抗补体活性测定法

降低静脉注射用人免疫球蛋白抗补体活性的试验观察常娅莉,张艳荣,赵宜为,李振平,刘 燕,崔红宇兰州生物制品研究所,兰州 730046)摘 要:采用CH50试验法测定静脉注射用人免疫球蛋白(IVIG)抗补体活性(ACA),在中性p H条件下,比较了不同的Na+含量及不同种类的糖对ACA测定结果的影响。

结果表明,NaC1含量由0.2%上升至1.0%时,AC A呈逐渐下降趋势;用5%葡萄糖作稳定剂时ACA最低。

IVIG在37 条件下放置一月后,AC A有明显下降趋势。

在半成品配制过程中,p H及各种成份的加入顺序对ACA也有一定影响。

关键词:静脉注射用人免疫球蛋白(IVIG);抗补体活性(ACA);稳定剂中图分类号:R392.11 文献标识码:A 文章编号:1005-5673(2003)03-0037-03Study and observation on reducing ACA of human immunoglobulin for intravenous injection C HANG Ya-li,Z HANG Yan-ron g,Z HAO Yi-wei,et al. (Lan z hou Institute o f Biological products,Lanzhou730046,China)Abstract:The ACA of human immunoglobulin for intravenous injection was determined by C H50test.The effect of different Na+ contents and sugars were studied to ACA determination.The resul ts showed that ACA was reduced if the Na+content increased from0.2%to1.0%;the ACA of IVIG i s lowest when the5%glucose is used as stabilizer,and the AC A were reduced when IVIG is stored at37 for one month.During preparation of final bulk,the order of adding stabilizers also effects the result of AC A de-termination.Key words:Hu man im munoglobulin for intravenous injection(IVIG);Anticomplement Acti ve(ACA);Stabilizer静脉注射用人免疫球蛋白(IVIG)是具有多种抗体活性的血液制品,因具有广泛的应用价值而受到临床重视。

生化方法检测补体的原理
生化方法用于检测补体的原理是利用补体活性引发特定生化反应的能力进行测定。

补体是一组血浆蛋白，在免疫反应中发挥重要作用。

补体可以通过一系列级联反应，参与细胞毒性、炎症反应、免疫复合物溶解等过程。

补体的活性可以通过多种方法进行检测。

其中一种常用的生化方法是补体结合试验（CH50），它可以用来评估补体系统的总活性。

CH50发生在两个步骤中，首先是固定补体与溶菌素结合，然后是固定补体与抗补体抗体结合。

在这个过程中，最终形成一个结合复合物。

CH50方法中，固定补体通常是红细胞或细胞膜，在试验开始时与试样混合。

如果补体系统正常，补体会结合到细胞表面或抗原上，并引发溶菌素活化，最终形成溶菌环。

溶菌环可以通过颜色改变或光度等数值进行测定。

通过测定溶菌环的形成与消失，可以计算出补体结合能力，即CH50值。

CH50值较高表示补体系统活性较强，而较低的值则可能表示补体系统的缺陷或异常。

除了CH50方法，还有其他的生化方法来检测补体活性，如溶血试验、自溶试验等。

这些试验都利用了补体活性引发特定生化反应的原理，以评估补体系统的
功能。

静脉注射用免疫球蛋白抗补体活性试验条件的比较
王立兰;卢连玉
【期刊名称】《中国生物制品学杂志》
【年(卷),期】1991(0)1
【摘要】目前,静脉注射用免疫球蛋白（IVIG）抗补体活性（ACA）试验方法较多,有2CH₅₀、5CH₅₀及100 CH₅₀等方法,虽都自称源于Mayer法,但实际应用中已做了较大修改。

目前国内使用的方法及条件也不完全一样。

为此,我们以100 CH₅₀法为基础,对一些不同的试验条件进行了比较,供同行们参考。

1.Mayer介绍绵羊红血球（SRBC）用EDTA洗涤的目的主要是为了除去SRBC表面上的C₁。

而而
C₁是一种不耐热补体,采集SRBC放置一周后才能使用,在此期内SRBC表面上的C₁
【总页数】1页(P28-28)
【关键词】SRBC;抗补体活性;免疫球蛋白;试验条件;Mayer;溶血素;致敏;IgG;试验结果;任意选择
【作者】王立兰;卢连玉
【作者单位】中国药品生物制品检定所
【正文语种】中文
【中图分类】R977
【相关文献】
1.静脉注射用免疫球蛋白的抗补体活性及部分免疫学特性测定 [J], 王立兰;卢连玉
2.应用ELISA法检测静脉注射用人血免疫球蛋白抗补体活性 [J], 任跃明;程雅琴;倪道明
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（一）补体总活性测定实验原理补体最主要的活性是溶细胞作用。

