谷胱甘肽(GSH)含量测定

主要目的：——测定物质还原性谷胱甘肽（GSH）的含量。

主要原理：参照 GSH检测分析试剂盒说明书， 5,5 ’–二硫代–双–（2–硝基苯甲酸）能和谷胱甘肽（GSH）反应产生 2–硝基– 5–巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（ GSSG），由于 2–硝基– 5–巯基苯甲酸是一黄色产物，通过测定其在412 nm处的最大吸收可确定样品中谷胱甘肽的含量用纯化的谷胱甘肽（GSH）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入谷胱甘肽（GSH），再与HRP标记的谷胱甘肽（ GSH）抗体结合，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在 HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽（GSH）呈正相关。

用酶标仪在412 nm波长下测定吸光度（ OD值），通过标准曲线计算样品中谷胱甘肽（GSH）的含量。

实验室签章一、试剂——谷还原性胱甘肽（ GSH）测定试剂盒（南京建成生物研究所）二、仪器设备—— 96 孔酶标板—— UV-Vis 可见多功能酶标仪——旋涡混匀器——离心机——移液枪及其相应量程枪头三、实验方法根据试剂盒说明书具体操作步骤如下:1.上清液的制备：取稀释后的血清或组织匀浆液 mL，加试剂一应用液 2 mL 混匀， 4000 rpm 离心 10 分钟，取上清液 1 mL 进行显色反应。

2.显色反应：空白管中加入 1 mL 试剂一，标准管加入 20μmol/LGSH标准液 1 mL，测定管加入上步骤得到的上清液 1 mL，然后各管中分别加入mL 试剂二、试剂三、 mL 试剂四。

3.混匀，室温静置 5 分钟后，在 412 nm处将酶标板空板进行扫描，准确吸取 mL 各管反应液加入到新的 96 孔板中，酶标仪测定各孔吸光度（ OD值）。

4.血清中 GSH含量计算公式GSH含量（ mg/L）测定 OD值 -空白 OD值-3 mmol/L）×标准品浓度（ 20×10标准 OD值-空白 OD值×GSH分子量（ 307）×样本测试前稀释倍数组织中 GSH含量公式测定OD值-空白OD值-3 GSH含量（mg/gprot ）×标准品浓度（20×10 mmol/L）×GSH分子量（ 307）×样本测试前稀释倍数÷待测组织匀浆液蛋白浓度（gprot/L ）参考文献Lapshina E A, Sudnikovich E J, Maksimchik J Z, et al. Antioxidative enzyme and glutathione S-transferase activities in diabetic rats exposed to long-term ASA treatment [J]. Life sciences, 2006, 79(19): 1804-1811.。

*本课题受广西自然科学基金资助(桂科自9731046)收稿日期:2002-11-07正常人外周血单核细胞内谷胱甘肽含量的测定*王仁生　丁　华　吴　芳(广西医科大学第一附属医院放疗科　南宁　530021)摘要　目的:建立外周血单核细胞内谷胱甘肽(GS H )含量的检测方法及健康人的参考值。

方法:利用Tietze 还原酶法检测不同性别、不同年龄健康人群外周血单核细胞内的G SH 含量。

结果:正常人群中外周血单核细胞内GS H 含量男女分别为:[(133.88±72.32)×10-9]mmo l /L,[(141.51±58.98)×10-9]mmol /L ,男女之间无明显差异(P >0.05),测得各年龄段值:30岁以下为[(132.99±49.16)×10-9]mmo l /L ,30～39岁为[(129.00±68.41)×10-9]mmo l /L ,40～49岁为[(132.67±47.25)×10-9]m mol /L ,50～59岁为[(152.17±73.72)×10-9]mmo l /L,60岁以上为[(150.84±104.27)×10-9]mmol /L 。

