脂肪干细胞操作流程 Medivet-china.

脂肪干细胞制备
1、准备手术器械，进行严格消毒处理。

2、在手术过程中，医生将通过局部麻醉药对抽脂部位进行麻醉。

3、使用注射器将肿胀液（含有局麻药和生理盐水的混合物）注射
到脂肪层中。

4、使用吸引器将脂肪组织吸取出来，并将其收集在一个容器中。

5、对收集到的脂肪组织进行过滤和清洗，以去除其中的血液、肿
胀液和杂质。

6、将处理后的脂肪组织中的单个细胞分离出来，并将其培养在特
定的培养基中。

7、在培养基中添加一些生长因子和营养物质，以促进脂肪干细胞
的增殖和分化。

8、培养过程中需要进行多次换液和清洗，以确保细胞的健康生长。

9、在培养过程中，脂肪干细胞将逐渐增殖并分化成不同类型的细
胞，如成纤维细胞、内皮细胞和神经细胞等。

10、最后，将培养好的脂肪干细胞进行冷冻保存，以备后续使用。

一、脂肪干细胞‎（ASCs）的提取及鉴‎定1、实验技术及‎原理：运用细胞培‎养技术、流式细胞术‎（体外扩增后‎A C Ss的‎表型会发生‎改变，主要体现在‎细胞表面蛋‎白和细胞因‎子表达的变‎化），差异离心术‎（可将基质血‎管细胞沉淀‎与悬浮的成‎熟脂肪细胞‎分离，沉淀中除A‎S Cs，还包括血细‎胞、成纤维细胞‎和内皮细胞‎，基质血管细‎胞沉淀可以‎接种到孰料‎培养瓶中，基质细胞可‎贴壁，造血和其他‎杂质细胞不‎贴壁，在随后的传‎代过程中被‎出去，最终得到的‎ASCs可‎再很长时间‎内保持摸分‎化状态）。

取C57B‎L／6 WT小鼠2‎只，常规麻醉消‎毒，取腹股沟脂‎肪组织剪碎‎至糊状，PBS液冲‎洗去麻药及‎血液，0.075%II型胶原‎酶消化（37℃，30分钟）以去除外基‎质，生理盐水终‎止胶原酶的‎消化，离心（1200g‎,10分钟），去上清液及‎未消化的脂‎肪，10%FBS的D‎M EM重悬‎细胞沉淀，0.16mol‎/L氯化氨溶‎解剩余红细‎胞，离心洗涤，过200目‎铜网，得到单个核‎细胞。

镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在‎培养瓶中，37℃5%CO2孵箱‎培养，24小时后‎第一次换液‎，以后3天换‎液一次，80%融合后0.25% Tryps‎i n,0.02%EDTA消‎化传代。

细胞镜下作‎形态学观察‎及取第三代‎细胞用流式‎细胞仪作细‎胞周期及细‎胞免疫表型‎（C D29/CD44）的鉴定。

2、实验用品：2.1 材料：C57BL‎／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原‎酶消化，10%FBS，低糖DME‎M2.3 仪器设备：超净工作台‎、恒温培养箱‎、普通显微镜‎、倒置显微镜‎、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟‎镊）、小烧杯，200目铜‎网过滤器，低糖DME‎M、血球计数板‎、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的‎方法与步骤‎：3.1无菌操作‎的要领和要‎求。

干细胞论坛脂肪干细胞培养吸脂术时用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织20 mL. 在1 h内将其移至离心管内，加入等量PBS缓冲液，充分振荡后低速离心800 r/min×10 min. 反复冲洗3次后加入等量15 g/L I型胶原酶. 37℃水浴中充分振荡30 min，再加入等量胎牛血清（FBS）中止. 低速离心10 min后弃去上清. 将下层细胞用PBS悬浮后加入16 mmol/L NH4Cl 37℃水浴中10 min以裂解红细胞. 低速离心10 min后再用PBS冲洗3次. 最后将细胞用含100 mL/L FBS+10 g/L青霉素的DMEM悬浮后移入培养瓶中，37℃，50 mL/L CO2培养箱中孵育，48 h后首次换液，弃去悬浮细胞. 随后每3 d换液，1 wk后传代. 将第3代细胞用于流式细胞仪检测. 浓集细胞到109/L后进行流式细胞仪检测. 细胞传至第3代时将其以2×107/L 的细胞数分别转入各定向培养基中进行培养. 诱导培养2 wk后，对成脂诱导组进行油红Ｏ脂肪颗粒染色，另外：现在脂肪干细胞缺乏特异的表面标志鉴定，各类文献提到脂肪干细胞表达阳性的标志物有：cd13，cd29，cd59，cd49e，cd73，cd90，HLA-ABC等。

