黑曲霉葡萄糖淀粉酶I基因的克隆及在酵母中的表达

产外切葡聚糖酶黑曲霉的筛选鉴定及其基因在毕赤
酵母中的表达的开题报告
一、选题背景及意义
葡聚糖（Chitin）是一种广泛分布于大自然中的多糖类物质，它在生命活动中具有重要的作用。

例如，葡聚糖是真菌、节肢动物外壳和卵壳的主要组成成分，同时在细菌和植物细胞壁中也含有葡聚糖。

因此，葡聚糖酶作为一种特殊的酶，能够在分解葡聚糖和调节其代谢过程中发挥关键作用。

目前，产葡聚糖酶黑曲霉具有较高的应用价值，因此对其筛选鉴定及其基因在毕赤酵母中的表达具有重要意义。

二、研究内容和目的
本研究的内容主要包括产葡聚糖酶黑曲霉的筛选鉴定以及其基因在毕赤酵母中的表达。

通过对黑曲霉产葡聚糖酶能力进行鉴定与筛选，筛选出高效的葡聚糖酶生产菌株，并利用PCR扩增等相关技术对葡聚糖酶基因进行克隆和检测，进而在毕赤酵母中进行表达分析，探索最佳表达条件并实现葡聚糖酶的高效表达。

三、方法和步骤
（1）黑曲霉产酶能力的筛选鉴定
选取黑曲霉菌株进行培养，筛选出产酶能力较强的细胞株，并进行质量评估。

（2）葡聚糖酶基因的克隆和检测
利用PCR扩增技术克隆葡聚糖酶基因，并使用地温反转录酶-聚合酶链式反应技术检测葡聚糖酶基因的存在。

（3）基因在毕赤酵母中的表达
将克隆得到的葡聚糖酶基因转化到毕赤酵母中，探索最佳表达条件，并对葡聚糖酶的基因表达和蛋白质合成情况进行分析和评估。

四、预期结果和意义
通过本研究的鉴定和分析，能够筛选出高效的葡聚糖酶生产菌株并
实现葡聚糖酶基因的高效表达，同时也能为生物制造领域的相关生产提
供重要的理论指导和技术支持。

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及在毕赤酵母中分泌表达朱龙宝;汤斌;陶玉贵;葛飞;魏胜华;陈涛;李婉珍【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2012(031)009【摘要】为大规模制备β-葡萄糖苷酶,构建重组酵母工程菌,实现β-葡萄糖苷酶的分泌表达.根据已报道黑曲霉(A spergillus niger)β-葡萄糖苷酶cDNA序列设计一对引物,采用RT-PCR扩增,获得黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl).构建了pMD-18T-bgl克隆载体,bgl亚克隆到质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-bgl.经BglⅡ线性化后电转入Pichia pastoris GS115,经过MD、YPD/G418平板筛选阳性克隆,获得分泌表达重组P.pastoris GS115的工程菌.用终体积分数1％的甲醇对其进行诱导表达,SDS-PAGE和酶活测定结果表明,重组毕赤酵母分泌了1个相对分子质量约90000的蛋白质,与该酶基因产物的理论值一致.酶催化的最适温度为50℃,最适pH 5.5,其酶活达到38 U/mL,比已报导重组酶产酶水平有较大程度的提高.【总页数】5页(P973-977)【作者】朱龙宝;汤斌;陶玉贵;葛飞;魏胜华;陈涛;李婉珍【作者单位】安徽工程大学生化学院,安徽芜湖241000;安徽工程大学生化学院,安徽芜湖241000;安徽工程大学生化学院,安徽芜湖241000;安徽工程大学生化学院,安徽芜湖241000;安徽工程大学生化学院,安徽芜湖241000;安徽工程大学生化学院,安徽芜湖241000;安徽工程大学生化学院,安徽芜湖241000【正文语种】中文【中图分类】Q785【相关文献】1.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆 [J], 闫会平;吴兴泉;陈士华;刘昌雄2.葡萄穗霉中β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析 [J], 于海玲;李树伟;王华明3.葡枝根霉TP-02cDNA文库中两种新的β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 [J], 汤斌;丁丽霞;潘海波;汤文晶;张凤琴4.黑曲霉ZF-34脂肪酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达 [J], 苟万晓; 范延超; 吕昂; 胡元森5.黑曲霉β-甘露聚糖酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达 [J], 章亭洲;王碧娇;林路成;徐志伟;陆梦甜;易蒲红;吴石金因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达曾庆梅;魏春燕;靳靖;吴聪;黄博英【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2011(032)017【摘要】以黑曲霉Aspergillus niger基因组DNA为模板,PCR扩增出酸性α-淀粉酶的结构基因,将此基因插入载体pPIC9K,重组质粒pPIC9K-asAA转化毕赤酵母SMD1168,并通过G418平板培养基筛选高拷贝转化子。

