磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶的研究

磁性微球固定化酶工艺研究进展卢燕燕;王宝维【摘要】磁性微球固定化酶就是利用磁性微体作为裁体进行酶的固定化,由于其具有环保、酶重复利用效果好和降低生产成本等优点,近几年已经成为研究的焦点.本文重点对磁性微球固定化酶制备工艺的研究现状、应用及发展前景进行阐述,为同行们今后开展研究提供参考.【期刊名称】《肉类研究》【年(卷),期】2010(000)005【总页数】5页(P78-82)【关键词】磁性微球载体;固定化酶;制备工艺【作者】卢燕燕;王宝维【作者单位】青岛农业大学,食品科学与工程学院,山东,青岛,266109;青岛农业大学,食品科学与工程学院,山东,青岛,266109【正文语种】中文【中图分类】TS201.2酶参与体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变换。

作为一种生物催化剂，酶可以在常温常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也可顺利地进行反应，而且反应底物专一性强、副反应少等优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。

但在实际应用中，酶对环境敏感、反应后难以回收等缺点限制了酶制剂产品的开发和应用，在这种情况下，固定化酶应运而生[1]。

所谓酶的固定化是指利用化学或物理手段将游离的酶定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术[2]。

在理论及实际应用上，酶固定化技术克服了游离酶的许多缺点，但是固定化酶技术目前还存在固定效率低、载体的有毒性、成本高、稳定性差、不能大规模生产等问题，这些都限制了固定化酶技术的发展与应用。

在固定化酶技术中，载体材料的结构和性能对酶的活性保持及应用至关重要，因此对固定化酶载体的研究成为该领域研究的热点。

本文主要从其中的一种新型载体——磁性高分子微球的特点出发，就磁性微球固定化酶工艺的研究现状、应用及前景进行综述，为新型载体的选择提供理论依据，以期随着生物技术及材料、化工等各相关学科的不断发展，固定化酶的工作会有新的突破。

磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶的研究Study of immobilization of lipase in magnetic chitosan microspheres纵伟刘艳芳赵光远ZONG Wei LIU Yan-fang ZHAO Guang-yuan（郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002）（School of Food and Biological Engineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou，Henan450002,China）摘要：目的：为制备具有高活性的固定化脂肪酶。

方法：以磁性壳聚糖微为载体，用物理吸附法固定化脂肪酶，对影响固定化的各种因素进行考察，确定了最优条件，并比较游离酶和固定化酶的pH和热稳定性，研究固定化酶的使用稳定性；结果：固定化的适宜条件为采用加酶量600U/g,温度5℃,pH7.0，固定时间2h。

固定化酶的pH和热稳定性都优于游离酶，固定化酶连续使用5次，其相对酶活仍为使用前的57.8%，具有较好的操作稳定性。

结论：磁性壳聚糖微球是固定脂肪酶的良好载体。

关键词：磁性壳聚糖微球；固定；脂肪酶Abstract：Objective：To produced the immobilized lipase with higher activity; Methods:Lipase(EC3.1.1.3)was immobilized in magnetic chitosan microspheres by physical adsorption．In this article．different factors that influenced the immobilization were investigated，and the optimum conditions were ascertained．Comparative studies of pH and thermal stability between free lipase and immobilized lipase were also conducted;Results:The optimum factors of immobilization were as follows:600U/g lipase was added to the solution at pH7.0,5℃for2h.In comparison with free lipase,the pH and thermal stability of immobilized lipase was increased.To use in hydrolyzation of oil,the immobilized enzyme activity remained activity of 57.8%after5repeated hydrolyzation.Conclusion：Magnetic chitosan microspheres was a kind of good support for immobilized enzyme. Keywords：Magnetic chitosan microspheres；Immobilization；Lipase——————————基金项目：河南省教育厅杰出科研人才创新工程项目（项目编号：2007KYCX0020）作者简介：纵伟（1965-），男，郑州轻工业学院食品与生物工程学院教授、博士。

