抗补体活性测定法

1. 学习补体活性测定的原理和方法。

2. 掌握补体活性的定量分析方法。

3. 了解补体含量在临床医学中的应用。

二、实验原理补体（Complement）是一组存在于人体血浆中的蛋白质，具有增强免疫应答、清除病原体等作用。

补体活性测定是评估机体免疫功能的重要指标之一。

本实验采用经典途径补体活性测定方法，通过检测溶血素在补体参与下的溶血活性，间接反映补体含量。

三、实验材料1. 试剂：溶血素、补体标准品、生理盐水、蒸馏水、抗人球蛋白抗体、酶标仪、微量移液器、比色皿等。

2. 仪器：离心机、恒温水浴箱、显微镜、离心管等。

四、实验方法1. 标准曲线的制备（1）将补体标准品稀释成不同浓度（如1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等）。

（2）将各浓度补体标准品与等量溶血素混合，置于37℃水浴箱中孵育30分钟。

（3）加入等量抗人球蛋白抗体，混匀，置于37℃水浴箱中孵育30分钟。

（4）加入生理盐水，终止反应。

（5）在酶标仪上检测各孔的吸光度（OD值）。

（6）以OD值为纵坐标，补体浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2. 样品检测（1）取一定量待测样品，按上述步骤进行稀释。

（2）重复上述步骤，检测样品的OD值。

（3）根据标准曲线，计算样品中补体的含量。

1. 标准曲线制备：根据实验数据绘制标准曲线，如图1所示。

图1 补体标准曲线2. 样品检测：根据标准曲线计算样品中补体的含量，结果如下表所示。

表1 样品补体含量检测结果样品编号补体含量（U/ml）1 32.52 27.03 24.54 20.05 16.5六、实验讨论1. 本实验采用经典途径补体活性测定方法，通过检测溶血素在补体参与下的溶血活性，间接反映补体含量。

2. 实验结果显示，样品中补体含量在16.5～32.5 U/ml之间，说明样品具有一定的补体活性。

3. 补体含量测定在临床医学中具有重要意义，如评估机体免疫功能、诊断某些疾病等。

七、实验总结1. 本实验成功制备了补体标准曲线，为后续样品检测提供了依据。

降低静脉注射用人免疫球蛋白抗补体活性的试验观察常娅莉,张艳荣,赵宜为,李振平,刘 燕,崔红宇兰州生物制品研究所,兰州 730046)摘 要:采用CH50试验法测定静脉注射用人免疫球蛋白(IVIG)抗补体活性(ACA),在中性p H条件下,比较了不同的Na+含量及不同种类的糖对ACA测定结果的影响。

结果表明,NaC1含量由0.2%上升至1.0%时,AC A呈逐渐下降趋势;用5%葡萄糖作稳定剂时ACA最低。

IVIG在37 条件下放置一月后,AC A有明显下降趋势。

在半成品配制过程中,p H及各种成份的加入顺序对ACA也有一定影响。

关键词:静脉注射用人免疫球蛋白(IVIG);抗补体活性(ACA);稳定剂中图分类号:R392.11 文献标识码:A 文章编号:1005-5673(2003)03-0037-03Study and observation on reducing ACA of human immunoglobulin for intravenous injection C HANG Ya-li,Z HANG Yan-ron g,Z HAO Yi-wei,et al. (Lan z hou Institute o f Biological products,Lanzhou730046,China)Abstract:The ACA of human immunoglobulin for intravenous injection was determined by C H50test.The effect of different Na+ contents and sugars were studied to ACA determination.The resul ts showed that ACA was reduced if the Na+content increased from0.2%to1.0%;the ACA of IVIG i s lowest when the5%glucose is used as stabilizer,and the AC A were reduced when IVIG is stored at37 for one month.During preparation of final bulk,the order of adding stabilizers also effects the result of AC A de-termination.Key words:Hu man im munoglobulin for intravenous injection(IVIG);Anticomplement Acti ve(ACA);Stabilizer静脉注射用人免疫球蛋白(IVIG)是具有多种抗体活性的血液制品,因具有广泛的应用价值而受到临床重视。