在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,酸性α-淀粉酶大量表达并分泌到胞外,该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,摇瓶培养中,2%甲醇诱导培养168h后酶活力达到最大值2838U/mL。

SDS-PAGE结果显示该重组酶的分子质量为58kD。

该酶的最适反应pH值为4.0,在pH3.0～6.0之间酶活力基本保持稳定,最适反应温度为70℃,在工业生产常用温度50℃条件下,该酶能够长时间保持稳定,并具有较高的酶活力。

重组毕赤酵母遗传稳定性良好。

【总页数】6页(P219-224)【作者】曾庆梅;魏春燕;靳靖;吴聪;黄博英【作者单位】合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥230009;合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥230009;合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥230009;合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥230009;合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥230009【正文语种】中文【中图分类】Q814.4【相关文献】1.黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母中的克隆和表达 [J], 汤斌;钱鹏2.黑曲霉中葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 [J], 刘虎军;罗玮;范新蕾;余晓斌3.耐酸性黑曲霉β-甘露聚糖酶的克隆及其在毕赤酵母中的表达分析 [J], 张娟;罗长财4.黑曲霉ZF-34脂肪酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达 [J], 苟万晓; 范延超; 吕昂; 胡元森5.黑曲霉β-甘露聚糖酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达 [J], 章亭洲;王碧娇;林路成;徐志伟;陆梦甜;易蒲红;吴石金因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

收稿日期:2008-12-25基金项目:内蒙古自治区优秀学科带头人计划项目(20050802)作者简介:安玉麟(1954-),男,内蒙古土默特右旗人,研究员,硕士生导师,主要从事作物栽培、育种研究工作。

黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及其蛋白产物的Western blot 分析安玉麟1,孙瑞芬1,张鹤龄2,郭树春1,闫素丽3(1.内蒙古农牧业科学院生物技术中心,内蒙古呼和浩特 010031;2.内蒙古大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特 010021;3.内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特 010019)摘要:为进一步研究黑曲酶中国株3.758葡萄糖氧化酶(GOD)在大肠杆菌中的表达水平和条件,将黑曲霉中国株3.758的葡萄糖氧化酶(GOD)基因定向克隆于原核表达载体pE T 11a 上,构建了融合表达的重组质粒pE T/GO,转化E.coli B L21(DE3)plysS,用IPTG 诱导,超声波粉碎细菌细胞,SDS PAGE 电泳检测,GOD 基因获得了表达,表达的融合蛋白相对分子质量为66.5kDa 。

用市售葡萄糖氧化酶免疫家兔获得抗血清,酶联法(ELISA)测定其效价为106,West ern blot 分析证明表达的融合蛋白与兔抗GOD 血清有较强的特异性,为黑曲霉3.758葡萄糖氧化酶(GOD)抗体的制备奠定了基础。

关键词:黑曲霉3.758;葡萄糖氧化酶基因;融合表达;抗血清;ELISA;Wes tern blot 中图分类号:TQ920.1 文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2009)04-0084-04Prokaryotic Expression and Western blot Analysis of Glucose OxidaseGene from Aspergillus nigerAN Yu lin 1,SUN Rui fen 1,Z HANG He ling 2,GUO Shu chun 1,YAN Su li 3(1.Biotechnology Research Center,Inner Mongolia Academy of Agriculture and Husbundary Sciences,Huhhot 010031,China;2.College of Life Science,Inner Mongolia University,Huhhot 010021,China;3.Agricultural College of Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010019,China)Abstract:In order to further study e xpressed level and condition of Glucose oxidase (GOD)from As pergillus niger 3 758in E.coli ,the coding region of GOD from A.niger 3.758was inserted into the prokaryotic e xpression vector pE T 11a,and the recombinant plasmid was transformed into E.coli B L21(DE3)plysS.The result of SDS PAGE showed that the GOD gene was e xpressed by IPTG induction,and the molecular weight of the fusion protein was about 66.5kDa.An tiserum was produced in rabbit immunized with commercial GOD,and ELISA analysis proved that the titer of this antibody was 106.The Western blotting result confirmed that the antibody reacted specifically to the e xpressed fusion protein.The study established basis for preparation of GOD antibody from Aspergillus niger 3.758.Key words:As pergillus niger 3.758;Glucose oxidase gene;Fusion expression;Antiserum;ELISA;Western blot 葡萄糖氧化酶( D glucose:oxygen 1 oxidoreduc tase EC1.1.3.4,简称GOD),催化 D 葡萄糖氧化生成 葡萄糖酸酯和O 2,O 2被还原生成H 2O 2( D glu cose+O 2 glucose lactone+H 2O 2)[1]。

