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黑曲霉葡萄糖淀粉酶I基因的克隆及在酵母中的表达

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一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因及其高效表达方法[发明专利]

一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因及其高效表达方法[发明专利]
申请人：江南大学 地址：214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号 国籍：CN 代理机构：北京汇信合知识产权代理有限公司 代理人：陈圣清 更多信息请下载全文后查看
Байду номын сангаас
专利内容由知识产权出版社提供
专利名称：一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因及其高效表达方法 专利类型：发明专利 发明人：吴敬,刘旭,吴丹,陈坚 申请号：CN201310095971.4 申请日：20130322 公开号：CN10314 6726A 公开日：20130612
摘要：本发明公开了一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶aglu及其在毕赤酵母中的高效表达方法。所述优化 的α-葡萄糖苷酶基因核苷酸序列如SEQ ID No1所示。所述基因构建到毕赤酵母表达载体并与二硫键 异构酶基因转化入毕赤酵母中共表达，在3L罐上诱导110h后酶活达力可到10.1U/mL，是优化前的 2.9倍，可用于α-葡萄糖苷酶的工业化生产。

黑曲霉_葡萄糖苷酶的筛选_克隆及表达

黑曲霉_葡萄糖苷酶的筛选_克隆及表达
15 ( 3 ): 423~426 应用与环境生物学报 2009， Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X
2009-06-25 DOI: 10.3724/SP.J.1145.2009.00423
黑曲霉β-葡萄糖苷酶的筛选、 克隆及表达*
唐德芳1, 2 裴小琼1 李晓璐1 胡 承 2 陈 军3** 吴中柳1**
1.6 bgl1基因的克隆和序列分析
将 PCR 扩增产物纯化后连接到 pMD18-T克隆载体上， 转 化到 E. coli DH5α 感受态细胞 . 筛选得到含bgl1基因的阳性克 隆， 进行酶切鉴定和送 Invitrogen公司序列测序分析. 序列已 保存在 NCBI GenBank， 收录号为FJ431207.
反向引物为 FTAR： 5'-TTAGTGAACAGTAGGCAGAGACG-3'. 第 一步反转 录 反 应 组 成 为： 1 µ L 10 mmol/L dNTP、1 µ L 2.5 µ mol oligdT Primer、 1 µ L 黑曲霉 FTA-008总 RNA及 7 µ L ddH2O； 混合物在 65 °C下处理 5 min后冷却到 4 °C； 然后加入4 µL 5×Prime ScriptTM Buffer、 0.5 µL 40 U/µL Rnase inhibitor、 0.5 µL Rtase及 5 µL ddH 2O， 混匀后在 42 °C下处理 20 min后冷却 到 4 °C. 第二步 PCR反应为50 µL体系， 其中含有5 µL 10×PCR buffer、2 µL dNTP (10 mmol/L each)、 10 µmol引物各 0.5 µL、 0.5 µL 5 U/µL TaKaRa Ex TaqTM HS和 5 µL反转录反应液 . 反应 条件： 94 °C 30 s； 58 °C 30 s； 72 °C 3 min； 30个循环. PCR产物 用1%琼脂糖凝胶电泳检测并用回收试剂盒回收约 2.5 kb片段 .

