一株反硝化细菌的分离鉴定及脱氮能力

土壤中反硝化菌的分离与其反硝化能力的分析研究上海交通大学附属中学高二（9）班姜北辰201209232011-21、绪论2、实验材料及方法3、结果与数据分析4、分析总结与讨论5、参考文献通过对土壤样本进行初筛和复筛，以限制氮源的方法分离出8株具有反硝化能力的微生物，对5株微生物的反硝化能力进行测定，其二周时间硝酸盐降解率最高为100%，最低为66.76%。

对此8株菌株的DNA进行PCR扩增，引物为已知的nirS和nosZ反硝化基因的相应引物，发现有三株菌株含有nosZ基因。

再对此8株菌株中的7株的16S rDNA进行PCR扩增，鉴定菌种。

关键词：反硝化微生物，菌种鉴定，反硝化菌筛选1、绪论：反硝化作用（denitrification）也称脱氮作用。

反硝化细菌在缺氧条件下，还原硝酸盐，释放出分子态氮（N2）或一氧化二氮（N2O）的过程。

大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源，进行无氧呼吸，其生化过程可用下式表示：C6H12O6+12NO3-→6H2O+6CO2+12NO2-+能量CH3COOH+8NO3-→6H2O+10CO2+4N2+8OH-+能量反硝化作用使硝酸盐还原成氮气，从而降低了土壤中氮素营养的含量，对农业生产不利。

农业上常进行中耕松土，使土壤与氧气充分接触以防止反硝化作用。

反硝化作用是氮素循环中不可缺少的环节，可使土壤中因淋溶而流入河流、海洋中的NO3-减少，消除因硝酸积累对生物的毒害作用。

所以我们应尽量发挥其有利的一面，为人类所利用。

反硝化微生物对于硝酸根离子的还原步骤如右图，若要从微生物代谢角度验证菌株是否为反硝化菌最简单有效的方法便是测定nirS和nosZ基因是否存在。

由于N2O和NO都是温室气体，是否含有nosZ基因对于菌种的用途有着实际且重要的意义，即可以使土壤中微生物代谢产生的N2O和NO还原成氮气[1]。

本实验的目的便是通过筛选土壤中的反硝化菌，测定反硝化能力，鉴定其是否含有nirS 和nosZ基因，对此进行综合分析，找出反硝化能力较强的菌株，最终制备纯培养的反硝化菌菌株。

吴丽红，李晓惠，杨　芳，等．１株用于生物强化的高效反硝化菌的筛选鉴定［Ｊ］．江苏农业科学，２０１４，４２（１２）：３７１－３７３．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１４．１２．１２５１株用于生物强化的高效反硝化菌的筛选鉴定吴丽红１，李晓惠１，杨　芳１，王　丹２（１．辽宁科技学院生物医药与化学工程学院，辽宁本溪１１７００２；２．辽宁大学药学院，辽宁沈阳１１００３６） 摘要：从生物脱氮工艺的反硝化段活性污泥中分离到７株反硝化菌，考察了其脱氮能力后优选出代表菌株ＦＨ２，该菌在４００ｍｇ／ＬＮＯ３－－Ｎ浓度下，对ＮＯ－３－Ｎ的去除率为１００％，且脱氮过程中亚硝酸盐基本无积累，表现出了很强的脱氮能力，可作为生物强化法处理高浓度氨氮废水的菌源。

通过对该优势功能菌株进行形态观察、生理生化试验及１６ＳｒＤＮＡ的序列测定和同源性分析，结果表明该菌株为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus ）。

该菌反硝化能力强，且具有芽孢微生物的特点，以该菌做为菌源进行生物强化反硝化脱氮研究有很好的应用前景。

关键词：氨氮废水；反硝化脱氮；生物强化；优势反硝菌；筛选鉴定 中图分类号：Ｘ１７２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１４）１２－０３７１－０３收稿日期：２０１４－０２－２７基金项目：辽宁省教育厅科学技术研究项目（编号：Ｌ２０１１２２５）。

