高中生物第1章微生物技术第3课时微生物数量的测定同步备课教学案北师大版选修

⾼中⽣物第1章微⽣物技术第3课时微⽣物数量的测定同步

备课教学案北师⼤版选修

第3课时微⽣物数量的测定[学习导航] 1.阅读教材P17内容，概述测定某种微⽣物数量的⽅法和步骤。2.结合教材P15～17“测定⼟壤中微⽣物的数量”实验，掌握使⽤平板菌落计数法测定⼟壤中微⽣物的数量。[重难点击] 1.掌握测定某种微⽣物数量的⽅法和步骤。2.学会使⽤平板菌落计数法测定⼟壤中微⽣物的数量。⼀、微⽣物数量测定的⽅法和原理

微⽣物数量的测定也是重要的微⽣物技术之⼀，平板菌落计数法是⼀种应⽤⼴泛的微⽣物数

量测定⽅法。1.平板菌落计数法的原理：根据微⽣物在⾼度稀释的条件下，固体培养基上所形成的单个菌

落，是由⼀个单细胞繁殖⽽成的，即⼀个菌落代表⼀个单细胞。2.计算⽅法：从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算⽅法是：同⼀稀释度的菌

落平均数÷0.2÷稀释度×10。3.优缺点

(1)优点：能测出样品的活菌数，可⽤于微⽣物的选种与育种、分离纯化及其他⽅⾯的测定。

(2)缺点：操作烦琐、时间较长、测定值常受各种因素的影响。

4.该⽅法统计的菌落数⽐活菌的实际数⽬低，这是因为当两个或多个细胞在⼀起时，平板上观察到的只是⼀个菌落。

1.为什么分离不同的微⽣物要采⽤不同的稀释度？

答案⼟壤中各种微⽣物的数量是不同的，为获得不同类型的微⽣物，就需要按不同的稀释

度进⾏分离。2.平板菌落计数法

(1)平板菌落计数法根据操作步骤的不同可分为哪两种？

答案①涂布平板法：⽤灭过菌的涂布器将⼀定量(⼀般为0.1 mL)的适当稀释过的菌液涂布在琼脂培养基的表⾯，然后保温培养直到菌落的出现。记录菌落的数⽬并换算成每毫升样品中的活细胞的数量。②倒平板法：将已知体积(0.1～1 mL)的适当稀释过的菌液加到灭过菌的培养⽫内，然后倒⼊溶化后冷却⾄45 ℃的琼脂培养基，⽔平晃动混匀，待凝固后保温培养到出现菌落，然后与涂布平板法同样计数。(2)平板菌落计数法中换算样品的含菌数依据什么数据换算？

答案依据稀释倍数、取样接种量和菌落数。(3)每隔多少⼩时统计⼀次菌落数⽬？应选取菌落数⽬何时(稳定时或不稳定时)的记录作为结果？

答案每隔24⼩时统计⼀次菌落数⽬，选取菌落数⽬稳定时的记录作为结果。(4)统计菌落时，要求细菌和放线菌每⽫的菌落数⽬范围是多少？霉菌每⽫的菌落数⽬范围是多少？

答案若测定细菌和放线菌，要求每⽫以30～300个菌落为宜，若是霉菌则以每⽫10～100个菌落为宜。

归纳总结要使平板菌落计数法准确，需要掌握的关键步骤有：严格的⽆菌操作，否则容易被杂菌污染；稀释液要充分混匀，吸量准确，否则结果不准确；多做⼏个重复实验，减少误差。

1.⽤平板菌落计数法来统计样品中活菌的数⽬。在某稀释浓度下某同学做了若⼲个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌体数真实值的是( )A.菌落数量最多的平板