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的克隆及序列分析赵林果;周潭澈;李迅;余世袁【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2007(24)11【摘要】通过设计特异性引物,以黑曲霉总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得了预期大小的基因片断.将目的基因使用pMD18-T载体转化到大肠杆菌,质粒PCR鉴定表明已成功克隆了黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因.测序结果表明,获得的目的基因片段大小为2583 bp.该序列与GenBank中的β-葡萄糖苷酶基因序列相比,核苷酸序列同源性达98.88%、氨基酸序列同源性达99.77%.同时,通过PCR技术扩增,获得了去除信号肽的反应产物,大小为2500 bp左右.该结果为目的基因在毕赤酵母中能够使用载体上的信号肽序列进行分泌表达奠定了基础.【总页数】5页(P53-57)【作者】赵林果;周潭澈;李迅;余世袁【作者单位】南京林业大学化学工程学院,江苏,南京,210037;南京林业大学化学工程学院,江苏,南京,210037;南京林业大学化学工程学院,江苏,南京,210037;南京林业大学化学工程学院,江苏,南京,210037【正文语种】中文【中图分类】Q785【相关文献】1.黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及在毕赤酵母中分泌表达 [J], 朱龙宝;汤斌;陶玉贵;葛飞;魏胜华;陈涛;李婉珍2.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆 [J], 闫会平;吴兴泉;陈士华;刘昌雄3.黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 [J], 李泰明;庄舰峰;Jean Louis Didier MEKOO;谷春娇;邢芸;刘景晶4.黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 [J], 周晓明;莫隽颖;陶冶;付水林;宫衡5.黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl1)的克隆及其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达[J], 黄妙容;阳建辉;刘德武;黄晓灵;蔡更元;吴珍芳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