黑曲霉糖化酶基因克隆及在酿酒酵母中的表达

黑曲霉糖化酶基因克隆及在酿酒酵母中的表达
刘加 爱 ， 陈 蕾， 林 元 山， 张小鹃 ， 邹 洪彬 ， 张 学 文
（ 湖 南 农 业 大 学 生 物科 学技 术 学 院 ， 湖南 长沙 ４ １ ０ １ ２ ８ ）
摘要： 为 了 以酿 酒 酵母 ￥ ７ ８为 宿 主 菌 异 源 高 效 表 达 糖 化 酶 基 因 ， 进 一步 扩大糖 化酶 基因在 工业 生产上 的应用 。
（ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｂ ｉ ｏ ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｂ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｈ ｕ ｎ ａ ｎ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｓ ｈ ａ ４ １ ０ １ ２ ８ ）
● Ｃ Ｔ ●
Ｉ Ｉ Ｂ Ｒ Ｉ ＣＵ Ｌ Ｔ Ｕ Ｒ Ｉ Ｉ Ｅ 华 北 农 学 报 ・ ２ ０１ ７， ３ ２（ ６）： ｌ ２ １ 一 ｌ ２ ５
Ｂ Ｏ Ｒ Ｅ Ｉ ＫＩ － ｜ Ｉ Ｈ Ｉ ％
黑 曲霉 糖 化 酶 基 因克 隆及 在 酿 酒 酵 母 中 的表 达
￥ ７ ８中成 功 表 达 并 能 有 效 分 泌 到 细胞 外 。
关键词 ： 黑曲霉 ； 糖化 酶 ； 酿酒酵母 ； 异 源 表 达
中 图分 类 号 ： Ｑ ７ ８ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ０— ７ ０ ９ １ （ ２ ０ １ ７ ） Ｏ ６— ０ １ ２ ｌ一 ０ ５
运用 Ｒ Ｔ ． Ｐ Ｃ Ｒ法 从 黑 曲霉 中 克 隆 得 到 糖 化 酶 基 因 （ ｇ ｌ ａ Ａ） ｃ Ｄ Ｎ Ａ， 去 除 其 信 号 肽 编 码 区 后 的 序 列 重 组 到 酵 母 表 达 载 体 ｐ Ｖ Ｔ １ ０ ２ Ｕ ／ ｃ ｔ Ａ Ｄ Ｈ １强 启 动 子 下 游 ， 并 与 ｄ因 子 分 泌 肽 信 号 序 列 融 合 。用 Ｐ Ｅ Ｇ ／ Ｌ ｉ Ａ ｃ法 将 构 建 的重 组 表 达 载 体 转 入 酿பைடு நூலகம் 酒酵母 ￥ ７ ８菌株 ， 筛 选 出 的转 化 菌 点 种 到 可 溶 性 淀 粉 平 板 上 培 养 ， 用 碘 染 法 鉴 定 重 组 基 因 的 表 达 情 况 。鉴 定 出 了 典