B.菌落数量最少的平板

C.菌落数量适中的平板

D.取若⼲个平板菌落数量的平均值

答案 D

解析⽤平板菌落计数法对样品中活菌数⽬进⾏统计，只是⼀种估测，根据此⽅法的实验过程可知，在某⼀稀释度下涂布的平板菌体数具有⼀定的偶然性，并不是绝对均匀，所以取若⼲个平板菌落数量的平均值⽐较接近样品中菌体数的真实值。2.若某⼀稀释度下，平板上⽣长的平均菌落数为80，涂布平板时所⽤的稀释液体积为0.1 mL，稀释液的稀释倍数为106，则每克样品中的活菌数约为( )A.8×108

B.8×107

C.8×105

D.8×106

答案 A

解析每克样品中的活菌数＝(80÷0.1)×106。⼆、⼟壤中尿素分解菌数量的测定

⼟壤中含有种类繁多的微⽣物，不同微⽣物的数量有差别，我们通过实验来测定⼟壤中尿素分解菌的数量。1.下⾯是⼟壤中尿素分解菌培养使⽤的培养基的配⽅，请分析：

成分⽤量

尿素20 g

酵母粉0.1 g

磷酸⼆氢钾9.1 g

磷酸氢⼆钠9.5 g

酚红0.01 g

琼脂20 g 加热溶解后，⽤1 mol/L NaOH溶液调pH⾄7.2～7.4，补加蒸馏⽔定容⾄1 000 mL(1)在该培养基配⽅中，为微⽣物的⽣长提供碳源的是酵母粉，提供氮源的是尿素，琼脂的作⽤是凝固剂。

(2)微⽣物要利⽤尿素需要分泌脲酶，不能分泌脲酶的微⽣物不能利⽤尿素。因此该培养基对微⽣物具有选择作⽤，其选择机制是只有能够分泌脲酶从⽽以尿素作为氮源的微⽣物才能在该培养基上⽣长。(3)细菌合成的脲酶分解尿素产⽣了氨，使培养基的碱性增强，pH上升，使酚红变⾊，菌落周围变红。可⽤来鉴定选出的菌落是不是尿素分解菌。2.结合下图分析实验过程和注意事项

步骤实验操作操作提⽰

制备培养基分别配制⽜⾁膏蛋⽩胨培养基和以

尿素为唯⼀氮源的选择培养基

⽜⾁膏蛋⽩胨培养基可以

作为对照，⽤来判断选择

培养基是否起到了选择作

⽤

制备⼟壤样品稀释液①称取⼟样10 g，放⼊盛有90 mL

⽆菌⽔并带有玻璃珠的锥形瓶中，充

分摇匀；②吸取上清液1 mL，转移⾄

盛有9 mL的⽣理盐⽔的⽆菌⼤试管

中，按照上图流程进⾏样品的稀释，

依次制成稀释度为10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6的稀释液

①应在⽕焰旁称取⼟样；

②要充分摇匀

加样取10套⽆菌培养⽫，取10－4、10－5

和10－6不同稀释度分别做3个重复平

板，留下⼀个平板做空⽩对照。每⽫

接种稀释菌液各0.2 mL

实验时要对所⽤的平板、

试管作好标记。如培养⽫

要注明培养基类型、培养

时间、稀释度、培养物等

倒平板将菌液移⼊培养⽫后⽴即倒⼊溶化

并冷却⾄45 ℃左右的尿素培养基(倒⼊量为15 mL)，平置，待凝

倒平板时要晃动培养⽫，

使菌液和培养基混合均匀

培养将涂布好的培养⽫放在37 ℃温度下培养

在⽜⾁膏蛋⽩胨培养基上

⽣长的菌落数⽬应明显多

于选择培养基上的数⽬，

才说明选择培养基有选择

作⽤

计数当菌落数⽬稳定时，选取菌落数在30～300的平板进⾏计数。在同⼀稀

释度下，⾄少对3个平板进⾏重复计

如果学⽣选取的是同⼀种

⼟样，结果相差太远，教师需要引导学⽣⼀起分析

数，然后求出平均值，并根据平板所

对应的稀释度计算出样品中细菌的

数⽬

产⽣差异的原因1.试写出测定⼟壤中尿素分解菌数量的实验流程。

答案制备尿素固体培养基→制备⼟壤样品稀释液→加样→倒平板→培养→统计菌落数→计算样品中的菌数。2.甲、⼄两位同学⽤平板菌落计数法测定同⼀⼟壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果(1)甲同学在该浓度下涂布了⼀个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？