壳聚糖纳米磁性微球固定脂肪氧合酶的研究夏云空;魏炜;杨帆【摘要】实验采用溶胶凝胶法制备了纳米磁性Fe3O4,并用壳聚糖对颗粒2四川大学,生命科学学院,四川成都表面进行了表面修饰得到壳聚糖纳米磁性微球复合载体,再以戊二醛为交联剂将脂肪氧合酶固定在复合载体上,并测定了不同因素对游离酶和固定化酶活性的影响;实验表明,微粒在电镜观察下呈亮黑色球状,直径约为150nm,并具有良好的磁性,固定在载体上酶的含量约为7.6%,游离酶的最适温度为30℃,最适pH8.0,而固定化酶的最适温度为30℃,最适pH9.0,当H2O2浓度为12.0 g/L时,游离酶和固定化酶的活性最强;实验结果表明通过交联的方法成功将脂肪氧合酶固定在了纳米磁性四氧化三铁颗粒上,并表现出了较好的活性.【期刊名称】《生物技术世界》【年(卷),期】2016(000)002【总页数】3页(P3-5)【关键词】纳米磁性Fe3O4 固定酶脂肪氧合酶酶活【作者】夏云空;魏炜;杨帆【作者单位】四川大学生命科学学院,四川成都610000【正文语种】中文【中图分类】Q5酶的固定化过程是指以化学或物理的手段，将酶束缚在一定区域内，限制酶分子在此区域内的催化作用，在应用过程中，固定化酶能够克服游离酶无法回收的缺点，可以提高酶的利用率，减低生产成本。

目前用于固定化酶的载体种类很多，磁性物质作为一种绿色材料是近年来研究较多的材料。

目前，用于固定化酶的主要载体之一是纳米Fe3O4，其制备方法也有多种，如水热法，溶胶凝胶法和共沉淀法等［6］，磁性微球固定化酶的研究成为许多研究者青睐的课题。

脂肪氧合酶是一类较为常见的酶，应用前景广阔，可用于染料、涂料和洗涤剂等工业化生产。

然而，脂肪氧合酶的稳定性差、回收困难等缺点限制了其在工业领域的应用，酶的固定化可以显著改善酶的热稳定性，因此，对寻找一种适宜与脂肪氧合酶的固定化载体和方法的研究是一项令人感兴趣的工作。

本研究通过溶胶凝胶法制备纳米磁性Fe3O4，并用壳聚糖对粒子进行了表面修饰得到纳米磁性载体，然后用交联法固定脂肪氧合酶，研究了影响酶活的因素，以期获得一种较好的酶固定化方法，并为固定化脂肪氧合酶的进一步应用奠定基础。