各年龄段G SH 值无明显差异(P >0.05)。

结论:该方法所测结果可信,可作为使用内源性G SH 合成抑制剂增强放疗和化疗效果的参考依据。

关键词　谷胱甘肽;单核细胞;放射增敏剂;化学增敏剂中国图书资料分类法分类号　R446;R815THE GLUTATHIONE CONTENT OF MONDCYTE AS SAYI NG HEALT HY PEOPLE ’SBLOODWang Rensheng ,Ding Hua ,W u Fang .(Department of Radio therapy ,the First Affiliated H ospital of Guangxi Medical Univ ersity,Nanning ,530021China)Abstract Objective :To establish a test method about g lutathio ne content of mondcyte in healthy peo ple 's blood and its reference data .Methods :Using tietze methods to test the GSH content of mo ndcy te in healthypeople 's blood in different sexes and different ag es .Result :The GSH content in men and women a re [(133.88±72.32)×10-9]m mol /L and [(141.51±58.98)×10-9]m mol /L,respectiv ely(P >0.05);the GSH con-tent in young er than 30years,30～39years,40～49years,50～59years and above 60years are [(132.99±49.16)×10-9]mm ol /L ,[(129.00±68.41)×10-9]mmol /L ,[(132.67±47.25)×10-9]m mol /L ,[(152.17±73.72)×10-9]mmol /L,[(150.84±104.27)×10-9]mmol /L respectively (P >0.05).C onclu -sion :This m ethod is sim ple and the results a re accurate.The results are reliable w hen we use chemosensitization and radiosensitization to decrease the GSH co ntent .Key words　GS H ;mondcyte ;radiosensitization ;chemosensitization 谷胱甘肽(Glutathione ,GS H )是一种内源性的巯基化合物,在正常状态下多以还原态存在于组织和细胞中。

谷胱甘肽（GSH）含量测定一、实验目的1.了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程;2.学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。

二、实验原理谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸(Gly)组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。

它作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，如与自由基、重金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。

谷胱甘肽能和2-硝基苯甲酸（DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG），2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm 处具有最大光吸收。

因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。

三、实验材料小麦幼嫩叶片四、实验方法及步骤1.制作标准曲线取7只干净的试管编号，按如下表格加入各试剂，反应20分钟后在412nm 下用分光光度计测其吸光度，制作标准曲线；2.样品测定a、称取小麦叶片0.2g，加入少量5%偏磷酸缓冲液研磨提取，并用5%偏磷酸缓冲液定容至6ml，8000rpm离心10min,取上清液；b、取上述上清液2ml显色，操作同标准曲线。

3.结果计算：GSH含量（ug/Gfw）= (Cx*Vt)/(Fw*Vs)注：Cx---2ml样品中GSH含量（ug），即每管中GSH的含量Vt---样品提取液总体积(ml)；Vs----显色时所取样的体积(ml)；FW---样品鲜重（g）。

五、实验结果1.标准曲线1.样品测定结果六、注意事项1.使用移液管吸取试剂时，视线要垂直于移液管且与液面凹面水平，不能斜视，以免量取试剂不准确。

2.在提取样品时，最好沉淀出去蛋白质，以防止蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。

3.在研磨叶片时，为方便研磨，刚开始时加入少量的提取液。

人谷胱甘肽（GSH）酶联免疫分析试剂盒使用说明书厦门慧嘉生物科技有限公司本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中谷胱甘肽（GSH）的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人谷胱甘肽（GSH）水平。

用纯化的人谷胱甘肽（GSH）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入谷胱甘肽（GSH），再与HRP标记的谷胱甘肽（GSH）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽（GSH）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人谷胱甘肽（GSH）的含量。

样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。

加入一定量的PBS，PH7.4。

用液氮迅速冷冻保存备用。

标本融化后仍然保持2-8℃的温度。

加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。

还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的测定关键词：还原型谷胱甘肽GSH氧化型谷胱甘肽GSSG测定2009-04-24 00:00 来源：互联网点击次数：6147GSH和GSSG 参照Anderson等（1992）。

取0.5 g样品，加入3 mL冰冷的6%的偏磷酸（含1 mmol•L-1 EDTA ，pH 2.8），冰浴研磨，匀浆液以20,000 g，4 ℃离心15 min，取上清液来马上测定GSH和GSSG的含量或储存在-20 ℃下等待测定。

总的GSH和GSSG含量测定如下：200 μL提取液加 1.2 mL反应液包含400 μL反应液1（110 mmol•L-1 Na2HPO4•7H20，40 mmol•L-1NaH2PO4•H2O，15 mmol•L-1EDTA，0.3 mmol•L-15,5‘-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）DTNB，0.04% BSA）、320 μL反应液2 （1 mmol•L-1 EDTA，50 mmol•L-1 imidazole 咪唑solution and 0.02% BSA）、400 μL反应液3（5% Na2HPO4，pH 7.5的溶液稀释50倍）、80 μL 9.0 mmol•L-1 NADPH。

