✓ 构建性甲基化酶：用于在非甲基化的DNA链上进 行甲基化的酶。
5‘
3‘
3’
5’
2.3.3 基因工程常用连接酶
2.3.3.1 T4噬菌体DNA连接酶
由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，分子量68KD，需 ATP。
可以连接互补的粘性末端。如：
5’…ACGOH pAATTCGT…3’ 3’…TGCTTAAp HO GCA…5’
5’…ACGAATTCGT…3’
DNA聚合酶Ⅰ在DNA复制过程中的作用
DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的比较
主要的DNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(全酶) Klenow片段 T４DNA聚合酶(T４Phage感染的E.coli) 修饰的T７DNA聚合酶(测序酶) TaqDNA聚合酶(耐热) 反转录酶
2.4.1 大肠杆菌DNA聚合酶I
有大肠杆菌polA基因编 码的一种单链多肽蛋白 质， MW = 109，000 D， 约有1000个氨基酸，分 子中含有一个双硫键， 一个硫氢键，还含有锌 离子，椭圆型结构。
2.4.1.1 DNA聚合酶I催化合成DNA互补链的条件： （1）四种脱氧核苷酸dNTPs和Mg2＋离子； （2）带有3’－OH游离基团的引物； （3）单链或双链模板(DNA或RNA)； 2.4.1.2 DNA聚合酶I 具有三种酶活性： （1）5′→3′聚合酶活性；（2）5′→3′外切酶活性；
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2.1 限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶（restriction endonucleases）： 简称工具酶，是一类能够识别双链DNA分子中的 某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构 的核酸内切酶。
限制性核酸内切酶主要从原核生物中分离出来。 仅II型限制型核酸内切酶已有2000多种，可以识别
星活性
限制性内切酶识别特异性放宽。 EcoRⅠ在正常情况下识别GAATTC序列发生切割，但如果
缓冲液中甘油浓度超过5%，其识别位点发生松动，可在 AATT处发生切割，EcoRⅠ这种特殊的识别能力叫做星活性， 用EcoRⅠ*表示。星活性可造成位点切割机率不等，降解 不完全。 影响因素：甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度， 45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二价阳离 子，12%乙醇。
解双链DNA或RNA和DNA杂交体的RNA部分。 只对DNA配对部分即双链的磷酸二酯键有切割作
用。
5′TCGATAGCC AGCTATCGG
Mg 2+ E.coli DNApolI
GATAGCC + pC，pT AGCTATCGG
（3）3′→5′外切酶活性 从3’－OH端降解DNA。
5′TCGATAGCC
识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如 GANTC)两种，它们都呈回文结构。
A B C C’ B’ A’ A’ B’ C’ C B A
A B N B’ A’ 或
A’ B’ N’ B A
不同核酸内切酶的特异识别位点
5’…… C T G C A G……3’ 3’ ……G A C G T C ...…5’
切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金 限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双
链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行 切割的一种酶。 功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。
2.1.2 限制性核酸内切酶的分类
根据限制性核酸内切酶的限制修饰活性、 相对分子量大小、酶蛋白结构、切割位点 及限制作用所需的辅助因子等，将限制性 核酸内切酶分为三类：I型酶，II型酶，III型 酶。
2.1.5限制性核酸内切酶的切割特 点
在DNA分子双链的特异性识别序列部位， 切割DNA分子，产生链的断裂。
2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通 常不是彼此直接相对。断裂结果形成的 DNA片段，具有互补的单链延伸末端。
识别序列
绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够 识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序 列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列 内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫 核酸内切酶的切割位点或靶序列。
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统 的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细 菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来 DNA则会被降解。
个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予 被降解。
2.1.1.3限制性内切酶的发现
1968 Linn和Arber从E.coli B中发现限制酶Ⅰ 1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ 1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因发现限制性内
T4连接酶
(b)分子内连接
5´ AATTC······G G······CTTA A
T4连接酶
5´
GAAT TC CTTA AG
2.3.3.2 大肠杆菌DNA连接酶 只催化有匹配粘性末端的DNA分子 需有NAD＋（氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）
做能源辅助因子。
反应缓冲体系：Tris－HCl，MgCl2，EDTA，DTE （二硫赤藓糖醇），NAD，BSA，pH8.0，4－ 15℃。
5’…CGACGTA…3’ 3’…GCTGCAT…5’
可以实现分子间或分子内连接。
(a)分子间连接
(1)
(2)
5´ AATTC······G G······CTTAA 5´
5´AATTC······G G······CTTA 5´ A
(1)
(2)
5´AATTC······GAATTC······G G······CTTAAG······CTTAA 5´
200多个不同的DNA序列。
2.1.1 限制性核酸内切酶的发现
2.1.1.1 细菌的限制—修饰作用
1952年，Luria和Human，
1953年，Bertani和Weigle
发现细菌的限制（restriction）现象：
感染
E.coli k
Phageλ（k）
不感E染 .coli B『E .coli B 限制 λ（k）』
2.1.2 限制性核酸内切酶的分类
特性
限制和修 饰活性
识别与切 割位点
Ⅰ型
单一功能
Ⅱ型
单一功能
Ⅲ型
双功能
分别，随机切 割，相距较远
同一位点 相距5-10bp
对基因工 程中意义
无用
非常有用 意义不大
2.1.3 限制性核酸内切酶的命名
Escheri号 若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一 和第三个字母。
2.4 DNA聚合酶（DNApolymerase）