作者简介：吴丽红（１９８０—），女，辽宁阜新人，硕士，讲师，从事污（废）水生物处理研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｕｌｉｈｏｎｇ１９８０＠１６３．ｃｏｍ。

氮、磷是废水中常见的无机营养物，是引起湖泊富营养化的主要因素。

大量含氮废水排入水体不仅引起水体富营养化、造成水体黑臭，而且增加水处理的难度、成本，甚至对人类产生毒害。

含氮废水对环境的影响已引起研究人员的重视［１］。

目前，国内外普遍采用物理法、化学法、生物法处理高浓度氨氮废水，这些方法各有优点，同时也都存在不足［２－４］。

一株异养硝化细菌的鉴定及脱氮性能研究赵彬11，何义亮1，黄珏， Taylor Shauna（上海交通大学环境科学与工程学院，上海，200240）摘 要 从膜生物反应器中分离到一株脱氮性能良好的异养硝化菌株，命名为YL。

分离的菌株为革兰氏染色阴性杆菌。

由VITEK32（全自动微生物生物鉴定和药敏分析仪）生理生化特性鉴定及16S rRNA 测序后确定为Providencia rettgeri，并分析了其在系统发育中的分类地位。

该菌在完全好氧的条件下可高效地将NH4+-N去除，并产生N2。

在NH4+-N浓度为80mg/l的培养基中，总氮的去除率高达97.9%，初步表明菌株YL脱氮作用是同时异养硝化好氧反硝化的结果。

关键词 生物脱氮；异养硝化菌；16S rRNA 测序；系统发育；Providencia rettgeriIdentification and Characterization of a Heterotrophic NitrifierCapable of Nitrogen RemovalZhao Bin, He Yiliang ,Huang Jue, Taylor Shauna(School of Environmental Science and Engineering, Shanghai Jiao Tong University)Abstract A heterotrophic nitrifier named YL was isolated from a Membrane Bioreactor shows surprising ability of nitrogen removal in aerobic conditions. YL is gram-negative and short-rod shaped. With the aid of physiology-biochemical test by VITEK32 and sequence analysis of the 16S rRNA, it was proved to belong to Providencia rettgeri. And the phylogentic position of the strain was performed based on the phylogenetic tree. The strain had good effect of NH4+-N removal and N2 production. 97.9% of TN removal efficiency was obtained when initial ammonium concentration was 80 mg/l. The nitrogen removal by strain YL might be the result of heterotrophic nitrification and aerobic denitrification.Key words biologic nitrogen removal; heterotrophic nitrifier; 16S rRNA sequence; phylogentic analysis,; Providencia rettgeri随着水体富营养化的日趋严重，水中氮素的去除已成为当今水污染防治的一个热点问题。

两株异养硝化—好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定和特性研究一、本文概述本文旨在探讨两株异养硝化-好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定及其特性研究。