5.方茴说：“那时候我们不说爱，爱是多么遥远、多么沉重的字眼啊。

我们只说喜欢，就算喜欢也是偷偷摸摸的。

”6.方茴说：“我觉得之所以说相见不如怀念，是因为相见只能让人在现实面前无奈地哀悼伤痛，而怀念却可以把已经注定的谎言变成童话。

”7.在村头有一截巨大的雷击木，直径十几米，此时主干上唯一的柳条已经在朝霞中掩去了莹光，变得普普通通了。

8.这些孩子都很活泼与好动，即便吃饭时也都不太老实，不少人抱着陶碗从自家出来，凑到了一起。

9.石村周围草木丰茂，猛兽众多，可守着大山，村人的食物相对来说却算不上丰盛，只是一些粗麦饼、野果以及孩子们碗中少量的肉食。

附录ⅨK抗补体活性测定法本法系采用免疫溶血反应作指示系统，根据供试品消耗补体所反映出的溶血率变化，测定供试品的抗补体活性。

试剂（1）镁-钙贮备液取氯化钙1.103g、氯化镁（MgCl2·6H2O）5.083g，加水溶解并稀释至25ml。

（2）巴比妥缓冲液贮备液取氯化钠41.5g、巴比妥钠5.1g，加水800ml溶解。

用1mol/L 盐酸溶液调pH值至7.3，加镁-钙贮备液2.5ml，加水稀释至1000ml，用0.22μm膜滤过，4℃保存备用。

（3）明胶巴比妥缓冲液（GVB）取明胶0.625g，加水30ml煮沸使溶解，加巴比妥缓冲液贮备液100ml，再加水稀释至500ml，新鲜制备，当天使用。

（4）阿氏液（Alsever’s液）取枸橼酸0.5g、枸橼酸钠8.0g、葡萄糖20.5g、氯化钠4.2g，加水溶解并稀释至1000ml（pH6.2左右）。

根据一次采羊血需要量将该溶液分装于采血瓶中，116℃蒸汽灭菌10分钟（灭菌后，尽快释放蒸汽）。

放冷后置4℃冰箱保存备用。

（5）绵羊红细胞由绵羊颈静脉无菌采集全血适量，与等体积的阿氏液混合，无菌分装，4℃保存一周后方可使用。

（6）溶血素兔抗羊红细胞血清。

（7）豚鼠血清（补体）取10只以上豚鼠血清，混合，4℃离心除去血细胞，分装，-70℃保存，也可冻干保存。

生化方法检测补体的原理
生化方法用于检测补体的原理是利用补体活性引发特定生化反应的能力进行测定。

补体是一组血浆蛋白，在免疫反应中发挥重要作用。

补体可以通过一系列级联反应，参与细胞毒性、炎症反应、免疫复合物溶解等过程。

补体的活性可以通过多种方法进行检测。

其中一种常用的生化方法是补体结合试验（CH50），它可以用来评估补体系统的总活性。

CH50发生在两个步骤中，首先是固定补体与溶菌素结合，然后是固定补体与抗补体抗体结合。

在这个过程中，最终形成一个结合复合物。

CH50方法中，固定补体通常是红细胞或细胞膜，在试验开始时与试样混合。

如果补体系统正常，补体会结合到细胞表面或抗原上，并引发溶菌素活化，最终形成溶菌环。

溶菌环可以通过颜色改变或光度等数值进行测定。

通过测定溶菌环的形成与消失，可以计算出补体结合能力，即CH50值。

CH50值较高表示补体系统活性较强，而较低的值则可能表示补体系统的缺陷或异常。

除了CH50方法，还有其他的生化方法来检测补体活性，如溶血试验、自溶试验等。

这些试验都利用了补体活性引发特定生化反应的原理，以评估补体系统的
功能。

（一）补体总活性测定实验原理补体最主要的活性是溶细胞作用。

特异性抗体与红细胞结合后可激活补体，导致红细胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分渗入，引起红细胞肿胀而发生溶血。