磁性壳聚糖的制备及在脂肪酶固定的应用王楠楠;张大准;董发才【摘要】采用共沉淀法制备磁性壳聚糖微球,戊二醛做交联剂把脂肪酶固定在磁性壳聚糖载体上,分别使用扫描电子显微镜、傅立叶红外光谱仪、X射线衍射仪、振动样品磁强计、热重分析仪等对磁性壳聚糖微球进行表征分析,并检测了固定化酶的特性.结果表明,制备的磁性壳聚糖性能良好,与游离酶相比,固定化酶的最适pH,最适温度均有提高,固定化酶的热稳定性,对变性剂的耐受力,重复使用性都有较大幅度提高.%The magnetic chitosan microspheres were prepared using the cross-linking co-precipitation technique.The lipase was immobilized on magnetic chitosan microspheres using glutaraldehyde as a crosslinking agent.The characteristics of the magnetic chitosan microspheres were evaluated by scanning electron microscope (SEM), fourier transform infrared spectrometer (FT-IR), phase X-ray diffraction (XRD), vibration sample magnetometer (VSM) and the thermogravimetric analysis.The results indicated that the microspheres had good properties.The thermal, degeneration agent of urea tolerance, reusablities and storage stabilities of the enzyme were greater increased after the immobilization the free enzyme.【期刊名称】《化学研究》【年(卷),期】2017(028)002【总页数】7页(P247-253)【关键词】磁性壳聚糖;脂肪酶;固定化酶【作者】王楠楠;张大准;董发才【作者单位】河南大学生命科学学院,植物逆境生物学重点实验室,河南开封475004;河南大学生命科学学院,植物逆境生物学重点实验室,河南开封 475004;河南大学生命科学学院,植物逆境生物学重点实验室,河南开封 475004【正文语种】中文【中图分类】O629.8脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3)又称三脂酰甘油水解酶，能够将甘油三酯水解为脂肪酸和甘油[1-2]. 随着研究的深入，人们发现脂肪酶还能够催化甘油三酯的醇解、脂肪酸的酯化、酰胺键的水解等反应. 基于脂肪酶的这些催化特性，目前已被广泛地用于食品[3-4]、生物柴油[5-6]和药物的拆分[7]等领域. 游离的脂肪酶在工业应用时存在分离纯化等困难，一般为一次性使用，很难回收利用，增加工业成本[8]. 固定化技术可以解决以上问题，固定化酶不仅保持了游离酶的高效性和专一性，同时增加了酶对温度、酸碱、变性剂的耐受性，易于分离和重复使用，有效的降低了成本，已引起国内外学者的关注[9]. 壳聚糖(CS)具有生物相容性、生物亲和性和无毒等特性，分子链上大量存在的羟基和氨基又使其易于进行化学改性，常被作为磁性高分子材料的“外壳”而应用于污水处理、医药和酶固定化等领域. 磁性壳聚糖微球作为一种新型功能高分子材料，已作为载体被广泛应用于酶的固定化领域. WANG等[10]采用乳化交联法成功制备磁性壳聚糖微球固定化碱性蛋白酶. LIU等[11]应用壳聚糖包覆的Fe3O4磁性纳米粒子固定化木聚糖酶，固定化酶量达162.2 mg/g，显示了较高结合酶的能力. CHEN等[12]使用磁性壳聚糖微球对β-半乳糖苷酶进行固定化研究，分解乳糖生产低聚半乳糖，产率可达到50.5%. 