为获得高纯度淋巴细胞，必须进一步清除PBMC悬液中其他血细胞。
（一）去除红细胞：一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。低渗裂解法是加1ml蒸馏水于沉淀的PBMC中，不超过1min，红细胞即快速裂解，立即加入等量的1.8%氯化钠溶液恢复为等渗状态，经洗涤即可去除红细胞。氯化铵处理法是在沉淀的PBMC中加入1ml 0.83%氯化铵溶液，轻轻振摇2min，即可裂解红细胞，经洗涤即可去除红细胞。
红细胞裂解液的制备：碳酸氢钾（KHCO3）1.0g；氯化氨（NH4Cl）8.3g；EDTA-Na2 0.037g，加双蒸水至1000ml，即工作液。
（二）去除血小板：通过离心洗涤，即可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清（FCS）梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。[将PBMC悬液洗涤2~3次后，常可去除绝大部分混杂的血小板。某些疾病状态下，外周血中血小板数量增多，常需通过胎牛血清（FCS）梯度离心才能去除过多的血小板，因FCS可让单个核细胞通过而阻止血小板通过。]
Place 3 ml FCS in a 15-ml centrifuge tube and carefully overlay with PBMC.
Centrifuge 15 min in a GH-3.7 rotor at 800 rpm (200 g), 18℃ to 20℃. Discard
supernatant, which contains platelets. Resuspend pellet in HBSS/FCS at 2-5×107 cells
per 1 to 2 ml. [Fetal calf serum (FCS; heat-inactivated 1 hr, 56℃)]
（三）去除单核细胞和粒细胞：
单核细胞的去除：①粘附去除法：单核细胞能粘附在塑料或玻璃的表面，而淋巴细胞则不能，由此可将单核细胞从PBMC悬液中分离出来。②L-亮氨酸甲酯去除法：单核细胞内富含溶酶体酶，而L-亮氨酸甲酯能被单核细胞摄入后聚集于溶酶体中，在溶酶体的作用下转化为L-亮氨酸-L-亮氨酸甲酯，此物对细胞有毒性作用，由此可溶解并去除单核细胞。此外本法还可清除NK细胞及细胞毒性T细胞，而B细胞及绝大多数T细胞因缺少溶酶体酶，因而不受影响。这种方法只适用于分离新鲜细胞，冻存细胞因代谢L-亮氨酸甲酯的能力很弱而不易分离。③羰基铁吞噬离心法：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞比重增大，再经Ficoll-Hypaque密度梯度离心，则单核细胞将沉于管底而被去除。实验时可先将抗凝血与一定量的羰基铁粉混合，在37℃下搅拌15min，亦可将已分离的PBMC悬液与羰基铁粉混合，然后再进行离心分离。此外，用针对单核细胞表面特殊标志的特异性抗体，通过间接免疫吸附法或免疫磁性微珠法亦可去除PBMC悬液中的单核细胞，且可对单核细胞进行回收利用。
精心整理
免疫功能（淋巴细胞亚群）检测的临床意义
外周血淋巴细胞根据生物学功能和细胞表面抗原表达分为3个群：T淋巴细胞（CD3+）、B淋巴细胞（CD19+）和NK淋巴细胞【自然杀伤细胞（naturalkiller)，CD3-CD16+和/或CD56+】。T细胞又分为辅助T细胞（CD3+CD4+）和抑制T细胞（CD3+CD8+)。淋巴细胞亚群分析是检测细胞免疫和体液免疫功能的重要指标，它总体反应机体当前的免疫免疫功能、状态和平衡水平，并可以辅助诊断某些疾病，如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等，分析发病机制，观察疗效及检测预后有重要意义。T淋巴细胞百分率或计数绝对值可用于区别和监测某些免疫缺陷病和自身免疫性疾病。辅助T淋巴细胞减少：见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷病、艾滋病、应用免疫抑制患者。抑制T淋巴细胞增多：见于自身免疫性疾病，如SLE、艾滋病初期、慢性活动性肝炎、肿瘤及病毒感染等。抑制T细胞百分率在一些免疫性疾病表现出超出正常参考范围，在许多先天性或获得性免疫缺陷病人中升高（如重症综合性免疫缺陷SCID,AIDS）。CD4+/CD8+>2.5表明细胞免疫功能处于“过度活跃”状态，容易出现自身免疫反应，见于类风湿性关节炎、I型糖尿病等。CD4+/CD8+在肿瘤病人外周血中T淋巴细胞亚群数值都有异常，其特征是患者体内CD3+细胞、CD4+细胞明显减少，而CD8+细胞明显增加，CD4+/CD8+比值显着降低，说明肿瘤患者的细胞免疫功能处于免疫抑制状态，患者对识别和杀伤突变细胞的能力下降，形成了肿瘤的生长转移。骨髓造血细胞的增殖和分化障碍也与T细胞亚群异常有关。如在再生障碍性贫血与粒细胞减少症中，患者的外周血CD4+细胞数减少，CD8+细胞数增精心整理