异养硝化-好氧反硝化细菌是一类特殊的微生物，能够在好氧条件下进行硝化和反硝化过程，对于氮循环和环境保护具有重要意义。

本文首先通过分离和筛选方法，从自然环境中获取两株具有异养硝化-好氧反硝化功能的细菌，并对其进行初步的生理生化特性分析。

接着，采用分子生物学手段对这两株细菌进行鉴定，明确其分类地位和系统发育关系。

在此基础上，进一步深入研究这两株细菌的生长特性、硝化反硝化性能、以及环境因子对其生长和代谢的影响。

本文的研究结果不仅有助于深入了解异养硝化-好氧反硝化细菌的生物学特性和生态学功能，同时也为该类微生物在环境修复、污水处理等领域的应用提供理论支撑和实践指导。

二、材料与方法为了分离和筛选异养硝化—好氧反硝化细菌，我们从多个不同的生态环境中采集了土壤和水样，包括污水处理厂、河流、湖泊以及农田土壤等。

为了培养和筛选目标细菌，我们使用了多种培养基，包括常规的好氧反硝化培养基和异养硝化培养基。

这些培养基根据细菌的生长特性和需求进行了优化。

实验过程中使用了多种分子生物学试剂，如PCR引物、DNA提取试剂盒等。

同时，还使用了多种仪器，如PCR仪、凝胶电泳仪、微生物培养箱等。

采用稀释涂布法将采集的样品接种到含有相应培养基的平板上，通过观察菌落的形态、大小和颜色等特征，初步筛选出具有异养硝化—好氧反硝化能力的细菌。

通过形态学观察、生理生化特性分析以及分子生物学方法（如16S rDNA序列分析）对筛选出的细菌进行鉴定。

对筛选和鉴定出的细菌进行详细的特性研究，包括生长曲线测定、异养硝化速率测定、好氧反硝化速率测定等。

还研究了环境因子（如温度、pH、碳源和氮源等）对细菌生长和硝化反硝化活性的影响。

实验数据采用统计学方法进行分析，以揭示细菌的生长规律和硝化反硝化特性。

还通过图表等形式直观地展示了实验结果。

山东农业大学学报(自然科学版),2022,53(6):819-824VOL.53NO.62022 Journal of Shandong Agricultural University(Natural Science Edition)doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.001一株好氧反硝化芽孢杆菌的筛选鉴定及脱氮特性研究常允康,贾莹莹,王丽华,王涵,樊惠原,居润成,徐娜*济宁医学院生物科学学院,山东日照276800摘要:为获得高效的生物脱氮细菌，从某黑臭河道水体中分离得到一株好氧反硝化细菌，通过对好氧反硝化和异养硝化两个过程中的菌体生物量、总氮、硝酸盐氮以及氨氮的浓度进行监测，研究其脱氮特性。

并且，进一步研究了碳源种类、碳氮比、温度、转速、盐度等外界因素对其好氧反硝化性能的影响。

结果表明：分离得到的好氧反硝化细菌经鉴定为芽孢杆菌属，记为Bacillus sp.N-1。

分别以硝酸钾和硫酸铵作为初始唯一氮源，截至24h，对硝酸盐氮和氨氮的去除率分别为86.14%和86.20%，去除速率分别为1.79mg/(L·h)和1.82mg/(L·h)，证明了菌株Bacillus sp.N-1在具有优异的好氧反硝化能力的同时具备较强的异养硝化能力。

另外，好氧反硝化过程的影响因素分析表明，当以丁二酸钠或者柠檬酸钠为碳源，碳氮比在15~25之间，温度在25~35℃之间，转速在200~250rpm之间，盐度在1%以内时，该菌株对硝酸盐氮的去除率均能保持在70%以上，在废水的生物脱氮处理中具备很好的应用前景。

关键词:芽孢杆菌;鉴定;生物脱氮中图法分类号:Q939.9文献标识码:A文章编号:1000-2324(2022)06-0819-06 Screening and Identification of an Aerobic Denitrification BacillusStrain and Its Nitrogen Removal CharacteristicsCHANG Yun-kang,JIA Ying-ying,WANG Li-hua,WANG Han,FAN Hui-yuan, JU Run-cheng,XU Na*School of Biological Science/Jining Medical University,Rizhao276800,ChinaAbstract:In order to obtain efficient bacteria for nitrogen removal,an aerobic denitrification bacteria was isolated from a black-odor river.The biomass and the concentrations of the total nitrogen,nitrate nitrogen and ammonia nitrogen during aerobic denitrification and heterotrophic nitrification processes were monitored to study its nitrogen removal characteristics. Moreover,the influence of external factors such as carbon source type,C/N ratio,temperature,rotate speed and salinity on the aerobic denitrification performance were further studied.The results showed that the aerobic denitrification bacteria was identified as Bacillus strain,and was recorded as Bacillus sp.N-1.With potassium nitrate and ammonium sulfate as the initial single nitrogen source,the removal efficiency of nitrate nitrogen and ammonia nitrogen was86.14%and86.20%under24 hours,respectively,and the removal rate was1.79mg/(L·h)and1.82mg/(L·h),respectively,which showed that Bacillus sp. N-1had excellent aerobic denitrification and heterotrophic nitrification performance.In addition,the analysis of factors which affecting the aerobic denitrification process showed that when sodium succinate or sodium citrate was used as carbon source,the ratio of C/N was between15and25,the temperature was between25and35℃,the rotate speed was between 200and250rpm,and the salinity was within1%,the nitrate nitrogen removal efficiency could still stay above70%,which showed good application prospect in biological denitrification treatment of wastewater.Keywords:Aerobic denitrification;identification;bioremoval of nitrogen我国生态环境部发布的《2020年中国生态环境统计年报》指出，2020年全国废水中氨氮排放量为98.4万t，总氮排放量为322.3万t。