目前，磁性壳聚糖微球作为载体已经应用于淀粉酶，米糠内源酶，酵母乙醇脱氢酶、蛋白酶、脂肪酶[13-17]等的固定化的应用. 通常采用乳化交联法制备磁性壳聚糖微球，但该方法使用了大量有机试剂，成本高、对人体有害、污染环境、操作复杂. 本实验通过共沉淀法制备磁性壳聚糖微球得到性能良好的脂肪酶固定化载体，克服了以上缺点，并对固定化酶特性做了相关研究.1.1 实验仪器和试剂AVATAR360型傅立叶变换红外光谱仪，美国 Nicolet公司；X Pert Pro型X射线衍射仪，荷兰Philips；JSM5600LV型扫描电子显微镜，日本电子株式会社；HWS28型电热恒温水浴锅，上海恒科学仪器有限公司；LNG-T83型干燥箱；JJ-1型电动搅拌器，金坛市科析仪器有限公司.三羟甲基氨基甲烷(TRIS)购于索莱宝公司；四水氯化亚铁，戊二醛(体积分数50%)均购自阿拉丁公司；Candida rugosa lipase Type VII购自Sigma公司；十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、异丙醇购于天津基准化学试剂有限公司；壳聚糖、4-硝基酚、三氯乙酸、乙二胺购自国药集团化学试剂有限公司；4-硝基苯基棕榈酸酯购自萨恩化学技术有限公司；盐酸购自中平能化集团开封市东大化工有限公司；冰乙酸购自天津市德恩化学试剂有限公司；六水三氯化铁购自天津市科密欧化学试剂有限公司.1.2 方法1.2.1 磁性壳聚糖微球的制备称取0.3 g壳聚糖加入250 mL三口烧瓶中，取15 mL的2%的冰醋酸溶液加入三口烧瓶中，搅拌使壳聚糖完全溶于冰醋酸溶液，分别称取1.22 g六水三氯化铁和0.5 g四水氯化亚铁溶于30 mL 0.05 mol/L的稀盐酸中，充分搅拌至氯化铁和氯化亚铁完全溶解后倒入三口烧瓶中，500 r/min搅拌使铁盐与壳聚糖冰醋酸溶液充分混合，加入3 mL体积分数50%的戊二醛200 r/min交联1 h，加入1.3 mol/L氢氧化钠至完全沉淀，将沉淀转移至烧杯中用灭过菌的双蒸水洗涤3次，然后磁分离和真空干燥，即可得到磁性壳聚糖微球(Fe3O4/CS).1.2.2 磁性壳聚糖微球的活化和醛基含量测定磁性壳聚糖微球的活化：称取0.5 g磁性壳聚糖微球，分别加入10 mL浓度为0.55%的戊二醛溶液，对制备的磁性壳聚糖微球进行活化.醛基含量测定[18]：分别称取0.1 g恒重干燥的磁性壳聚糖微球和活化后的磁性壳聚糖微球，加入到25 mL 0.25 mol/L的盐酸羟胺-甲基橙溶液中，用玻璃棒搅拌使其充分接触，室温下反应2 h后，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定，当溶液颜色由红色变成黄色后停止滴定，记录此时消耗的NaOH溶液体积. 将不加样品，其他条件不变作为空白对照，记录空白对照消耗的NaOH溶液体积. 使用空白对照校正样品的滴定结果. 醛基的含量计算公式如下：N: NaOH的浓度, mol/L; V0: 样品消耗的NaOH溶液体积, mL; V1: 空白对照消耗的NaOH溶液体积, mL; W: 样品的质量, g.1.2.3 脂肪酶的固定称取0.5 g磁性壳聚糖微球置于100 mL的三口烧瓶中，加入10 mL 0.35%的戊二醛溶液与磁性壳聚糖微球于30 ℃，120 r/min交联60 min，磁分离，弃上清保留沉淀，取灭过菌的双蒸水洗涤沉淀物3次后加入10 mL一定浓度的脂肪酶pH 7.5的PBS缓冲液100 r/min反应60 min，磁分离，分别检测上清和固定化酶的活力.1.2.4 脂肪酶活力测定[19]酶活力单位定义: 在pH 7.5时，35 ℃条件下，每小时内催化产生1 mmol对硝基酚需要的酶量为1个脂肪酶活力单位 (U).具体实验步骤参照文献[19]，其中终止反应的三氯乙酸和中和反应NaOH加入量均为5.2 mL.固定化率=(固定化酶活力/加入游离酶的活力) ×100%2.1 磁性壳聚糖微球的表征分析2.1.1 热重图磁性壳聚糖微球热重分析如图1所示. 100 ℃以下的失重可能是由于不同方法制备的磁性壳聚糖微球有少量的水份. 