多，CD4+/CD8+比值明显下降。NK细胞介导某些肿瘤和病毒感染细胞的细胞毒性反应。B淋巴细胞为体液免疫的重要指标。
检测CD4+T淋巴细胞数的标准方法是流式细胞术。流式细胞术(flow cytometry，FCM)是目前公认的测定淋巴细胞百分比和CD4+T淋巴细胞绝对数目的金标准。它是一种对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。流式细胞仪是集合了激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。随着相关技术的迅速发展，流式细胞仪成为日益完善的细胞分析和分选的工具。几乎临床医学各学科都涉及流式细胞分析技术的应用，它已成为推动临床医学发展的重要手段之一。
人们发现HIV病毒感染者由于CD4+T淋巴细胞的减少而逐渐发展成为获得性免疫功能缺陷症(AIDS)后，流式细胞术由一种研究性的工具迅速发展成为常规临床诊断不可或缺的技术。在HIV感染者疾病进程观察、抗HIV病毒治疗时机的确定及抗病毒药物疗效的监测中，CD4+T淋巴细胞百分比及绝对数目的变化对临床均有重要的意义。
为提高对艾滋病等疾病的诊断和治疗效果，改善艾滋病患者特别是农村患者的生存质量，中国已先后从美国BD公司进口了110台流式细胞仪，目前已配备到全国25个省的疾控中心和医院，专门用于艾滋病患者CD4+T淋巴细胞计数。目前国内三级以上医院的临床实验室绝大多数已开展了流式细胞分析工作。
淋巴细胞各亚群百分比的测定
影响CD4+T淋巴细胞计数的因素有季节、昼夜差、某些并发症和皮质醇类药物等，而性别、成人年龄、紧张、生理性应激和妊娠对CD4细胞数虽有影响，但影响不大。由于CD4+T淋巴细胞百分数受变异影响较绝对计数小，故CD4+T淋巴细胞百分率有时比绝对数对临床更有意义。随着荧光素种类的丰富，可以同时对样本的多种淋巴细胞亚群和亚类进行测定(表10．4)。
1．实验原理
利用荧光技术，在不同的鼠抗人的抗体上标上荧光素，此荧光抗体就同人淋巴细胞表面的CD分子特异性地结合，然后用流式细胞仪检测，结合分析软件的自动分析即可得出各亚群细胞的百分比。
免疫功能淋巴细胞亚群检测的临床意义修订版
IBMT standardization office【IBMT5AB-IBMT08-IBMT2C-ZZT18】 免疫功能（淋巴细胞亚群）检测的临床意义
外周血淋巴细胞根据生物学功能和细胞表面抗原表达分为3个群：T淋巴细胞（CD3+）、B淋巴细胞（CD19+）和NK淋巴细胞【自然杀伤细胞（natural killer)，CD3-CD16+和/或CD56+】。T细胞又分为辅助T细胞（CD3+CD4+）和抑制T细胞（CD3+CD8+)。 淋巴细胞亚群分析是检测细胞免疫和体液免疫功能的重要指标，它总体反应机体当前的免疫免疫功能、状态和平衡水平，并可以辅助诊断某些疾病，如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等，分析发病机制，观察疗效及检测预后有重要意义。 T淋巴细胞百分率或计数绝对值可用于区别和监测某些免疫缺陷病和自身免疫性疾病。 辅助T淋巴细胞减少：见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷病、艾滋病、应用免疫抑制患者。 抑制T淋巴细胞增多：见于自身免疫性疾病，如SLE、艾滋病初期、慢性活动性肝炎、肿瘤及病毒感染等。抑制T细胞百分率在一些免疫性疾病表现出超出正常参考范围，在许多先天性或获得性免疫缺陷病人中升高（如重症综合性免疫缺陷SCID,AIDS）。 CD4+/CD8+>2.5表明细胞免疫功能处于“过度活跃”状态，容易出现自身免疫反应，见于类风湿性关节炎、I型糖尿病等。CD4+/CD8+
在肿瘤病人外周血中T淋巴细胞亚群数值都有异常，其特征是患者体内CD3+细胞、CD4+细胞明显减少，而CD8+细胞明显增加，CD4+/CD8+比值显着降低，说明肿瘤患者的细胞免疫功能处于免疫抑制状态，患者对识别和杀伤突变细胞的能力下降，形成了肿瘤的生长转移。骨髓造血细胞的增殖和分化障碍也与T细胞亚群异常有关。如在再生障碍性贫血与粒细胞减少症中，患者的外周血CD4+细胞数减少，CD8+细胞数增多，CD4+/CD8+比值明显下降。 NK细胞介导某些肿瘤和病毒感染细胞的细胞毒性反应。 B淋巴细胞为体液免疫的重要指标。