一株耐高温亚硝酸盐型反硝化细菌的鉴定及脱氮特性李誉琦; 马佩钰; 刘涵; 王灵芝; 高仁玲; 李慧娟【期刊名称】《《生物技术通报》》【年(卷),期】2019(035)009【总页数】8页(P194-201)【关键词】芽孢杆菌; 亚硝酸盐; 反硝化细菌; 高温【作者】李誉琦; 马佩钰; 刘涵; 王灵芝; 高仁玲; 李慧娟【作者单位】山东科技大学化学与环境工程学院青岛266590; 北京中医药大学生命科学学院北京102488【正文语种】中文亚硝酸盐是生态系统中氮循环的成分之一，也是微生物硝化作用和反硝化作用的中间产物。

高浓度的亚硝酸盐对水生生物、哺乳动物及人类具有多种毒害效应［1-2]，降低及控制亚硝酸盐含量是水处理工艺中的重要步骤。

与物理法和化学法脱氮方式相比，生物法去除亚硝酸盐氮因具有高效、安全、成本低、无二次污染等优点，成为最常用的技术。

反硝化细菌是去除环境中对生物有毒害作用亚硝酸盐的重要菌群，通过好氧或厌氧反硝化过程将硝酸盐或亚硝酸盐转化成一氧化二氮或氮气，从根本上解决水体中亚硝酸盐污染的问题［3-4]。

好氧反硝化菌主要分离自活性污泥、废水、废水处理系统、土壤、海底沉积物等环境中［5]，涵盖的种属类型多，有假单胞菌属（Pseudomonas）［6]、不动杆菌属（Acinetobacter）［7]、芽孢杆菌属（Bacillus）［8]、肠杆菌属（Enterobacter）［3]、海杆菌属（Marinobacter）［9]和苍白杆菌属（Ochrobactrum）［10]等。

反硝化细菌多在25-37℃范围内有较高的反硝化能力，而低温或高温均会影响菌株的生长和酶的活性。

超过40℃，细菌的硝化和反硝化过程受到强烈抑制［3]。

生产实际中，很多工业废水的温度都达到45℃以上，利用常规反硝化细菌处理，需将废水进行冷却处理。

若直接用高温反硝化细菌处理高温废水，不仅省去高温废水冷却处理环节，减少设备投资，也提高了水处理效率。

一株好氧反硝化细菌的筛选、鉴定及紫外诱变邵颖;陈安徽;董玉玮【摘要】从牛蒡(Arctium lappa L.)根际土壤中分离到1株具有较高反硝化能力的好氧细菌YB000,对该菌株采用生理生化及分子生物学方法进行了鉴定,并且对该菌株进行了以提高反硝化性能为目的的紫外诱变.结果表明,分离自牛蒡根际的反硝化细菌经鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),该菌株于距离30W紫外灯30 cm处照射240 s可获得具有较强脱氮能力且遗传性状稳定的诱变菌株YB004和YB005,其脱氮能力分别达到93.43％、92.03％.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2016(000)013【总页数】5页(P3305-3309)【关键词】好氧反硝化细菌;牛蒡(Arctium lappa L.);根际土壤;筛选;鉴定;紫外诱变【作者】邵颖;陈安徽;董玉玮【作者单位】徐州工程学院食品(生物)工程学院,江苏徐州221008;徐州工程学院食品(生物)工程学院,江苏徐州221008;徐州工程学院食品(生物)工程学院,江苏徐州221008【正文语种】中文【中图分类】X172随着水产养殖业的迅猛发展、含氮工业废水的排放及农业中化肥的过量施用，导致水体氮素含量严重超标而影响水体的使用安全［1，2］。