第二个失重阶段在200～650 ℃温度范围内，这部分的失重来源于壳聚糖的分解. 继续升高温度，曲线趋于平稳，表明壳聚糖已经完全分解. 此结果表明，制备的磁性壳聚糖微球中壳聚糖的含量在60%以上.2.1.2 扫描电子显微镜 (SEM) 观察图2 (A) 是Fe3O4的扫描电镜图，由图可知Fe3O4粒子的微观形貌呈不规则的类球形，有轻微团聚现象. 图2 (B) 和图2 (C) 中磁性壳聚糖微球表面凸凹不平，有孔状片层，与Fe3O4粒子的微观形貌有显著差异，结合热重分析的结果，说明Fe3O4粒子表面包裹了壳聚糖形成了磁性壳聚糖复合微球.2.1.3 傅立叶红外谱图图3为CS (a)，Fe3O4 (b) 与Fe3O4/CS微球 (c) 的FT-IR谱图. 从图3中可以看出，谱线 (b) 于588 cm-1有强吸收峰，此处对应于Fe3O4中Fe-O特征伸缩振动吸收峰. 谱线 (c) 在588 cm-1附近也有吸收峰，并且与谱线 (b) 中Fe3O4的特征吸收峰非常相似，说明Fe3O4/CS微球中有Fe3O4，壳聚糖确实包埋了Fe3O4. 谱线 (a) 在3 431 cm-1附近有红外吸收，这是-OH和-NH2的伸缩振动峰，2 892 cm-1附近为壳聚糖中C-H的伸缩振动吸收峰，1 084 cm-1附近为C-O峰. 谱线 (c) 中既出现了壳聚糖的特征吸收峰，又在1 649 cm-1处出现Shiff碱键C=N的特征吸收峰，说明磁性微球的外层成功包埋了壳聚糖，并且交联剂戊二醛和壳聚糖发生了交联反应.2.1.4 X射线衍射分析(XRD)图4所示 (a) 为磁性Fe3O4粒子的XRD谱图，(b) 为Fe3O4/CS微球的XRD谱图. 从图4中可以看出，(a)磁性Fe3O4粒子的XRD图谱没有出现杂质峰，是典型的单相四氧化三铁的尖晶石结构. (b)Fe3O4/CS微球的在2θ角为30.1°、35.5°、43.1°、53.4°、57°、62.6°这6个典型的峰位置出现主要衍射峰，与(a)基本相同，表明磁性Fe3O4粒子被壳聚糖包埋修饰过后，其晶格结构未变化.2.1.5 磁学特性图5中 (a) 是四氧化三铁的磁滞回线，(b) 是磁性壳聚糖微球的磁滞回线. 从图5中可以看出，磁性壳聚糖微球的比饱和磁化强度与四氧化三铁相比，下降幅度较大，可能是因为大量的壳聚糖包埋在四氧化三铁表面，降低了磁性壳聚糖载体的比饱和磁化强度，间接证明了壳聚糖成功包埋了四氧化三铁.2.1.6 磁性壳聚糖微球醛基含量的测定磁性壳聚糖微球醛基含量的测定结果如表1所示，每克磁性壳聚糖材料中有0.89 mmol醛基；经戊二醛活化后的磁性壳聚糖材料中，每克有1.46 mmol醛基，原因是戊二醛可以增加壳聚糖表面醛基，进而使磁性壳聚糖中的醛基数目增加.2.2 固定化酶性质测定2.2.1 磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶最适温度测定在温度较低时，适当增加温度可以提高酶的活性，因为此时酶分子的催化速度随温度的增加而增大. 但是脂肪酶的本质是蛋白质，温度过高会导致酶因构像变化变性而失活. 因此必须在酶催化反应活化速度和蛋白质变性之间寻求一种平衡，探索酶活反应温度的最佳值. 由图6可以看出，游离酶活力在35 ℃ 时最高，固定化酶的最适温度为43 ℃，相比游离酶提高了8 ℃，原因可能是脂肪酶被固定到载体上后，载体束缚酶分子，对外界影响有一定屏蔽保护效果. 当反应温度高于35 ℃，游离酶的活力开始下降，固定酶的活力继续上升，43 ℃后无论是游离酶还是固定酶活力均下降，因为温度过高导致酶分子失活比例增大.2.2.2 固定化酶最适pH测定底物溶液pH为4.0，5.0，6.0，7.0，7.5，8.0，9.0，10.0时酶活，并在相同条件下测定对应的游离酶酶活，以同组最高酶活为100%，其余酶活为与其比值，得到结果如图7所示. 游离酶活力在pH为6.0时最高，固定化酶的活力在pH为7.5时最高，相比游离酶提高了1.5. 