补体溶血程度与补体的活性相关，但非直线关系。

在一个适当的、稳定的反应系统中，溶血反应对补体的剂量依赖呈一特殊的S形曲线。

如以溶血百分率为纵坐标，相应血清量为横坐标，可见在轻微溶血和接近完全溶血处，对补体量的变化不敏感。

S形曲线在30%～70%之间最陡，几乎呈直线，补体量的少许变动，也会造成溶血程度的较大改变，即曲线此阶段对补体量的变化非常敏感。

因此，实验常以50%溶血作为终点指标，它比100%溶血更为敏感，这一方法称为补体50%溶血实验即CH50。

考试用书（二）检测试剂绵羊红细胞；溶血素；稀释缓冲液。

（三）方法评价CH50试验是测定经典途径总补体溶血活性，所反映的是补体9种成分的综合水平。

方法简便、快速，但敏感性较低。

补体的溶血活性除与试验中反应体积成反比外，还与反应所用缓冲液的pH、离子强度、钙镁浓度、绵羊红细胞数量和反应温度有一定关系。

缓冲液pH和离子强度增高，补体活性下降，虽可稳定溶血系统，但过量则反而抑制溶血反应，故实验时对反应的各个环节应严加控制，统一步骤。

（四）临床意义CH50法检测是补体经典途径的溶血活性，所反映的主要是补体9种成分的综合水平。

如果测定值过低或者完全无活性，首先考虑补体缺陷，可分别检测C4、C2、C3和C5等成分的含量；严重肝病时血浆蛋白合成能力受损。

营养不良时蛋白合成原料不足，也可以不同程度地引起血清补体水平下降。

在患系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎等自身免疫病时，血清补体水平随病情发生变化。

疾病活动期补体活化过度，血清补体水平下降；病情稳定后补体水平又反应性增高。

因此补体检测常可作为自身免疫病诊断或是否有疾病活动的参考指标。

细菌感染特别是革兰阴性细菌感染时，常因补体旁路途径的活化过度引起血清补体水平降低。

应用ELISA法检测静脉注射用人血免疫球蛋白抗补体活性任跃明;程雅琴;倪道明
【期刊名称】《中国生物制品学杂志》
【年(卷),期】2004(17)4
【摘要】目的建立检测静脉注射人血免疫球蛋白的抗补体活性的ELISA方法及其相应的标准品。

方法用C1q包被酶标板 ,以辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA HRP)作为酶标记物 ,邻苯二胺为底物。

结果应用ELISA法检测静脉注射用人免疫球蛋白抗补体活性具有准确性高 (97 2 % ) ,精确性好 (试验内精密度为6 7% ,试验间精密度为 9 1% ) ,特异性强 ,灵敏性高 (测定限度为 0 2ACA单位 ,测量限度为 0 3ACA单位 )等特点。

结论ELISA法检测抗补体活性简便、快捷。

【总页数】3页(P239-241)
【关键词】ELISA;静脉注射;人血免疫球蛋白;抗补体活性;检测方法
【作者】任跃明;程雅琴;倪道明
【作者单位】中国药品生物制品检定所;北京生物制品研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R392-33
【相关文献】
1.静脉注射用免疫球蛋白的抗补体活性及部分免疫学特性测定 [J], 王立兰;卢连玉
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

项目三补体的检测——ELISA法【申请单】请完成申请单所要求项目×××市人民医院检验申请单姓名性别年龄门诊号住院号诊断或症状检验标本检验目的送检科室医师送检日期年月日【方法选择】表3-1 补体C3、C4的检测方法速率散射比浊法速率透射比浊法ELISA法单向环状免疫扩散法本次检查选择√【材料准备】1.C3、C4检测试剂盒（ELISA法）。