特异性抗体与红细胞结合后可激活补体，导致红细胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分渗入，引起红细胞肿胀而发生溶血。

补体溶血程度与补体的活性相关，但非直线关系。

在一个适当的、稳定的反应系统中，溶血反应对补体的剂量依赖呈一特殊的S形曲线。

如以溶血百分率为纵坐标，相应血清量为横坐标，可见在轻微溶血和接近完全溶血处，对补体量的变化不敏感。

S形曲线在30%～70%之间最陡，几乎呈直线，补体量的少许变动，也会造成溶血程度的较大改变，即曲线此阶段对补体量的变化非常敏感。

因此，实验常以50%溶血作为终点指标，它比100%溶血更为敏感，这一方法称为补体50%溶血实验即CH50。

考试用书（二）检测试剂绵羊红细胞；溶血素；稀释缓冲液。

（三）方法评价CH50试验是测定经典途径总补体溶血活性，所反映的是补体9种成分的综合水平。

方法简便、快速，但敏感性较低。

补体的溶血活性除与试验中反应体积成反比外，还与反应所用缓冲液的pH、离子强度、钙镁浓度、绵羊红细胞数量和反应温度有一定关系。

缓冲液pH和离子强度增高，补体活性下降，虽可稳定溶血系统，但过量则反而抑制溶血反应，故实验时对反应的各个环节应严加控制，统一步骤。

（四）临床意义CH50法检测是补体经典途径的溶血活性，所反映的主要是补体9种成分的综合水平。

如果测定值过低或者完全无活性，首先考虑补体缺陷，可分别检测C4、C2、C3和C5等成分的含量；严重肝病时血浆蛋白合成能力受损。

营养不良时蛋白合成原料不足，也可以不同程度地引起血清补体水平下降。

在患系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎等自身免疫病时，血清补体水平随病情发生变化。

疾病活动期补体活化过度，血清补体水平下降；病情稳定后补体水平又反应性增高。

因此补体检测常可作为自身免疫病诊断或是否有疾病活动的参考指标。

细菌感染特别是革兰阴性细菌感染时，常因补体旁路途径的活化过度引起血清补体水平降低。

抗补体活性测定法本法系采用免疫溶血反应作指示系统，根据供试品消耗补体所反映出的溶血率变化，测定供试品的抗补体活性。

试剂（1）镁-钙贮备液取氯化钙1.103g、氯化镁（MgCl2·6H2O）5.083g，加水溶解并稀释至25ml。

（2）巴比妥缓冲液贮备液取氯化钠41.5g、巴比妥钠5.1g，加水800ml溶解。

用1mol/L 盐酸溶液调pH值至7.3，加镁-钙贮备液2.5ml，加水稀释至1000ml，用0.22μm膜滤过，4℃保存备用。

（3）明胶巴比妥缓冲液（GVB）取明胶0.625g，加水30ml煮沸使溶解，加巴比妥缓冲液贮备液100ml，再加水稀释至500ml，新鲜制备，当天使用。

（4）阿氏液（Alsever’s液）取枸橼酸0.5g、枸橼酸钠8.0g、葡萄糖20.5g、氯化钠4.2g，加水溶解并稀释至1000ml（pH6.2左右）。

根据一次采羊血需要量将该溶液分装于采血瓶中，116℃蒸汽灭菌10分钟（灭菌后，尽快释放蒸汽）。

放冷后置4℃冰箱保存备用。

（5）绵羊红细胞由绵羊颈静脉无菌采集全血适量，与等体积的阿氏液混合，无菌分装，4℃保存一周后方可使用。

（6）溶血素兔抗羊红细胞血清。

（7）豚鼠血清（补体）取10只以上豚鼠血清，混合，4℃离心除去血细胞，分装，-70℃保存，也可冻干保存。

豚鼠血清每1ml中的补体总活性应不低于100CH50。

5%羊红细胞悬液制备取绵羊红细胞适量，用明胶巴比妥缓冲液至少洗3次后，悬浮于适量明胶巴比妥缓冲液中。

取0.2ml红细胞悬液，加至2.8ml水中，待红细胞完全溶解后照紫外-可见分光光度法（附录ⅡA）在波长541nm处测定吸光度，根据下列公式，将该溶液的吸光度调节至0.62±0.01（每1ml红细胞悬液含红细胞1×109个）。