测定OD412下的吸收值。

GSSG 含量测定如下：200 μL提取液加入1 mL的2-2乙烯嘧啶（稀释50倍）在25°C下水浴1 h再测定OD412下的吸收值。

GSH的含量可以从总的GSH和GSSG含量中减去GSSG含量获得。

GSH测定方法：取样品0.5 g，加入预冷的5%磺基水杨酸2.5 ml和少许石英砂，充分冰预研磨，转入离心管中，于4℃下20,000×g离心20min，将上清液分装，液氮冷冻后于-20℃保存或直接进行抗氧化剂分析。

取50 μL上清液，用5% 磺基水杨酸定容至100 μL （即加入5% 磺基水杨酸50 μL），加入24 μL 1.84 mol•L-1三乙醇胺triethlene diamine以中和样液，加入50 μL 10% 乙烯吡啶Polyvinyl pyridine （用70% 乙醇配制），25℃水浴1 h，以除去GSH，到时加入706 mL 50 mmol•L-1磷酸缓冲液，pH 7.5，内含2.5 mmol•L-1 EDTA，加入20 μL 10 mmol•L-1 NADPH 和80 μL 12.5 mmol•L-1 DTNB（二硫硝基苯甲酸），混匀，25℃保温10 min，到时加入20μL 50 U•mL-1 GR，总体积为1 mL，立即混匀，读出3 min时的OD值。

GSH含量测定一、原理还原性谷胱甘肽(GSH)是植物细胞重要的抗氧化剂之一，是一个良好的表示氧化胁迫的指标。

GSH+TDBN在pH=7时生成黄色物质，其颜色深浅与GSH的浓度成线性关系。

即：在巯基化合物的存在下，无色的DTNB将被转变成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸。

由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在412 nm处具有最大吸收，DTNB的吸收光谱并不干扰巯基的测定。

二、材料、试剂、仪器1、材料：小麦叶片2、试剂(1）GSH标准溶液：称取10mg 分析纯GSH，溶于蒸馏水中，并定容于10ml，即为1mg/ml 之标准母液，用稀释10倍（0.1mg/ml GSH）；(2）5%偏磷酸；(3）0.2mol/L 磷酸钾缓冲液，pH7.0；(4）TDNB试剂：称取39.6mg二硫代双-二硝基苯甲酸（TDNB），用0.2mol/L磷酸钾缓冲液溶解并定容于100ml；(5）1mol/L NaOH溶液。

2、仪器（1）可见分光光度计：4台；（2）离心机：1台（10000转/分）；（3）1/千天平-2台；（4）离心管：3支×16（10ml）（5）刻度试管：4×16支；（10或15ml）（6）普通试管（刻度试管）：7支×4（15*150 标准曲线）（7）刻度吸管：0.5ml-8支； 1ml-8支; 2ml-16支; 5ml-8支；（8）研钵：1×16个；（9）比色杯4套；（10）吸水纸适量；（11）剪刀8把；（12）玻棒8支；三、方法步骤：1、制作标准曲线：取7支刻度试管，编号，按表加入试剂：将上述溶液混合均匀，在室温下显色5min。

在412nm波长下测定吸光度。

以标准溶液中GSH浓度为X，吸光度为y，制作标准回归方程，（并求出GSH含量。

）2 、样品测定：称取植物鲜样0.204g加入少量5%偏磷酸研磨提取，并用5%偏磷酸定容到10ml。

10000rpm 离心10min。

离心后取上清液2 ml，同标准曲线操作。

1.3.6.2 血或组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活力测定1.3.6. 原理谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反映的系统。

对避免体内自由基引发膜脂质过氧化专门重要，其活力以催化GSH氧化的反映速度，及单位时刻内GSH减少的量来表示，GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反映在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反映氧化，因此最后计算酶活力时，必需扣除非酶反映所引发的GSH减少。

1.3.6. 试剂和仪器仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器试剂：叠氮钠磷酸缓冲液N a N3终浓度LEDTA-N a2终浓度LN a2HPO4 1.732g终浓度LN a H2PO4 1.076g终浓度L加蒸馏水至100mL，用少量HCL、N a OH调，4℃保留。