2.待检者空腹静脉血2ml，不抗凝。

3.半自动酶标仪、洗板机。

4.离心机【操作方法】1.标本处理，3 500rpm离心l0min，分离血清。

2.根据试剂盒说明书要求进行样品测定：①加样，温育；②洗涤，拍干；③加酶结合物，温育；④加酶底物，显色；⑤加终止液，终止反应。

⑥放入酶标仪中，参照说明书设定参数，编号，测读。

【观察结果】查看检测指标并打印结果。

正常参考值：C3：0. 8～1. 55g／L；C4：0. 12～0. 36g／L。

【注意事项】1.补体易失活、降解待测血清在室温（20～25o C）放置不得超过6小时，2～8o C不得超过24小时，故抽血后应及时分离血清并尽快测定。

否则于-20 o C保存标本，但因避免反复冻融标本。

2.试剂盒从冷藏环境中取出时应置室温环境中平衡。

稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

3.实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

（4）不用的其它试剂应包装好或盖好。

不同批号的试剂不要混用。

保质前使用。

4.使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

5.使用干净的塑料容器配置洗涤液。

使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

6.洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

7.底物A应挥发，避免长时间打开盖子。

底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。

避免用手接触，有毒。

实验完成后应立即读取OD值。

8.加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

补体活性检测、补体参与的溶血试验理解：1.补体的概念和性质2.补体的三条活化途径基本原理掌握：1.血清补体总活性测定的实验原理、实验方法2.补体结合实验的实验原理、实验方法3.各种补体检测方法的临床应用一、补体性质与活化途径（一）二、补体的概念补体（Complement，C）：是一组存在于血液和组织液中，具有级联酶促反应特征、不耐热的糖蛋白，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充成分（二）补体系统的组成补体固有成分：如C1(q、r、s)、C2、C3……C9补体调节蛋白：如B因子、D因子、P因子、H因子补体受体：C3R，CR1，CR2等（三）补体的激活途径经典激活途径、旁路活化途径（四）补体的生物学功能1.细胞毒溶菌作用2.调理作用：C3b、iC3b、C4b3.炎症介质作用：C3a、C5a、C567生物学检测：总补体活性检测、单个补体活性检测免疫学检测：单个补体成分检测、补体受体成分检测二、血清补体总活性测定1.补体总活性测定原理反应系统的组成：抗原+Antibody->活化补体↓↓↓绵羊红细胞+溶血素+待检测补体↓溶血反应(1)溶血反应：通过经典途径或旁路途径激活的补体，作用于致敏红细胞，使红细胞表面形成若干孔，水分等进入红细胞，引起红细胞的肿胀破裂而溶血(2)CH50检测原理在溶血反应中，补体溶血程度与补体的活性相关，但非直线关系以溶血百分率为纵坐标，相应补体含量为横坐标，溶血程度对补体含量依赖呈特殊的S型曲线以50％溶血作为终点指标，比100％溶血更为敏感，这一方法称为补体50％溶血试验（CH50）(3)CH50（50% complement hemolysis）：补体总活性测定方法，以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，故称补体50％溶血试验（CH50）2.实验材料(1)绵羊红细胞①使用等量或两倍的阿氏保存液混合，便于抗凝和储存②临用前生理盐水洗涤红细胞③使用浓度一般为2~5％(2)配制50％溶血标准管①2％SRBC悬液0.5ml+2.0ml蒸馏水使其溶解②加入2.0ml1.8％NaCl溶液校正为等渗溶液③加入2％SRBC溶液0.5ml，即为50％溶血状态(3)溶血素（抗SRBC Ab）①用SRBC免疫家兔得到兔抗SRBC血清②试验前应预先加热（56℃，30min），灭活补体③滴定溶血素的效价：产生完全溶血的最高稀释度为溶血素的效价(4)缓冲液①磷酸盐缓冲液或巴比妥缓冲液②pH应调至7.2-7.4之间③适量氯化钠保持等渗④并适量加入一些Ca2+和Mg2+(5)补体①作为待检对象：标本必须新鲜②作为主要试剂（单个补体检测）：多采用豚鼠血清，必须新鲜-70℃可保存数月，避免反复冻融存在个体差异, 三只以上血清混合使用3.CH50检测方法判定标准与计算标准：选择溶血程度与50％溶血的标准管相近的两管，以溶血程度最接近标准管的那一管定为终点管计算：CH50(U/ml）＝(1/血清用量）×稀释倍数参考范围：50-100 U/ml4.