但表达阳性不代表具有特异性，所以要从标志物上鉴定脂肪干细胞还是很困难的，应该说不具有很强的说服能力。

按文献所说的步骤来提取脂肪干细胞，形态类似干细胞，并且具有多向分化的能力，这就足以说明提取的细胞是干细胞。

你要是想证明你养的就是干细胞，最好的办法我认为还是做个多向诱导分化。

干细胞传代吸出来以后，常速离心，用pbs洗两遍后，accutase管内消化5-10min，加入基础培养基离心洗去消化液，分瓶传代。

人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定[摘要]目的: 进行人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定, 为组织工程的进一步研究提供实验依据。

方法: 将剪碎的人脂肪组织加入Ⅰ型胶原酶消化, 离心。

干细胞流程及注意事项说明干细胞流程及注意事项说明引言：干细胞是一种具有自我更新和分化成各种细胞类型的特殊细胞。

它们在医学和生物科学研究中具有巨大的潜力。

干细胞疗法被视为未来医学的重要突破，可以用于治疗多种疾病和损伤。

然而，干细胞研究和应用过程中需要遵循一定的流程和注意事项，以确保安全和有效性。

本文将深入探讨干细胞的流程，并提供相关注意事项的说明。

一、干细胞获取流程1. 采集来源干细胞可以从多种来源获得，包括胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞。

每种来源有其特定的流程和技术要求。

2. 胚胎干细胞的获取胚胎干细胞主要来自胚胎发育的早期阶段。

在获得胚胎干细胞时，需要注意以下事项：- 获得捐赠的胚胎，并经过捐赠者的知情同意和伦理审查。

- 将胚胎培养到适当的发育阶段。

- 从发育早期的胚胎中分离出内胚层细胞，并将其培养为干细胞系。

3. 成体干细胞的获取成体干细胞存在于成人体内的各种组织和器官中。

获取成体干细胞时，需要注意以下事项：- 通过医疗手段或手术采集组织，如骨髓或脂肪组织。

- 分离组织中的干细胞，并培养其扩增为足够量。

4. 诱导多能干细胞的获取诱导多能干细胞是通过重新编程成体细胞而获得的多能干细胞。

获取诱导多能干细胞时，需要注意以下事项：- 获得捐赠者的细胞样本，如皮肤细胞。

- 将细胞样本重新编程，使其转变为诱导多能干细胞。

二、干细胞应用流程1. 干细胞培养和扩增在应用干细胞前，需要将其培养和扩增到足够数量。

这一过程涉及到培养基的选择、培养条件的优化和细胞生长的监测。

2. 干细胞分化干细胞可以分化为多种不同的细胞类型，如神经细胞、心肌细胞等。

控制干细胞的分化过程需要考虑以下因素：- 合适的生长因子和信号分子的添加。

- 适当的培养条件，如温度、养分和氧气浓度。

- 分化过程的监测和控制。

3. 干细胞移植当干细胞已经分化成特定的细胞类型后，可以将其移植到患者体内进行治疗。

移植过程需要注意以下事项：- 医学团队的专业知识和技术要求。

脂肪干细胞的提取及鉴定一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定1、实验技术及原理:运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。

取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。

?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。

细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。

2、实验用品:2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤:3.1无菌操作的要领和要求。

3.2细胞原代培养:3.2.1操作步骤a(培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。

b. 取材:取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。

大鼠脂肪干细胞的分离培养1.试剂配制1.1双抗培养基的配制用100万单位链霉素溶解在10ml去离子水中，抽出0.8ml以及用80万单位的青霉素溶解在8ml的去离子水中，抽出0.5ml，分别加入DM EM培养基中，即配成100U/m1青霉素，100U/m1链霉素双抗培养基。

1.2成骨诱导剂的配制地塞米松259溶解于100ml去离子水中，抽出10ul;10gβ一甘油磷酸钠溶解于6ml去离子水中，抽出lml;25g抗坏血酸溶解于100ml去离子水中，抽出100ul，分别加入100ml的培养基中，既配成了含1nmol/L 地塞米松，50ug/m1抗坏血酸，10mmol/Lβ一甘油磷酸钠的成骨诱导剂。

1.3 DMEM培养基的配制取一瓶DM EM溶解于1000ml去离子水中，搅拌均匀后，用7%NAHC03调节其PH值为7.2-7.4。

用滤器过滤，分装在100ml的清洁无菌生理盐水瓶中置4℃冰箱中。

1.4含10%胎牛血清的DM EM完全培养基的配制取10ml胎牛血清溶解于90mLDM EM培养基中，即可配成含10%胎牛血清的DM EM培养基，装在100ml的生理盐水瓶中置4℃冰箱中。