黑曲霉bgl基因在毕赤酵母中的表达研究
陈士华;耿瑞凡;薛珍;吴兴泉
【期刊名称】《河南工业大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2010(031)005
【摘要】为构建具有分泌黑曲霉β-葡萄糖苷酶活力的酵母工程菌,探讨β-葡萄糖苷酶基因(bgl基因)在酵母菌中的表达情况.克隆了黑曲霉bgl基因的cDNA片段,利用质粒pPICZαA构建了该基因的酵母表达载体,经线性化后采用电穿孔法转入毕赤酵母菌中.以甲醇为诱导物进行诱导培养,检测结果表明黑曲霉bgl基因已成功转入酵母菌中并可正常表达,重组蛋白具有β-葡萄糖苷酶水解活性,在诱导培养72 h 后,发酵液的酶活力可达到0.78 U/mL.
【总页数】4页(P42-45)
【作者】陈士华;耿瑞凡;薛珍;吴兴泉
【作者单位】河南工业大学,生物工程学院,河南,郑州,450001;河南工业大学,生物工程学院,河南,郑州,450001;河南工业大学,生物工程学院,河南,郑州,450001;河南工业大学,生物工程学院,河南,郑州,450001
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.3
【相关文献】
1.黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母GS-115系统中的表达 [J], 康伟;王智;詹冬玲;雷霆;冯雁
2.黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母中的克隆和表达 [J], 汤斌;钱鹏
3.黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母SMD1168中的表达 [J], 陈楠;肖成建;范新蕾;李汉广;余晓斌
4.黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中的高效表达 [J], 王强;徐义兵;郭春和;黄毓茂
5.黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达及产酶条件的优化 [J], 廖兆民;蔡俊;林建国;杜馨;王常高
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黑曲霉糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母X33中的表达曹慕琛;徐健勇;罗立超;张同存;孙劭靖;宋诙【摘要】[目的]以毕赤酵母(Pichia pastoris)X33为宿主菌高效表达黑曲霉(Aspergillus niger)糖化酶,为进一步扩大糖化酶在工业上的应用奠定基础.[方法]利用RT-PCR技术,提取黑曲霉总RNA进行反转录,以得到的cDNA为模板,根据NCBI数据库中A.niger CBS513.88糖化酶的cDNA序列(glaA)设计引物,通过PCR扩增得到去除天然信号肽的糖化酶成熟肽编码基因glaAm,并将其克隆到pUC19载体中,序列分析表明,glaAm的开放阅读框由1 879个核苷酸组成,编码625个氨基酸.以此片段构建了pFLDα-glaAm重组表达载体,经Nsi I线性化后,电击转化毕赤酵母X-33.摇瓶培养中通过添加终浓度为0.5%的甲醇诱导糖化酶的分泌.[结果]SDS-PAGE和Starch-PAGE显示,糖化酶得到正确的分泌表达,且具有较高的生物活性,发酵上清液中酶活最高达到380.78 U/ml(发酵液).重组糖化酶的最适反应温度和最适pH分别为60～65℃和4.0,在pH 2.5～5.5范围内均保持90%以上的酶活力.该酶具有较高的热稳定性,pH 4.0条件下,该酶在50℃下稳定;60℃处理60 min,仍能保持90%以上的酶活力;65℃下的半衰期约为44 min.[结论]黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中得到了异源高效表达.%[ Objective ] The aim was to lay the foundation to further expand the application of glucoamylase in the industry for using P. pa storis X-33 as the host strain to express the glucoamylase gene from A. niger. [ Methods ] Amplified gene of glucoamylase from total RNA of A. niger mycelium by RT-PCR technology.A pair of primers were designed and synthesized according to the cDNA sequence of the glaA gene from A. niger CBS 513.88 in NCBI database (GenBank Accession No. XM_001390493). Sequence analysis revealed thatglaAm had an open reading frame of 1879 bp,which encoded a putative polypeptide of 625 amino acids and the theoretical molecular mass was 67 kD. The amplified fragment was cloned into pUC19 to generate the recombinant expression vector pFLDα-glaAm containing the mature glucoamylase encoding gene free of the signal peptide. The recombinant plasmid pFLDα-glaAm was transformed into P. pastoris X33 through electroporation after linearized by Nsi I digestion. The recombinant P. pastoris X33/pFLDα-glaAm were screened in 2％ soluble starch plates,and identified by PCR. In shaking culture condition, methanol was added to a final concentration of 0.5％ to induce the secretion of glucoamylase.[ Result ] The SDS-PAGE and Starch-PAGE analysis revealed that the recombinant glucoamylase was secreted and expressed correctly in P. pastoris X33, and the expressed product had the normal bioactivity. The enzyme activity in the medium reached 380.78 U/ml after being induced by methanol for 96 h. The recombinant glucoamylase exhibited optimum catalytic activity at pH 4.0 and 60 - 65 ℃ respecti vely. It was thermostable at 50 ℃ and remained more than 90％ of its original activity after 60 min at 60 ℃. The half-life was about 44 min at 65 ℃. [Conclusion] These results confirmed that A. niger glucoamylase was highly-effectively expressed in P. pastoris X33.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)014【总页数】6页(P8226-8230,8306)【关键词】毕赤酵母;糖化酶;热稳定性;异源表达【作者】曹慕琛;徐健勇;罗立超;张同存;孙劭靖;宋诙【作者单位】天津科技大学生物工程学院,教育部工业微生物重点实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津,300457;天津工业生物技术研究所,基因工程与微生物应用技术研究组,天津,300308;天津工业生物技术研究所,基因工程与微生物应用技术研究组,天津,300308;中国农业大学生物学院,北京,100093;天津科技大学生物工程学院,教育部工业微生物重点实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津,300457;天津科技大学生物工程学院,教育部工业微生物重点实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津,300457;天津工业生物技术研究所,基因工程与微生物应用技术研究组,天津,300308;天津工业生物技术研究所,基因工程与微生物应用技术研究组,天津,300308【正文语种】中文【中图分类】S188+.1糖化酶(EC3.2.1.3)又被称为葡萄糖淀粉酶或γ-淀粉酶，是一种具有外切酶活性的酸性糖苷水解酶，可以将淀粉、糊精或糖原等从非还原末端依次水解α-1，4-糖苷键，最后得到终产物β-D葡萄糖;此外，它也可以少量地水解α-1，6和α-1，3糖苷键，是水解淀粉产生葡萄糖的主要酶类［1］。

黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母中的表达钱鹏;汤斌【摘要】从黑曲霉eDNA文库中筛选出糖化酶基因，并在酿酒酵母中进行表达．阳性克隆在发酵培养基中培养60h后，产生的糖化酶酶活力达到峰值为4．3U／mL．测定结果显示其糖化酶大小为1908bp，编码636个氨基酸残基组成的蛋白质．酶学性质分析显示该酶的最适反应温度为50℃，pH为5．0．经柱分离纯化其发酵上清液后，SDS-PAGE电泳方法，测得它的分子量大约为70kD，且条带清晰．%An expression cDNA library was constructed from aspergillus niger, then glucoamylase gene was isolated and efficiently expressed in S. cerevisiae. The results showed that the maximum activity of glucoamylase was 4.2 U/mL when cultivated for 60 h. Sequence analysis revealed that glucoamylase had 1 908 bp,which encodes a putative polypeptide of 636 amino acids. The enzyme proerties showed that the optimum pH and temperature was 5.0 and 50 ℃, the expressed protein was purified from the fermented supernatant using DEAE clumon and determined by SDS-PAGE. The results of SDS-PAGE also showed that the molecular weights of the enzyme was 70 kDa.【期刊名称】《安徽工程大学学报》【年(卷),期】2012(027)002【总页数】4页(P1-3,7)【关键词】黑曲霉;糖化酶;酿酒酵母;表达【作者】钱鹏;汤斌【作者单位】安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽芜湖241000;安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽芜湖241000【正文语种】中文【中图分类】Q93糖化酶又名糖化型淀粉酶.其系统名称为淀粉α－1，4－葡萄聚糖水解酶.其是一种胞外外切酶，主要是从淀粉链的非还原性末端切开α－1，4－键和α－1，6－糖苷键连接的非还原端，将葡萄糖水解下来，而得到终产物葡萄糖［1］.传统酿酒酵母不能直接利用淀粉进行发酵，发酵前必须将淀粉转化成葡萄糖后才能被其利用［2］.通过现代生物技术构建可直接利用淀粉的工业酵母对酒精生产行业具有十分重要意义，有利于简化发酵工序、降低成本、减少能耗，具有良好的应用前景［3］.因此，越来越多的学者开始利用分子生物学手段对A.niger葡萄糖淀粉酶的基因进行克隆、转化、表达的研究［4］.本文利用基因手段将工厂用高产黑曲霉糖化酶基因引入酿酒酵母中，构建出能够利用淀粉的酿酒酵母工程菌.1 材料与方法1.1 菌株，质粒和引物黑曲霉，安徽工程大学生物化学工程学院保存.含有EcoR I酶切位点的锚定引物5＇－（GA）10 GAATC（T）18 V－3＇，上海生物工程技术服务公司合成.p YES2、酿酒酵母INVSC1来自Invitrogen公司.基因操作相关的酶和试剂盒均来自Ta KaRa公司.凝胶成像系统（GDS－8000，美国UVP公司），高速冷冻离心机（Beckman），电泳仪（日本ATTO公司）.1.2 培养基活化培养基：1.2%葡萄糖，0.2%KH 2 PO4，0.05%MgSO4，0.04%Na H 2 PO4，0.1%NH 4 NO3，0.1%微量元素（1.1%ZnSO4，0.1%FeSO4，0.6%MnSO4，0.03%CoCl2，4%CuSO4，0.06%H 3 BO3 p H 5.8.）［5］.糖化酶酶诱导培养基：用0.1%葡萄糖和1%淀粉代替活化培养基中1.2%葡萄糖，其他成分不变.LB培养基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，p H 7.0.YPD培养基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖.筛选培养基：淀粉10%，（NH 4）2 SO4 0.5%，KH 2 PO4 0.1%，MgSO4 0.05%，CaCl2 0.01%，酵母粉0.02%，2%半乳糖作为诱导剂，2%琼脂.发酵培养基：淀粉10%，（NH 4）2 SO4 0.5%，KH 2 PO4 0.1%，MgSO40.05%，CaCl2 0.01%，酵母粉0.02%，2%半乳糖作为诱导剂.1.3 实验方法（1）黑曲霉mRNA的提取.活化培养基培养黑曲霉培养72 h后转入诱导培养基中.诱导时间达到60 h，离心收集菌体.灭菌生理盐水洗涤菌体2次，液氮研磨后用m RNA抽提纯化试剂盒提取m RNA.（2）cDNA双链合成.以黑曲霉m RNA为模板，经反转录合成双链c DNA，用连接试剂盒将获得双链cDNA与含有Not I酶切位点的接头连接.再用Not I、EcoR I酶酶切双链cDNA.（3）p YES2质粒抽提及双酶切.挑取含p YES2的大肠杆菌TOP10单菌落接于5 mL的LB培养基中（含50μg/mL Amp），37℃，250 r/min培养12～14 h.用碱裂解法提取p YES2质粒［6－7］.根据Takara限制性内切酶应用手册，用限制性内切酶Not I和EcoR I对质粒进行双酶切.（4）阳性克隆筛选.连接经双酶切后的cDNA和p YES2质粒，将重组质粒通过电转化的方法转入酿酒酵母INVSC1感受态细胞中，培养2～3 d直到在筛选培养基获得阳性克隆.采用碘熏染法鉴定分泌糖化酶的转化子［8］.（5）糖化酶酶活检测.将重组菌株接种到25 mL发酵培养基中，在30℃和转速180 r/min的条件下发酵不同时间取样，取离心后上清液作为粗酶液，测糖化酶酶活.酶活单位定义在40℃，p H 4.6的条件下，1 h水解可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖所需要的酶量，为一个酶活单位（U）［9］.（6）重组表达酶的性质分析.分析在不同p H值和温度条件下重组酿酒酵母分泌表达糖化酶的性质.（7）发酵液中酒精含量的测定.气相色谱法（GC）法［10］.（8）纯化和SDS－PAGE电泳.重组酿酒酵母发酵培养60 h，离心取上清.用硫酸铵浓缩后，得到的沉淀用20 m M的磷酸盐缓冲溶液溶解和透析，用DEAE柱子进行纯化，纯化产物用SDS－PAGE方法检测［11］.2 结果与讨论2.1 阳性克隆的筛选如图1所示，经碘熏染阳性克隆后出现3个明显的水解透明圈，证明重组酿酒酵母能够分泌表达糖化酶.编号所有的阳性克隆且将其保存在10%的甘油溶液中.图1 碘熏染法检测阳性克隆水解淀粉透明圈2.2 重组质粒的酶切鉴定利用Not I和Eco R I对获得重组质粒进行双酶切，如图2所示，经1%的琼脂糖凝胶电泳后，发现除质粒外，还出现大小约为2 kd（糖化酶糖酶基因表达元件大小）的一条新增带，说明目的基因已转入重组质粒中.图2 重组质粒经Not I和Eco R I双酶切2.3 测序及序列分析提取阳性克隆测序.测定结果显示其糖化酶大小为1908 bp，经NCBI比对与Aspergillus nigerCBS 513.88糖化酶基因相似率达到98%.2.4 重组酿酒酵母糖化酶酶活为了研究重组酿酒酵母的糖化酶活，在发酵培养基中培养阳性克隆，并每隔12 h测其糖化酶酶活.如图3所示，重组酿酒酵母的糖化酶在60 h时达到最大峰值4.3 u/mL.将获得的阳性克隆子接种于YPD培养基中，30℃振荡扩大培养24 h后，按10%的接种量转种于发酵培养基中（30℃，180 r/min），定时取样测酒精含量.由图4可知，重组酿酒酵母的酒精生产能力在144 h后趋于稳定，酒精生产率峰值为3.5%.2.5 重组酿酒酵母糖化酶酶性质的研究重组糖化酶分别在30℃～70℃的条件下保温2 h，测其酶活变化曲线.由图5可知，重组糖化酶的最适反应温度为50℃，随着温度的升高，酶活迅速下降.在30℃～60℃之间酶活保持50%以上.其p H考察范围为3～10.由图6可知，重组糖化酶的最适反应p H为5.0，在p H 3～6酶活力保持在80%以上.2.6 SDS－PAGE电泳分析重组酿酒酵母分泌表达糖化酶柱纯化后，对纯化产物进行SDS－PAGE电泳.由图7可知，重组酿酒酵母分泌蛋白的分子量约为70 k D，条带单一、清晰.利用DNAstar软件对测序获得结果分析可知，糖化酶基因共编码636个氨基酸，分子量理论值约为70 KD，因此推断该带是重组酿酒酵母分泌表达的糖化酶蛋白.