氮素超标是导致水体富营养化的重要原因之一，生物脱氮可有效去除水体中的氮元素［3］。

传统的生物脱氮包括硝化和反硝化两个过程，反硝化脱氮能将硝酸盐氮或亚硝酸盐氮转化为气态氮，从根本上解决水体中氮素超标的问题。

反硝化细菌是能够引起反硝化作用的细菌，多为异养、兼性厌氧细菌［4］，但近期研究表明，一些微生物在较高的氧分压条件下也能表现出反硝化能力［5-8］。

好氧反硝化作用实现了硝化和反硝化作用的同时进行，不仅简化了生物脱氮流程、降低了投资成分，而且还表现出了传统废水处理方法所无法比拟的优势，如硝化过程无需加碱中和、脱氮效率高、对氨态氮耐受能力强等［9］。

MBR系统好氧反硝化效果及好氧反硝化菌的鉴定李晓楼【摘要】采用间歇曝气法对MBR系统好氧反硝化菌进行了培养和富集,考察了系统的好氧反硝化效果及其影响因素,并对好氧反硝化菌进行了分离和鉴定.实验结果表明:在DO为2.0～3.0 mg/L、m(C)∶m(N)为8∶1的条件下,MBR系统好氧反硝化效果较好,COD、氨氮、TN的去除率分别达到90％,90％,62％左右;从系统活性污泥中得到11株好氧反硝化性能较好的好氧反硝化菌,它们属于变形菌门,分别属于不动杆菌属、丛毛单胞菌属、气单胞菌属、假单胞菌属和噬氢菌属.【期刊名称】《化工环保》【年(卷),期】2015(035)004【总页数】5页(P339-343)【关键词】生物脱氮;膜生物反应器;好氧反硝化菌;菌种鉴定【作者】李晓楼【作者单位】四川职业技术学院建筑与环境工程系,四川遂宁629000【正文语种】中文【中图分类】X703近年来，国家对水质标准和水处理要求的提高，对生物脱氮技术的发展提出了更高要求。

传统生物脱氮技术存在较多不足之处，如硝化菌群增殖速度慢、需进行污泥和硝化液的回流、系统抗冲击能力较弱以及脱氮酸碱度需调节等［1］。

研究发现，在好氧硝化池中常有超出微生物增殖所需的氮的去除，损失的总氮量高达30%［2］。

这种好氧过程中的脱氮现象是由好氧反硝化菌引起的。

与传统生物脱氮技术相比，好氧反硝化菌脱氮具有以下优点：1）使硝化/反硝化反应在同一个反应器中进行，可大幅减少占地面积和建设资金；2）可减少调节系统pH的化学药剂用量，降低成本；3）好氧反硝化菌在处理过程中更易控制［3］。

目前，在多种生物处理系统中都发现了好氧反硝化过程的存在，如好氧曝气池和SBR系统［4-5］。

由于生长条件和竞争等因素限制，好氧反硝化菌不易筛选和富集，而采用生物固定化技术和MBR能够有效地保留和富集好氧反硝化菌［6-7］。

通过对生物处理系统中好氧反硝化菌的分离筛选和鉴定，了解系统中好氧反硝化菌的生长条件，有利于调控生物处理系统，保证好氧反硝化过程的顺利进行［8-9］。