1.5 0.25%胰蛋白酶的配制用精确的天平称250mg胰蛋白酶，并溶解于100ml培养基中，即浓度为0.25%。

用7%NaHC03调节其PH值为7.2-7.4。

用滤器过滤后，分装在100ml的清洁无菌生理盐水瓶中置4℃冰箱中。

1.6 Ⅰ型胶原多克隆抗体配制I型胶原多克隆抗体用去离子水配成1:100工作浓度，置4℃冰箱中备用。

1.7 二氮联苯胺(diminob ℃nzidin ℃DAB)显色剂的配制分别取lml试剂A，50ul试剂B，50ul试剂按A到C加入，即配成lmLDAB显色剂。

在配制成30min内用于免疫细胞化学染色。

1.8 地塞米松(DXM)液的配制地塞米松25g溶解于100ml去离子水中，抽出10ul。

既配成了含1nmol/L地塞米松，使用时根据需要配制成不同浓度。

一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。

取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。

镜下计数，孵箱培养，24小时后第一次换液，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。

细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。

2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。

3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。

b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。

脂肪干细胞是一种多能干细胞，存在于脂肪组织中，具有较强的自我更新和分化能力，因此在再生医学领域具有广阔的应用前景。

脂肪干细胞的培养方法是进行研究和应用的基础，其中组织块培养法是一种常用的培养方法，其流程和步骤需要严谨操作和控制，以获得高质量的脂肪干细胞。

一、脂肪组织的获得脂肪干细胞的来源是脂肪组织，脂肪组织的获得需要经过以下步骤：1. 临床患者手术采集：通过手术方式从患者身体的特定位置（如腹部、臀部等）采集脂肪组织。

2. 动物实验材料采集：通过特定的实验动物模型，在实验室条件下从动物体内获取脂肪组织。

脂肪组织的来源直接关系到后续脂肪干细胞的培养和应用性能，因此需要严格控制采集过程和条件，确保获得的脂肪组织质量和干细胞丰度。

二、脂肪组织处理和组织块制备1. 脂肪组织的去除杂质：将采集的脂肪组织在无菌条件下进行处理，去除多余的结缔组织、血管和表皮层，以获得纯净的脂肪组织。

2. 组织块的制备：将经过处理的脂肪组织切割成适当大小的块状（约1mm³），以便后续细胞的释放和培养。

三、脂肪干细胞的释放和培养1. 组织块的酶解：将制备好的组织块放入消化酶（如胰蛋白酶）的消化液中，在37℃的恒温培养箱内进行酶解，使脂肪干细胞从组织块中释放出来。

2. 细胞的培养和传代：将释放出的脂肪干细胞进行原代培养和传代培养，培养基的配方和培养条件需要进行严格控制和优化，以保证脂肪干细胞的生长和分化。

通过以上步骤和方法，我们可以获得高质量的脂肪干细胞，为其后续在再生医学、组织工程和临床治疗中的应用打下坚实基础。

在实际应用中，还需要结合特定的研究和临床需求，对脂肪干细胞进行进一步的分化和功能评价，以实现其在不同领域的应用和开发。

脂肪干细胞的培养方法对于再生医学和组织工程具有重要意义，通过持续的研究和优化，必将为人类健康事业带来更多的机遇和挑战。

希望本文对脂肪干细胞组织块培养方法的介绍，能够为相关研究和应用人员提供一定的参考和指导，共同推动脂肪干细胞领域的进步与发展。

人来源脂肪干细胞的培养1．脂肪干细胞原代培养1)取约500mg脂肪组织（自外科手术患者的皮下获取），再将脂肪组织一次挤压进入准备好的15ml离心管中，每个离心管中的组织不超过5ml。

2)吸取缓冲液PBS 7ml加入到上述装有组织的离心管中，用吸管吹打10~20次，然后静置1min左右，用吸管将组织下层的液体吸出。

如此反复直到所吸出的液体呈透明状，不带有血细胞为止；3)向有脂肪组织的试管中加入与组织量相同大约5ml左右的消化液（胰酶0.25%，I型胶原酶0.1%，以1：1比例混合配制而成），将试管密封，放入37°C恒温摇床中，190r/min，震荡消化30min。