图3 重组酿酒酵母糖化酶酶活图4 重组酿酒酵母酒精生产曲线图5 重组酿酒酵母糖化酶酶活随温度变化图6 重组酿酒酵母糖化酶酶活随p H变化3 结论从DNA转录、翻译到后期加工水平的各种因素都是蛋白高水平分泌表达的必要条件［12－13］.在起始条件下，要结合具体目的蛋白的表达情况，找到该蛋白表达水平的特定限制因素.例如：引入强启动子、成熟的分泌信号肽等［14－15］，才能为异源蛋白的表达提供良好的条件.本研究利用cDNA表达文库的方法分离出黑曲霉的糖化酶基因，成功构建酿酒酵母工程菌.重组酿酒酵母的酒精生产能力为3.5%.在发酵培养基中培养60 h，重组酿酒酵母产生的糖化酶酶活力达到峰值为4.3 U/mL.测定结果显示，其糖化酶基因大小为1 908 bp，编码636个氨基酸残基组成的蛋白质.SDS－PAGE电泳显示重组蛋白的分子量约70 k D，该酶在最佳发酵温度为50℃，最佳反应p H为5.0.图7 重组酿酒酵母糖化酶分子量参考文献：［1］钟浩，谭兴和，熊兴耀，等.黑曲霉固态发酵产糖化酶的研究［J］.中国酿造，2009（1）：26－29.［2］吴晓萍，李文清，罗进贤，等.α－淀粉酶和糖化酶的表达及酿酒酵母工程菌的构建［J］.中山大学学报，1999，38（2）：81－83.［3］李海燕，毛爱军，何永志.黑曲霉糖化酶和木聚糖酶基因在工业用酿酒酵母中的共表达［J］.菌物学报，2004，23（4）：494－501.［4］崔锦，柯涛，马向东.淀粉酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究［J］.河南农业大学学报，2006，40（3）：311－314.［5］楼士林，扬盛昌，龙敏南，等.基因工程［M］.北京：科学出版社，2001：374－378.［6］ Friederik，Manger－Jacob.Isolation and sequencing of a new glucoamylase gene from an Aspergillus niger aggregate strain（DSM 823）molecularly classified as Aspergillus tubingensis［J］.Antonie van Leeuwenhoek，2005，88：267－275.［7］ Jason W，Martin J，Florian W.Extraction of plasmid DNA using reactor scale alkalinelysis and selective precipitation for scalable transient transfection［J］.Cytotechnol，2001，35：165－173.［8］ Li X，Jin H，Wu Z，et al.An automated process to extract plasmid DNA by alkaline lysis［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，75：1 217－1 223.［9］罗进贤，李政海，李文清.大麦ɑ－淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌［J］.中国科学，1998，28（1）：50－53.［10］马丽娜，陈喜文，陈德富，等.曲霉属糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达［J］.南开大学学报：自然科学版，2007，24（4）：415－418.［11］陈中碧.玉米秸秆燃料乙醇发酵前处理工艺条件的优化研究［D］.芜湖：安徽工程科技学院，2009.［12］萨姆布鲁克，拉塞尔.分子克隆实验指南［M］.北京：科学出版社，2002：1 713－1 720.［13］顾园，诸欣平，王少华，等.毕赤酵母表达蛋白质的糖基化［J］.生命的化学，2004，24（2）：353－355.［14］刘增然.利用淀粉的酿酒酵母工程菌的构建［D］.成都：四川大学，2004. ［15］Shi－Hwei Liu，Wei－I Chou，Chia－Chin Shen.Improved secretary production of glucoamylase in Pichia pastoris by combination of genetic manipulations［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2005，326：817－824.。