答案不真实。为增加实验的说服⼒与准确性，应设置重复实验，在同⼀稀释度下涂布3个平板，统计结果后计算平均值。(2)⼄同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？

答案不合理。微⽣物计数时，如果实验中出现重复实验的结果不⼀致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，⽽不能简单地舍弃后进⾏计数。(3)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。

平板

稀释度

平板1 平板2 平板310－3320 360 356

10－4212 234 287

10－521 23 18

答案10－4的稀释度下取0.1 mL涂布的三个平板上的菌落数在30～300之间，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244。进⼀步可以换算出1 g样品中活菌数为244÷0.1÷10－4×10＝2.44×108。(4)为什么统计的菌落数⽐活菌的实际数⽬低？答案当两个或多个细菌连在⼀起时，平板上观察到的只是⼀个菌落。3.微⽣物数量测定的实验设计

(1)如果平板上长出的菌落不是均匀分散的，⽽是集中在⼀起，可能的原因有哪些？

答案菌体密度太⼤；倒平板后没有⽴即摇匀；平板冷凝⽔太多。(2)同⼀个稀释度的3个平板上的细菌的数⽬应该⽐较接近，如果长出的菌落数差别较⼤，可能的原因有哪些？

答案取样不准确；稀释不均匀；倒平板操作时培养基温度差别较⼤等。(3)实验中的⽆菌操作主要有哪些？

答案①培养基、锥形瓶、试管、铲⼦、信封等，需要进⾏灭菌。②称取⼟壤要在⽕焰旁进⾏。③稀释⼟壤溶液的每⼀步操作都要在⽕焰旁进⾏。

归纳总结分离尿素分解菌操作中的注意事项(1)在实验操作中，每个步骤都要注意⽆菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。

(2)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30～300个菌落，这个稀释度细菌⼀般

为104、105、106倍稀释液，放线菌⼀般为103、104、105倍稀释液，真菌⼀般为102、103、104倍稀释液。(3)为排除⾮测试因素(培养基)的⼲扰，实验需设置⽜⾁膏蛋⽩胨培养基进⾏空⽩对照。

(4)每⼀稀释倍数的菌液都⾄少要涂布3个平板，作为重复实验，求其平均值，若其中有菌落数与其他平板悬殊过⼤的，需要对该平板重新制作。

3.如图为“⼟壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释⽰意图。据图分析下列叙述正确的是( )

A.4号试管中稀释液进⾏平板培养得到的菌落平均数⼀定恰为5号的10倍

B.5号试管的结果表明每克该⼟壤中的菌株数⽬为1.7×108个

C.在⽤移液管吸取菌液进⾏梯度稀释时，可⽤⼿指轻压移液管上的橡⽪头，吹吸三次，使菌液与⽆菌⽔充分混匀

D.某⼀稀释度下⾄少涂布3个平板，该实验⽅法统计得到的结果常会⽐实际活菌数⽬⾼

答案 C4.⾃然界中的微⽣物往往是混杂⽣长的。⼈们在研究微⽣物时⼀般要将它们分离提纯，然后进⾏数量的测定。下⾯是对⼤肠杆菌进⾏数量测定的实验，请回答有关问题。(1)实验步骤

①制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。

②为了得到更加准确的结果，应选⽤__________法接种样品。

③适宜温度下培养。

(2)结果分析

①测定⼤肠杆菌数⽬时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下⼏种统计结果，与事实更加接近的是__________。