V f = V i×A————0.62式中Vi 为稀释前红细胞悬液体积，ml；A为稀释前红细胞溶解液吸光度；V f为稀释后红细胞悬液体积，ml。

抗补体活性测定法本法系采用免疫溶血反应作指示系统，根据供试品消耗补体所反映出的溶血率变化，测定供试品的抗补体活性。

试剂（1）镁-钙贮备液取氯化钙1.103g、氯化镁（MgCl2·6H2O）5.083g，加水溶解并稀释至25ml。

（2）巴比妥缓冲液贮备液取氯化钠41.5g、巴比妥钠5.1g，加水800ml溶解。

用1mol/L 盐酸溶液调pH值至7.3，加镁-钙贮备液2.5ml，加水稀释至1000ml，用0.22μm膜滤过，4℃保存备用。

（3）明胶巴比妥缓冲液（GVB）取明胶0.625g，加水30ml煮沸使溶解，加巴比妥缓冲液贮备液100ml，再加水稀释至500ml，新鲜制备，当天使用。

（4）阿氏液（Alsever’s液）取枸橼酸0.5g、枸橼酸钠8.0g、葡萄糖20.5g、氯化钠4.2g，加水溶解并稀释至1000ml（pH6.2左右）。

根据一次采羊血需要量将该溶液分装于采血瓶中，116℃蒸汽灭菌10分钟（灭菌后，尽快释放蒸汽）。

放冷后置4℃冰箱保存备用。

（5）绵羊红细胞由绵羊颈静脉无菌采集全血适量，与等体积的阿氏液混合，无菌分装，4℃保存一周后方可使用。

（6）溶血素兔抗羊红细胞血清。

（7）豚鼠血清（补体）取10只以上豚鼠血清，混合，4℃离心除去血细胞，分装，-70℃保存，也可冻干保存。

豚鼠血清每1ml中的补体总活性应不低于100CH50。

5%羊红细胞悬液制备取绵羊红细胞适量，用明胶巴比妥缓冲液至少洗3次后，悬浮于适量明胶巴比妥缓冲液中。

取0.2ml红细胞悬液，加至2.8ml水中，待红细胞完全溶解后照紫外-可见分光光度法（附录ⅡA）在波长541nm处测定吸光度，根据下列公式，将该溶液的吸光度调节至0.62±0.01（每1ml红细胞悬液含红细胞1×109个）。