临床意义CH50主要检测的是经典途径的补体溶血活性，所反映的主要是补体9种成分的综合水平测定值过低或完全无活性，首先考虑补体缺陷，可分别检测血清中C4、C2、C3、C5等单个成份的含量三、单个补体成分的测定1.单个补体成分的检测对象主要包括：C3、C4、 C1q、B因子等2.测定方法：溶血法（检测单个补体的溶血活性）免疫化学法（测定补体含量）3.试验方法致敏SRBC+反应系统补体（缺待检成分）→不溶血致敏SRBC+反应系统补体（缺待检成分）+待检血清→溶血4.溶血法(1)原理：抗原与其特异性抗体（IgG、IgM型）结合后，可激活补体导致细胞溶解(2)组成：①试剂指示系统（致敏SRBC）②试剂补体系统（待检补体缺失）③待检血清（是否含待检补体？）(3)试剂补体系统选用先天或人为导致的缺乏某单一补体成分的动物或人血清作为试剂，如人缺C2血清、豚鼠缺C4血清、小鼠缺C5血清、兔缺C6血清等(4)应用与评价①诊断补体某单个成分缺失或其含量正常但无溶血活性的先天性补体缺陷②定性方法，检测单个补体成分③无需特殊仪器，快速，但灵敏度低，影响因素多四、补体结合试验（complement fixation test，CFT）1.反应系统的组成：抗原+Antibody->活化补体→溶血反应2.概念补体结合试验（complement fixation test，CFT）：将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应系统中抗原或抗体的传统方法3.原理(1)三个系统（包括5个成分）：①反应系统：已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）②补体系统：C1-9及其缓冲液③指示系统：SRBC与相应溶血素（SRBC抗体）常预先混合形成致敏红细胞(2)补体作用无特异性，既可与反应体系中的抗原抗体复合物结合，也能与SRBCs结合(3)两个阶段：第一步：反应系统与补体系统作用第二步：指示系统（SRBCs）与剩余补体反应4.试验方法结果判定：(1)补体对照管 2U全溶，1U为全溶或略带少许RBC，0.5U应不溶(2)若0.5U补体对照管出现明显溶血，表示补体用量过多；如2U不出现溶血，表示补体用量不够(3)受检血清不溶血为阳性，溶血为阴性5.试验试剂(1)抗原和抗体的效价方法：方阵法进行滴定选择抗原与抗体二者都呈强阳性反应的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（1单位）在正式试验中，抗原一般采用2－4单位，抗体为4个单位(2)补体效价的滴定①一般用豚鼠补体②每次试验前均应滴定③温育后，能产生完全溶血的补体最少用量确定为1个单位，正式试验中使用2个单位(3)血清标本的处理①采集血液标本后应及时分离血清，及时检验，或将血清保存在-20℃②血清在试验前应先加热56℃ 30min以破坏补体6.应用和评价(1)优点：①补体活化过程有放大效应，灵敏度较高②可用于定性或半定量检测未知抗原或抗体③试验条件要求低易于普及、结果易判断(2)缺点：①影响因素复杂，操作步骤繁琐②抗体必须为IgM或IgG五、补体测定的临床意义1.检测补体的单个成分及补体的活性测定对于机体免疫系统的功能评价，疾病的诊断与治疗等有重要意义(1)免疫性疾病①C1、C2、C3和Hf等缺陷②Ⅲ型超敏反应中C3aC5a等过敏毒素检测(2)遗传性疾病①C3缺陷导致的感染②C1抑制物缺陷与遗传性血管性水肿③I因子、H因子缺陷与肾小球肾炎等2.补体含量继发性降低的疾病(1)补体消耗增多：SLE、自身免疫性溶血性贫血、类风湿性关节炎、移植排斥反应等(2)细菌性感染，激活补体替代途径导致补体水平降低(3)大面积烧伤、大出血和肾病综合征等导致体液大量丧失(4)补体合成不足：急慢性肝炎、肝硬化、肝癌及营养不良等小结1.CH50试验的原理及方法学评价2.补体结合试验的原理及结果解释复习思考题：1.名词概念：Complement、CH50 test、CFT（Complement Fixation Test）2.思考题：请例举其他有补体参与的免疫学检测技术或方法。

