下载文档原格式
1.T-DNA插入突变体的鉴定T-DNA插入突变体从拟南芥资源中心（Ohio State University，Columbus）索要。
种子被播种在含有卡那霉素（Kan＋）的MS筛选培养基上，待萌发后10天左右，把生长正常的幼苗移置营养土中。
然后取10天后的叶片提取DNA，PCR进一步鉴定。
其原理如下图所示（图5-1）：LP，RP分别为基因的左边界和右边界，LB为T-DNA上的序列。
用三条引物进行PCR扩增，结果如右图所示。
用LP和RP扩不出条带，而用RP和LB能扩出条带的为突变体纯合株。
图5-1 突变体鉴定原理图纯合体鉴定的原理及方法图1：T-DNA插入的位置图2：纯合体鉴定所示条带By using the three primers (LBb1.3+LP+RP) for SALK lines, users for WT (Wild Type - no insertion)should get a product of about 900-1100 bps ( from LP to RP ), for HM (Homozygous lines - insertions in both chromosomes) will get a band of 410+N bps ( from RP to insertion site 300+N bases, plus 110 bases from LBb1.3 to the left border of the vector), and for HZ (Heterozygous lines - one of the pair chromosomes with insertion) will get both bands. The product size should be 200 base larger if using LBa1 instead of LBb1.3. However, the protocol requires the same or similiar TM values for all the LB, LP and RP primers.纯合体鉴定共需两次才能判定是否是真正的纯合体。
T-DNA插入突变体的鉴定时明辉同组者：薛敏学号：201000220069摘要 Ti质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。
通过本实验，我们将学习如何用PCR的方法检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。
1.引言T-DNA作为一种实验常用的遗传转化方法，在插入突变过程中，插入到植物染色体上的位置是随机的。
如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA 插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确定样品是否为T-DNA插入突变纯和体。
PCR（Polymerase ChainReaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。
（PCR基本原理如右图）DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。
自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。
遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。
T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。
野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。
所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。
因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。
在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。
T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。
在本实验中使用三引物法。
三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。
图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。
能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。
本实验使用CATB抽提DNA。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。
它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。
姓名系年级学号日期科目遗传学实验题目模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定模式植物拟南芥Ｔ-ＤNA插入突变体的鉴定摘要：农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中,有T-DＮＡ插入的纯合突变体,杂合突变体，和野生型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体。
本次实验意在对模式植物拟南芥Ｔ－DNA插入突变体进行鉴定。
实验中用到的主要实验方法有:CTAB法提取拟南芥基因组DＮＡ、PCR扩增目的基因片段、琼脂糖凝胶电泳分离核酸。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程。
ＰCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。
每完成一个循环需２~4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。
ＤＮA经EB染色,ＥＢ可与核酸结合,在紫外光激发下产生荧光。
现广泛应用于核酸的研究中。
引言Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒,该质粒上有一段特殊的ＤNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞,并插入植物染色体DNA 中。
所以Ｔｉ质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
将Tｉ质粒进行改造,将感兴趣的基因放进T-ＤNＡ区段中,通过农杆菌侵染植物细胞,实现外源基因对植物的遗传转化。
T－DＮA插入基因内部导致基因突变:T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。
如果T-DNＡ插入进某个功能基因的内部,特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
这使农杆菌Ｔi 质粒转化系统的应用范围受到了一定的限制。
反向遗传学研究的首要条件是获得基因敲出突变体，建立可靠、有效、方便的T-DＮA插入突变体的鉴定方法。
拟南芥T-DNA基因插入突变鉴定摘要利用T-DNA插入拟南芥基因引起突变，获得突变植株，提取16号植株细胞DNA，利用三引物法进行PCR扩增，检测得16号植株细胞内原基因与插入突变基因同时存在，为杂合突变体。
引言反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。
经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。
与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。
T-DNA插入突变技术T-DNA插入突变技术是反向遗传学的重要手段之一。
T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。
T-DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。
单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。
由于插入的T-DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。
还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。
由此可见，T-DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。
植物材料——拟南芥拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于该植物具有以下特点：(1)植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；(2)生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右；(3)自花授粉，有助于遗传试验的人工控制；(4)种子多，每株每代可产生数千粒种子；(5)形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；(6)基因组小，只有5对染色体。