V f = V i×A————0.62式中Vi 为稀释前红细胞悬液体积，ml；A为稀释前红细胞溶解液吸光度；V f为稀释后红细胞悬液体积，ml。

附录ⅨK抗补体活性测定法本法系采用免疫溶血反应作指示系统，根据供试品消耗补体所反映出的溶血率变化，测定供试品的抗补体活性。

试剂（1）镁-钙贮备液取氯化钙1.103g、氯化镁（MgCl2·6H2O）5.083g，加水溶解并稀释至25ml。

（2）巴比妥缓冲液贮备液取氯化钠41.5g、巴比妥钠5.1g，加水800ml溶解。

用1mol/L 盐酸溶液调pH值至7.3，加镁-钙贮备液2.5ml，加水稀释至1000ml，用0.22μm膜滤过，4℃保存备用。

（3）明胶巴比妥缓冲液（GVB）取明胶0.625g，加水30ml煮沸使溶解，加巴比妥缓冲液贮备液100ml，再加水稀释至500ml，新鲜制备，当天使用。

（4）阿氏液（Alsever’s液）取枸橼酸0.5g、枸橼酸钠8.0g、葡萄糖20.5g、氯化钠4.2g，加水溶解并稀释至1000ml（pH6.2左右）。

根据一次采羊血需要量将该溶液分装于采血瓶中，116℃蒸汽灭菌10分钟（灭菌后，尽快释放蒸汽）。

放冷后置4℃冰箱保存备用。

（5）绵羊红细胞由绵羊颈静脉无菌采集全血适量，与等体积的阿氏液混合，无菌分装，4℃保存一周后方可使用。

（6）溶血素兔抗羊红细胞血清。

（7）豚鼠血清（补体）取10只以上豚鼠血清，混合，4℃离心除去血细胞，分装，-70℃保存，也可冻干保存。

豚鼠血清每1ml中的补体总活性应不低于100CH50。

5%羊红细胞悬液制备取绵羊红细胞适量，用明胶巴比妥缓冲液至少洗3次后，悬浮于适量明胶巴比妥缓冲液中。

取0.2ml红细胞悬液，加至2.8ml水中，待红细胞完全溶解后照紫外-可见分光光度法（附录ⅡA）在波长541nm处测定吸光度，根据下列公式，将该溶液的吸光度调节至0.62±0.01（每1ml红细胞悬液含红细胞1×109个）。