1mmol/L谷胱甘肽（还原型GSH）溶液GSH 加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保留1－2日。

－LH2O2溶液取30％H2O2－，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4℃避光保留，临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。

偏磷酸沉淀液HPO316.7g（先用蒸馏水溶解）EDTA0.5gN a Cl280g加蒸馏水至1000mL，用一般滤纸过滤，室温保留。

LN a2HPO4溶液:N a2HPO422.7g加蒸馏水至500mL，室温保留。

DTNB显色液DTNB40mg柠檬酸三钠 1.0g加蒸馏水至100mL，4℃避光保留1个月。

0.2M磷酸缓冲液%生理盐水1.3.6. 实验步骤1.3.6. 样品制备溶血液：取鼠血10μl加入到1mL双蒸水中，充分振摇，使之全数溶血1:100待测，4h 内测定酶活力。

假设当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20℃冻存，3d内测定，假设4℃寄存，28h内必需测完。

还原型谷胱甘肽（reduced glutathione,GSH）含量测定试剂盒使用说明产品简介：GSH/GSSG是细胞内最重要的氧化还原对之一。

因此，测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。

DTNB与GSH反应生成复合物，在412nm处有特征吸收峰；其吸光度变化与GSH含量成正比。

试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1ml比色皿、双蒸水产品内容：试剂一×1支，充分溶解于100ml双蒸水，4℃保存试剂二×1支，充分溶解于50ml试剂一中，4℃保存试剂三×1支，充分溶解于10ml双蒸水中，4℃避光保存操作步骤：一、样品前处理：取组织约0.1g，加1ml试剂二，冰上充分研磨，8000rpm4℃离心10min，取上清。

（如上清不清澈，再离心3min）GSH测定操作：测定前将试剂一于25℃水浴20min按每100mg组织加入1000µL生理盐水的比例进行匀浆。

8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

对于非哺乳动物组织：按每100mg组织加入1000µL提取液的比例进行匀浆。

8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

（2）血清（浆）样品：直接检测。

二、测定操作表：测定管空白管样本0.1ml/试剂一0.7ml0.7ml蒸馏水/0.1ml试剂三0.2ml0.2ml 迅速混匀，于412nm测吸光值，并记录第60s的OD值GSH含量计算：GSH标准曲线公式：y=0.0015x+0.0818（x为GSH浓度，y为吸光值）液体中GSH（µmol/L）=[（OD测定管-OD空白管）-0.0818]/0.0015×样品稀释倍数组织中GSH计算：①GSH（µmol/mg prot）=[（OD测定管-OD空白管）-0.0818]/0.0015×样品稀释倍数÷样品蛋白浓度（Cpr）②GSH（µmol/g mass）=[（OD测定管-OD空白管）-0.0818]/0.0015×样品稀释倍数÷样品质量（g）注意事项：（1）样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，以免影响其活力测定时，除试剂一外，其它试剂均需放置在冰上；（2）样本测定前先取1-2个样做预实验，如吸光值太高（超过标准曲线范围，即y ＞0.2时），应先用试剂二稀释到适当倍数，使得吸光值在标准曲线范围内。

1、枸杞中GSH含量范围在6.56-7.37 mg/g 参考文献：枸杞中谷胱甘肽的含量测定研究。

2、GSH广泛存在于动、植物中，在面包酵母、小麦胚芽和动物肝脏中的含量极高，达100-1000mg/100g,在人体血液中含26-34mg/100g，鸡血中含58-73mg/100g，猪血中含
10-15mg/100g,在西红柿、菠萝、黄瓜中含量也较高（12-33mg/100g），而在甘薯、绿豆芽、洋葱、香菇中含量较低（0.06-0.7mg/100g）
参考来源：食品论坛/thread-67897-1-1.html.
3、谷胱甘肽在羊的谷胱甘肽为114-152μg /公斤参考外文：Phenotypic blood glutathione concentration and selenium supplementation interactions on meat colour stability and fatty acid concentrations in Merino lambs-谷胱甘肽浓度和硒表型血液补充肉的颜色稳定性关系和脂肪酸含量很高的羊羔
4、大纲视图能看，主要讲的是小鼠肝的谷胱甘肽的含量也许您能看懂s
张老师参考中文和外文文献以及网站论坛搜索就找到这些，你看中不？。