当底物溶液pH低于6.0，游离酶和固定酶的活力均随着pH的增大而增大，当底物溶液pH在6.0到7.5之间时，游离酶的活力开始下降，固定酶的活力继续上升，在底物溶液pH大于7.5后，无论是游离酶还是固定酶活力均下降，但固定化酶的活力明显高于游离酶，原因可能是磁性壳聚糖表面含有大量羟基，脂肪酶在被固定到载体的过程中，酶分子的构象和酶分子活性中心一些官能团的离子状态发生改变，载体上过量的负电荷影响了酶活性中心和水质子化的相互作用，增加了脂肪酶对碱性溶液的耐受性.2.2.3 固定化酶热稳定性分别制备磁性壳聚糖载体固定化酶将其和对应的游离酶置于60 ℃恒温水浴锅中保温不同时间，定时取样测量酶活，以同组最高酶活为100%，其余酶活为与其比值，绘制酶的热稳定曲线. 从图8可以看出游离酶和固定酶活力均呈现下降趋势，游离酶的相对活力比固定化酶下降速度更快，趋势更明显. 图8中游离酶在60 ℃保温120 min时游离酶活力剩余14.8%，而固定化酶活力是42%. 在相同温度保温相同时间后，固定化酶活力明显高于游离酶，表现出更强的温度耐受性. 原因可能是脂肪酶被固定到载体的过程中，酶分子之间，酶与载体之间通过共价键、分子间作用力等相互作用，增强固定化酶分子的结构刚性，提高其耐高温的能力，而游离酶缺乏这些相互作用力，容易在高温条件下酶分子结构改变而变性[20].2.2.4 固定化酶抗变性尿素是一种常用的蛋白质变性剂，蛋白质分子中的肽链以一定的方式盘绕曲折，形成特定的构象. 而这种构象的维持，主要依赖于蛋白质分子中的氢键. 高浓度尿素能破坏氢键，导致蛋白质分子结构松弛，从而使蛋白质发生不同程度的变性. 图9的实验说明：游离酶和固定酶活力均随着尿素浓度的增加而降低，游离酶的相对活力比固定化酶下降速度更快，在相同尿素浓度时，固定化酶的活力始终明显高于游离酶. 图中游离酶在尿素浓度为5 mol/L时，酶活力剩余24.8%，而固定化酶活力性是62%；固定化酶活力高于游离酶，表现出更强的对尿素这种变性剂的耐受性，原因可能是脂肪酶被固定到载体后，酶分子与载体相互作用，形成了保护酶分子的微环境，减弱了尿素溶液对酶蛋白的氢键和疏水残基的破坏，进而减轻了酶分子的构象变化.2.2.5 固定化酶重复使用性分别称取1 g磁性壳聚糖载体固定化酶在相同情况下连续反应10次，测定其活力，得到图10所示结果. 随着使用次数增加，固定化酶的活力缓慢下降，在连续使用10次后，磁性壳聚糖载体固定化酶的活力剩余66%，说明固定化酶有良好的重复使用性.2.2.6 固定化酶动力学分析图11显示了固定化酶和对应的游离酶的Lineweaver-Burk曲线. 通过计算可以得知(a)中磁性壳聚糖载体固定化酶的Km为2.41 μmol/L，对应游离酶的Km为0.31 μmol/L固定化酶对底物的亲和力降低. 出现这种结果的原因可能是载体材料对底物的扩散有一定得限制作用，同时脂肪酶被固定化后，载体材料与酶分子的活性位点间有空间位阻，降低了酶与底物的结合能力.摸索出一种新的制备磁性壳聚糖微球的方法，该方法工艺相对简单；采用的原料壳聚糖来源广、价格低廉、没有毒副作用，降低了工业成本，对环境无污染. 这些优点使该制备方法可用于磁性壳聚糖微球工业化大规模生产. 制备的磁性壳聚糖微球中壳聚糖包裹在磁性粒子表面，有良好的磁响应性. 经固定化后，脂肪酶的热稳定性、抗变性剂尿素的能力和重复使用性均得到显著提高，对底物的亲合力出现一定程度的降低. 使用磁性壳聚糖材料固定化脂肪酶，克服了游离酶分离回收难的缺点，提高了酶的使用效率，为固定化酶进一步工业应用打下良好的基础.【相关文献】[1] WEI T, FENG S X, MAO D B, et al. 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2012年第31卷第2期CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS ·345·化工进展磁性壳聚糖微球的研究进展宋艳艳1，2，孔维宝1，宋昊1，华绍烽1，夏春谷1（1中国科学院兰州化学物理研究所，羰基合成与选择氧化国家重点实验室，甘肃兰州 730000；2中国科学院研究生院，北京 100049）摘要：磁性氧化铁纳米粒子（Fe3O4，γ-Fe2O3等）因具有尺寸小、超顺磁性和低毒性等特点，已经引起了生物化工、医药工业研究领域的广泛关注。