V f = V i×A————0.62式中Vi 为稀释前红细胞悬液体积，ml；A为稀释前红细胞溶解液吸光度；V f为稀释后红细胞悬液体积，ml。

补体活性检测、补体参与的溶血试验理解：1.补体的概念和性质2.补体的三条活化途径基本原理掌握：1.血清补体总活性测定的实验原理、实验方法2.补体结合实验的实验原理、实验方法3.各种补体检测方法的临床应用一、补体性质与活化途径（一）二、补体的概念补体（Complement，C）：是一组存在于血液和组织液中，具有级联酶促反应特征、不耐热的糖蛋白，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充成分（二）补体系统的组成补体固有成分：如C1(q、r、s)、C2、C3……C9补体调节蛋白：如B因子、D因子、P因子、H因子补体受体：C3R，CR1，CR2等（三）补体的激活途径经典激活途径、旁路活化途径（四）补体的生物学功能1.细胞毒溶菌作用2.调理作用：C3b、iC3b、C4b3.炎症介质作用：C3a、C5a、C567生物学检测：总补体活性检测、单个补体活性检测免疫学检测：单个补体成分检测、补体受体成分检测二、血清补体总活性测定1.补体总活性测定原理反应系统的组成：抗原+Antibody->活化补体↓↓↓绵羊红细胞+溶血素+待检测补体↓溶血反应(1)溶血反应：通过经典途径或旁路途径激活的补体，作用于致敏红细胞，使红细胞表面形成若干孔，水分等进入红细胞，引起红细胞的肿胀破裂而溶血(2)CH50检测原理在溶血反应中，补体溶血程度与补体的活性相关，但非直线关系以溶血百分率为纵坐标，相应补体含量为横坐标，溶血程度对补体含量依赖呈特殊的S型曲线以50％溶血作为终点指标，比100％溶血更为敏感，这一方法称为补体50％溶血试验（CH50）(3)CH50（50% complement hemolysis）：补体总活性测定方法，以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，故称补体50％溶血试验（CH50）2.实验材料(1)绵羊红细胞①使用等量或两倍的阿氏保存液混合，便于抗凝和储存②临用前生理盐水洗涤红细胞③使用浓度一般为2~5％(2)配制50％溶血标准管①2％SRBC悬液0.5ml+2.0ml蒸馏水使其溶解②加入2.0ml1.8％NaCl溶液校正为等渗溶液③加入2％SRBC溶液0.5ml，即为50％溶血状态(3)溶血素（抗SRBC Ab）①用SRBC免疫家兔得到兔抗SRBC血清②试验前应预先加热（56℃，30min），灭活补体③滴定溶血素的效价：产生完全溶血的最高稀释度为溶血素的效价(4)缓冲液①磷酸盐缓冲液或巴比妥缓冲液②pH应调至7.2-7.4之间③适量氯化钠保持等渗④并适量加入一些Ca2+和Mg2+(5)补体①作为待检对象：标本必须新鲜②作为主要试剂（单个补体检测）：多采用豚鼠血清，必须新鲜-70℃可保存数月，避免反复冻融存在个体差异, 三只以上血清混合使用3.CH50检测方法判定标准与计算标准：选择溶血程度与50％溶血的标准管相近的两管，以溶血程度最接近标准管的那一管定为终点管计算：CH50(U/ml）＝(1/血清用量）×稀释倍数参考范围：50-100 U/ml4.临床意义CH50主要检测的是经典途径的补体溶血活性，所反映的主要是补体9种成分的综合水平测定值过低或完全无活性，首先考虑补体缺陷，可分别检测血清中C4、C2、C3、C5等单个成份的含量三、单个补体成分的测定1.单个补体成分的检测对象主要包括：C3、C4、 C1q、B因子等2.测定方法：溶血法（检测单个补体的溶血活性）免疫化学法（测定补体含量）3.试验方法致敏SRBC+反应系统补体（缺待检成分）→不溶血致敏SRBC+反应系统补体（缺待检成分）+待检血清→溶血4.溶血法(1)原理：抗原与其特异性抗体（IgG、IgM型）结合后，可激活补体导致细胞溶解(2)组成：①试剂指示系统（致敏SRBC）②试剂补体系统（待检补体缺失）③待检血清（是否含待检补体？）(3)试剂补体系统选用先天或人为导致的缺乏某单一补体成分的动物或人血清作为试剂，如人缺C2血清、豚鼠缺C4血清、小鼠缺C5血清、兔缺C6血清等(4)应用与评价①诊断补体某单个成分缺失或其含量正常但无溶血活性的先天性补体缺陷②定性方法，检测单个补体成分③无需特殊仪器，快速，但灵敏度低，影响因素多四、补体结合试验（complement fixation test，CFT）1.反应系统的组成：抗原+Antibody->活化补体→溶血反应2.概念补体结合试验（complement fixation test，CFT）：将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应系统中抗原或抗体的传统方法3.原理(1)三个系统（包括5个成分）：①反应系统：已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）②补体系统：C1-9及其缓冲液③指示系统：SRBC与相应溶血素（SRBC抗体）常预先混合形成致敏红细胞(2)补体作用无特异性，既可与反应体系中的抗原抗体复合物结合，也能与SRBCs结合(3)两个阶段：第一步：反应系统与补体系统作用第二步：指示系统（SRBCs）与剩余补体反应4.试验方法结果判定：(1)补体对照管 2U全溶，1U为全溶或略带少许RBC，0.5U应不溶(2)若0.5U补体对照管出现明显溶血，表示补体用量过多；如2U不出现溶血，表示补体用量不够(3)受检血清不溶血为阳性，溶血为阴性5.试验试剂(1)抗原和抗体的效价方法：方阵法进行滴定选择抗原与抗体二者都呈强阳性反应的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（1单位）在正式试验中，抗原一般采用2－4单位，抗体为4个单位(2)补体效价的滴定①一般用豚鼠补体②每次试验前均应滴定③温育后，能产生完全溶血的补体最少用量确定为1个单位，正式试验中使用2个单位(3)血清标本的处理①采集血液标本后应及时分离血清，及时检验，或将血清保存在-20℃②血清在试验前应先加热56℃ 30min以破坏补体6.应用和评价(1)优点：①补体活化过程有放大效应，灵敏度较高②可用于定性或半定量检测未知抗原或抗体③试验条件要求低易于普及、结果易判断(2)缺点：①影响因素复杂，操作步骤繁琐②抗体必须为IgM或IgG五、补体测定的临床意义1.检测补体的单个成分及补体的活性测定对于机体免疫系统的功能评价，疾病的诊断与治疗等有重要意义(1)免疫性疾病①C1、C2、C3和Hf等缺陷②Ⅲ型超敏反应中C3aC5a等过敏毒素检测(2)遗传性疾病①C3缺陷导致的感染②C1抑制物缺陷与遗传性血管性水肿③I因子、H因子缺陷与肾小球肾炎等2.补体含量继发性降低的疾病(1)补体消耗增多：SLE、自身免疫性溶血性贫血、类风湿性关节炎、移植排斥反应等(2)细菌性感染，激活补体替代途径导致补体水平降低(3)大面积烧伤、大出血和肾病综合征等导致体液大量丧失(4)补体合成不足：急慢性肝炎、肝硬化、肝癌及营养不良等小结1.CH50试验的原理及方法学评价2.补体结合试验的原理及结果解释复习思考题：1.名词概念：Complement、CH50 test、CFT（Complement Fixation Test）2.思考题：请例举其他有补体参与的免疫学检测技术或方法。