补体的检测及应用补体是一种由肝脏产生的蛋白质，具有重要的免疫功能，包括参与溶菌作用、免疫介导细胞毒性和加强细胞杀菌作用等。

由于其在免疫系统中的重要作用，补体检测和应用已广泛应用于许多领域。

一、补体的检测：1. 补体蛋白含量检测：通过血液样本分析检测补体蛋白的含量来评估补体系统的功能。

这个方法可以简单地通过测量血清中C3、C4、C5、C6、C7和C9等成分的含量来进行。

2. 补体激活检测：可以通过补体激活的程度来评估补体系统的功能。

这个方法可以通过检测血清样本特定的补体激活产物（如C3b）或测量补体激活后的补体活性来进行。

3. 补体功能检测：通过测量血浆免疫复合物的裂解能力来评估补体系统的功能。

最广泛的方法是溶菌试验，补体可以通过特定细菌溶解来确认其功能。

二、补体的应用：1. 临床诊断：补体检测可以用于存粹定义疾病的定义、确定疾病的严重性和监测疾病的发展。

例如，C1抑制物缺乏或C1抑制物的功能障碍会导致血清中C4水平下降且导致严重的免疫复合物疾病。

另外，二十percent的SLE患者会有C1q水平下降导致疾病发展。

2. 药物研发：补体调节剂（CRs）是一类可以调节机体免疫反应的药物。

CRs可以在自然免疫原和抗体免疫原触发下调节和抑制补体剂量的形成。

最近的补体调节剂升华是Eculizumab，用于治疗补体介导的疾病（如干燥性年龄相关性黄斑变性）。

补体调节剂的研发和应用使得可以预防、治疗和管理炎症性疾病及其相关的严重及病症。

3. 细胞治疗：补体介导的免疫细胞杀菌作用是广泛应用于器官移植、抗肿瘤疗法、血液病学的细胞治疗的方法。

例如，火棘蛋白是细胞杀菌作用的重要成分，通过介导免疫介导的细胞毒性细胞可以对肿瘤细胞进行杀菌作用。

4. 生物防治：一些化外的细菌分泌一定的天然杀菌分子（如锈色素），从而在补体的介导下实现对常规文化法无法有效处理的耐药菌的杀菌作用。

总的来说，补体的检测和应用在现代生物学生物医学研究中起着重要的作用。

叶下珠抗补体活性研究朱芳娟;侯灵莉;孙黔云;杨庆雄【摘要】目的研究叶下珠的抗补体活性及活性成分.方法以活性筛选跟踪为向导,利用溶剂萃取和色谱方法对叶下珠提取物进行分离纯化,采用13C-NMR波谱法结合文献数据鉴定化合物结构,测定其抑制补体的活性及可能的机制.结果筛选出叶下珠醇提取物的乙酸乙酯部位为抗补体活性部位,从中分离得到2个抗补体活性成分,经鉴定为柯里拉京和鞣花酸.乙酸乙酯部位和2个化合物均明显抑制补体经典途径的溶血活性,其IC50分别为53.77、176.54、102.23 mg ·L-1,但对补体旁路途径溶血的抑制作用不明显.进一步研究表明,乙酸乙酯部位和2个化合物干扰了补体经典途径成分C1、C2、C4形成C3转化酶.结论叶下珠的多酚组分是其主要的抗补体活性成分,其机制与这些组分影响经典途径C3转化酶的形成有关.%Aim To explore the anticomplementary ac-tivity and active constituents of Phyllanthus urinaria. Methods Being guided by bioactive screening,the anticomplementary constituents of P.urinaria were iso-lated and purified by solution partition and chromato-graphic techniques,and their structures were identified by 13C-NMR spectrum and the comparison of reported data. The anticomplementary activity and possible mechanism were assayed.Results The EtOAc fraction of the methanol extract of P.urinaria was shown to be the active fraction,and two compounds were purified from the fraction and were identified as corilagin and ellagic acid.The EtOAc and the two compounds signifi-cantly inhibited the hemolysis of the complement classi-cal pathway,with IC50values of 53.77 mg·L-1, 176.54 mg·L-1and 102.23 mg·L-1,respectively. While they just showed slight effecton inhibiting the hemolysis of the complement alternative pathway. All of them affected the formation of C3 convertase of the classical pathway. Conclusions The polyphenols are main anticomplentary constituents of P. urinaria,and its mechanism is related to inhibiting formation of C3 convertase of the classical pathway.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2018(034)005【总页数】5页(P686-690)【关键词】叶下珠;活性成分;抗补体;经典途径;替代途径;C3转化酶【作者】朱芳娟;侯灵莉;孙黔云;杨庆雄【作者单位】贵州师范大学化学与材料科学学院,贵州贵阳 550001;贵州师范大学化学与材料科学学院,贵州贵阳 550001;贵州医科大学省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室,贵州贵阳 550014;贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室,贵州贵阳 550014;贵州师范大学喀斯特研究院/国家喀斯特石漠化防治工程技术研究中心,贵州贵阳 550001【正文语种】中文【中图分类】R282.71;R284.1;R392.11;R977.3叶下珠(Phyllanthus urinaria)又名阴阳草、油甘草、珍珠草等，为大戟科(Euphorbiaceae)叶下珠属一年生草本植物，广泛分布于全世界热带及亚热带地区如泰国、菲律宾、非洲等地，在我国主要分布于长江以南地区[1]。