此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体；4)吸出离心管中的下层液体移入含完全培养基（含10%胎牛血清的高糖DMEM）的新离心管中终止消化，然后将离心管封闭，1500rpm离心10min；5)用吸管吸取上清后去掉，加入1ml 培养基，轻轻吹打10~20次制成细胞悬液，将各个离心管中的细胞悬液收集起来，接种待用；6)在剩余脂肪中加入新的胰酶和胶原酶，重复以上步骤继续消化，重复2-3次，将收集到的有核细胞按照一定的密度接种到培养瓶中，放入37°C、5% CO2培养箱培养；7)第一次换液：大约12-24小时后，观察细胞贴壁即可进行第一次换液，此后每隔3天换液，待细胞生长至融合后进行传代。

2. 脂肪干细胞传代培养1)在超净工作台内吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗2-3次，之后加入1-2mL消化液（0.25%胰酶和0.04% EDTA(v/v 1:1)）；2)培养箱内进行消化（3-5min），倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁的脂肪干细胞胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时，加入等体积的培养基终止消化；3)用吸管反复有序轻轻吹打瓶壁上的细胞（动作要轻柔，注意不要产生气泡），使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液；4)将单细胞悬液移至离心管中，离心，(1000rpm,5min)，弃上清，加入完全培养基，轻吹使之松散，按1:2传代培养；5)显微镜下逐日观察传代培养的细胞，待贴壁细胞达到90% 以上融合时，再进行传代，如此反复。

SD大鼠脂肪干细胞原代培养实验步骤材料准备：3-5只10-15日龄新生SD大鼠（刚刚开始长白毛）灭菌器械（镊子、眼科直剪、眼科弯剪、磁珠）5mL注射器，0.22μm滤器泡沫板、图钉（固定大鼠用）75%乙醇预冷的无菌PBS水，装在两个培养皿内15mL和50mL无菌离心管细胞筛无菌培养瓶培养基（F12+10%FBS+1%双抗）1．提前将所需物品全部放入超净工作台，紫外消毒30min。

2．配制0.1%Ⅰ型胶原酶约5mL，称取0.005gⅠ型胶原酶，溶解到5mL 超纯水里，混匀。

在超净工作台内，用0.22μm的滤器过滤除菌。

3．大鼠脱颈处死后放入75%酒精浸泡5-10min，放入超净工作台，将大鼠固定在泡沫板上。

4．依次剪开大鼠腹股沟区皮肤直至腹腔，暴露脂肪组织。

更换新的剪刀镊子，将脂肪组织取出放至PBS中，注意不要剪到血管。

5．P BS涮洗一遍后，仔细剔除脂肪组织上多余的血管和淋巴结，再用PBS涮洗一遍。

用新的镊子将脂肪组织夹到50mL离心管口，弯剪反复剪碎（剪10min），剪好后加入2-3倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶和灭菌的磁珠，37℃，温浴，每隔5min震荡一次（磁珠搅拌器）。

注：也可以采用磁珠37℃一直搅拌，这样可以加快消化效果缩短消化时间。

6. 消化完成后将细胞悬液转移至新的15mL离心管中，1200rpm/min离心4min，弃上层脂滴泡沫和上清液，用完全培养基重悬沉淀。

7. 将上一步得到的细胞悬液经细胞筛过滤（可以多加一点用于稀释细胞悬液，过筛的时候轻松一点），1200rpm/min离心4min，弃上清，完全培养基重悬，转入培养瓶，置37℃培养箱培养。

脂肪干细胞原代培养流程
1.将收集到的脂肪组织移入50ml离心管，加入2倍体积的常温PBS用移液管吹打清洗：
清洗完成的指标？
2.1000转/分离心5分钟，是否需要低温？
3.用移液管将下层的液体和沉淀的血污弃掉，保留上层黄色组织，如何操作，为何不吸取
上层黄色组织？
4.吸取2倍体积的常温PBS用移液管吹打清洗
5.1000转/分离心5分钟
6.用移液管将下层的液体和沉淀的血污弃掉，保留上层黄色组织
7.吸取2倍体积的常温PBS用移液管吹打清洗
8.……反复重复以上操作3-4次，直至下层液体呈不浑浊，底部无血污（还是弃掉？），
保留上层组织
9.将组织用移液管移入无菌培养皿中，用剪刀将大块组织剪碎，将组织用吸管移入50ml
离心，加入与组织等体积的胶原酶（625U/ml）混匀后放入37℃孵箱，消化2h。

10.消化完将最上层颜色较深的油脂弃掉，注意保留组织，取与消化液等量终止液
（DMEM+10%NBS）终止消化，用弯头吸管吹打混匀数次，过100目筛网，收集滤液于离心管，1000转/分钟，离心5分钟。

11.弃上清，用培养液（α-MEM+10%NBS）重悬，根据沉淀多少接入培养瓶中（个人估计约
3E6/瓶），每瓶总液量8ml。

12.放入孵箱，24h天镜检，72或96h换液，之后隔天换液，培养12-14d传代。