磁性壳聚糖微球具有表面非常光滑的球形结构。

近年来，已经制备出了平均粒径在 10～2.5×105 nm 之间的磁性壳聚糖微球，并在生物医药、食品工程和污水处理等许多领域已经取得了初步的应用，特别是在污水处理和酶固定化领域。

本文综述了近年来磁性氧化铁纳米粒子和磁性壳聚糖微球的制备方法、磁性壳聚糖微球的改性方法及应用的最新研究成果。

关键词：磁性壳聚糖微球；固定化；四氧化三铁；纳米材料中图分类号：O 642.5；TB 332 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2012）02–0345–10Reseach progress in magnetic chitosan microspheresSONG Yanyan1，2，KONG Weibao1，SONG Hao1，HUA Shaofeng1，XIA Chungu1（1State Key Laboratory for Oxo Synthesis and Selective Oxidation，Lanzhou Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，Gansu，China；2Graduate University of Chinese Academy ofSciences，Beijing 100049，China）Abstract：Magnetic iron oxide（Fe3O4，γ-Fe2O3 etc.） nanoparticles have attracted researchers in various fields such as biochemical engineering and medicine industrical due to their small size，superparamagnetism and low toxicity. Magnetic chitosan microspheres are in sphere shape with a rather smooth surface. In recent years，magnetic chitosan microspheres were prepared with a mean size range of 10 nm to 2.5×105 nm. Magnetic chitosan microspheres have been preliminarily applied in various fields，including biomedicine，food engineering and wastewater treatment，etc，especially in the fields of wastewater treatment and enzyme immobilization. The preparation methods of magnetic iron oxide nanoparticles and magnetic chitosan microspheres，the recent achievements including modification methods and applications of magnetic chitosan microspheres，are reviewed in this paper.Key words：magnetic chitosan microspheres；immobilization；Fe3O4；nano-material近年来，磁性氧化铁纳米粒子由于具有粒径小、超顺磁性、低毒性等优良特性，已经被广泛地应用于生物学和医学研究，例如，对蛋白质和酶的固定化、生物分离、免疫分析、药物载体及磁共振成像[1]。

壳聚糖固定化酶的研究与应用摘要：介绍壳聚糖作为固定化酶载体的3种主要情况：壳聚糖直接作为固定化酶载体；壳聚糖衍生物作为固定化酶载体；壳聚糖与其他物质共同作为固定化酶载体。

壳聚糖及其衍生物等固定化酶具有酶活性高、回收率高和耐贮藏等特点。

指出壳聚糖及其衍生物在固定化酶技术领域有着广阔的应用前景。

关键词：壳聚糖；衍生物；固定化酶壳聚糖是甲壳素(chitin)脱乙酰基的产物，是由大部分2-氨基一2一脱氧一β—D-葡萄糖单元和少量N．乙酰-2一氨基-2一脱氧一β一D一葡萄糖单元以β一1，4糖苷键连接的二元线性共聚物，相对分子质量通常在几十万到上百万左右。

壳聚糖学名聚氨基葡萄糖，是一种生物相容性好、易生物降解、无毒、易得的天然功能高分子生物材料，易于制成粉、膜、多孔微珠、纤维、凝胶、纳米粒子等多种形态。

作为唯一一种碱性多糖，壳聚糖在固定化酶并保持其活性方面有独特的优点。

1 壳聚糖直接作为固定化酶载体。

壳聚糖本身是一种多孔网状天然高分子粉粒材料，耐热性好，其分子中的羟基和氨基可形成活泼界面，对蛋白质有显著的亲合力，可将酶吸附通过离子键、氢键及范德华力而与载体结合。

John等将壳聚糖研磨成粉状，与粉状胰蛋白酶混合研磨，通过吸附作用周定胰蛋白酶，结果表明：研磨时间越长，固定化效果越好。

李志国等以壳聚糖为载体，用物理吸附固定化脂肪酶，对影响固定化过程的各种因素进行考察，确定最优条件，结果表明：固定化酶的可操作性优于游离酶。

以壳聚糖为载体通过吸附制备固定化酶，酶不易失活，但酶与载体之间的结合力弱，在使用过程中酶分子易从载体上脱落，因此，多数情况下用吸附一交联法以提高其稳定性。

最常用的交联剂是甲醛和戊二醛，但更多采用戊二醛。

周纪宁采用甲醛活化交联壳聚糖固定L-天冬酰胺酶，其活力回收可达20％一25％。

岳振峰等将粉末状壳聚糖制备成微球形多孔载体，采用吸附——交联的方法进行固定化，在最佳固定化条件下，酶活力回收率为78．1％，具有较好的强度。