附录ⅨK抗补体活性测定法本法系采用免疫溶血反应作指示系统，根据供试品消耗补体所反映出的溶血率变化，测定供试品的抗补体活性。

试剂（1）镁-钙贮备液取氯化钙1.103g、氯化镁（MgCl2·6H2O）5.083g，加水溶解并稀释至25ml。

（2）巴比妥缓冲液贮备液取氯化钠41.5g、巴比妥钠5.1g，加水800ml溶解。

用1mol/L 盐酸溶液调pH值至7.3，加镁-钙贮备液2.5ml，加水稀释至1000ml，用0.22μm膜滤过，4℃保存备用。

（3）明胶巴比妥缓冲液（GVB）取明胶0.625g，加水30ml煮沸使溶解，加巴比妥缓冲液贮备液100ml，再加水稀释至500ml，新鲜制备，当天使用。

（4）阿氏液（Alsever’s液）取枸橼酸0.5g、枸橼酸钠8.0g、葡萄糖20.5g、氯化钠4.2g，加水溶解并稀释至1000ml（pH6.2左右）。

根据一次采羊血需要量将该溶液分装于采血瓶中，116℃蒸汽灭菌10分钟（灭菌后，尽快释放蒸汽）。

放冷后置4℃冰箱保存备用。

（5）绵羊红细胞由绵羊颈静脉无菌采集全血适量，与等体积的阿氏液混合，无菌分装，4℃保存一周后方可使用。

（6）溶血素兔抗羊红细胞血清。

（7）豚鼠血清（补体）取10只以上豚鼠血清，混合，4℃离心除去血细胞，分装，-70℃保存，也可冻干保存。

豚鼠血清每1ml中的补体总活性应不低于100CH50。

5%羊红细胞悬液制备取绵羊红细胞适量，用明胶巴比妥缓冲液至少洗3次后，悬浮于适量明胶巴比妥缓冲液中。

取0.2ml红细胞悬液，加至2.8ml水中，待红细胞完全溶解后照紫外-可见分光光度法（附录ⅡA）在波长541nm处测定吸光度，根据下列公式，将该溶液的吸光度调节至0.62±0.01（每1ml红细胞悬液含红细胞1×109个）。

V f = V i×A————0.62式中Vi 为稀释前红细胞悬液体积，ml；A为稀释前红细胞溶解液吸光度；V f为稀释后红细胞悬液体积，ml。

专利名称：一种抗补体活性检测实验用溶血素滴定装置专利类型：实用新型专利
发明人：佘姣姣,刘利,张宝献,郭心怡,杨柳
申请号：CN201820829922.7
申请日：20180530
公开号：CN208239383U
公开日：
20181214
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本实用新型提供了一种抗补体活性检测实验用溶血素滴定装置，包括支撑板及支撑板上固定的两竖直设置的支撑杆，两支撑杆之间设有滴定管，在滴定管出口端设有依次连接的软管与缩口式导流管，其中软管通过控制组件间歇流通，导流管出口端连通有减荡管且导流管出口贴合减荡管内壁，减荡管连通有与其形成连通器的滴加管，滴加管包括多段竖直管，相邻两竖直管之间通过圆弧管过渡连接，位于最后安装位置的竖直管下端为滴加管出口端，在滴加管出口端下方设有滴定瓶，滴定瓶通过震荡组件驱动转动与震荡。

控制组件能保证溶血素滴加入羊红细胞悬液中的滴加速度，震荡组件能控制滴定瓶中羊红细胞悬液的转动、震荡频率，提高了溶血素滴定实验的重复性。

申请人：华兰生物工程重庆有限公司,华兰生物工程股份有限公司
地址：408000 重庆市涪陵区鹤凤大道66号
国籍：CN
代理机构：重庆中之信知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：张景根
更多信息请下载全文后查看。