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

表达检测其蛋 白表达形式 和活性 ， 为构建食 品级载体做准备 。
基金项 目： 国家 自然科学基金（ ｏ ０ ７ ５０ ３ ８ ２９ ） 中央高校基本 国家重点实验室 ＭＥ Ｑ Ｎ ７ ２７ ， ７ ３３ ； ３ ０ Ｋ Ｏ博士构 建 的 ｐ Ｉ９ ．Ｇ２质 粒为模 ＰＣ Ｋ １ １ ３ 科研业务费专项资金资助（ ｏ Ｋ ２ ０ ０ １ Ｊ Ｑ ０９ ２ ） Ｎ Ｙ ０ ９ ２ ， ２０ ０ ２ Ｊ Ｋ
关于黑 曲霉 Ｂ葡 萄 糖苷 酶 基 因 的研 究 报道 仍 然 较 少 ］ 一 。
本课题 将 黑 曲 霉 的 Ｂ葡 萄 糖 苷 酶 基 因 （ ｅ Ｂ ｎ ． Ｇ ｎ ａｋ登 录 号
Ｅ ２ ３ ８ ． ） 隆到 原 核表 达 载 体 ｐ Ｔ２ ａ上 ， Ｕ３７８１ 克 Ｅ ．８ 转化 Ｅ ｃｌ ． ｏ ｉ Ｂ２１ Ｄ ３ 进行 ， Ｉ （Ｅ ） 运用 Ｃ ｌ ９培养基 筛 选 阳性 克隆 ， ｅ— Ｍ 并诱 导
的是丝状真菌 ， 主要为曲霉属和木霉属 ， 而细菌 中研究较 多的 是芽孢杆菌属 Ｊ 。 研究表 明， 黑曲霉 是 Ｂ葡 萄糖 苷酶 酶活 较高 的菌株 ， 一 但
２ ０ｍ ，２ ℃ 高压蒸 汽灭 菌 １ ｎ ２ ０ｍｌ１ｍｏ ・ Ｍｇ ０ ｌ１ １ ５ｍｉ） ０ ， ｌＬ ．
Ｂ ｌ ｌ１ｎｔ ｇｎ ａｍ ｎ ｙＰ Ｒ， ｌｎｄｉｔ ｐ Ｔ２ ａｖｃ ｒ ｎ ａｓ ｒ ｄｉｔ Ｅ ｃｌＢ ２ Ｄ ３ ， ｃｅｎｄｃ ｎ ｓ ｙＣ ｌ ｇ ｆ １ ｅｇ ｅｅｆ ｇ ｅ ｔ Ｃ ｃｏｅ ｏ Ｅ －８ ｅｔ ｄｔ ｎｆ ｍｅ ｏ ．ｏ Ｌ １（ Ｅ ） ｓｒｅ ｅ ｌ ｅ ｂ ｅ ２ ｕ． ｈ ｒ ｈ ｎ ｏａ ｒ ｏ ｎ ｉ ｏ —
ｐ Ｔ２ ａ载体 ， Ｅ ．８ 转化 Ｅ ｃｌＢ２１ Ｄ ３ ，ｅ． ９培养基筛选 阳性克 隆， Ｄ Ａ测序分析 ， ．ｏ Ｉ （ Ｅ ） ｃ １ ｉ Ｍ 经 Ｎ 成功构建 ｐ Ｔ ８ ・ｇ Ｅ ２ ａＢ ｌ 达载体 。Ｓ Ｓ ２表 Ｄ— ＰＧ Ａ Ｅ显示 ， 重组菌经 ＩＴ Ｐ Ｇ诱导后表达 了 目的蛋 白 ， 其相对 分子质量 与预期 结果相符 。结果 Ｓ ＳＰ Ｇ Ｄ ．Ａ Ｅ显示蛋 白以包涵体形式表达 ， 克隆可用 ｅ ｌ ９培养基筛选 。结论 ｅＭ －

产外切葡聚糖酶黑曲霉的筛选鉴定及其基因在毕赤酵母中的表达的开题报告

产外切葡聚糖酶黑曲霉的筛选鉴定及其基因在毕赤酵母中的表达的开题报告

产外切葡聚糖酶黑曲霉的筛选鉴定及其基因在毕赤
酵母中的表达的开题报告
一、选题背景及意义
葡聚糖（Chitin）是一种广泛分布于大自然中的多糖类物质，它在生命活动中具有重要的作用。

例如，葡聚糖是真菌、节肢动物外壳和卵壳的主要组成成分，同时在细菌和植物细胞壁中也含有葡聚糖。

因此，葡聚糖酶作为一种特殊的酶，能够在分解葡聚糖和调节其代谢过程中发挥关键作用。

目前，产葡聚糖酶黑曲霉具有较高的应用价值，因此对其筛选鉴定及其基因在毕赤酵母中的表达具有重要意义。

二、研究内容和目的
本研究的内容主要包括产葡聚糖酶黑曲霉的筛选鉴定以及其基因在毕赤酵母中的表达。

通过对黑曲霉产葡聚糖酶能力进行鉴定与筛选，筛选出高效的葡聚糖酶生产菌株，并利用PCR扩增等相关技术对葡聚糖酶基因进行克隆和检测，进而在毕赤酵母中进行表达分析，探索最佳表达条件并实现葡聚糖酶的高效表达。

三、方法和步骤
（1）黑曲霉产酶能力的筛选鉴定
选取黑曲霉菌株进行培养，筛选出产酶能力较强的细胞株，并进行质量评估。

（2）葡聚糖酶基因的克隆和检测
利用PCR扩增技术克隆葡聚糖酶基因，并使用地温反转录酶-聚合酶链式反应技术检测葡聚糖酶基因的存在。

（3）基因在毕赤酵母中的表达
将克隆得到的葡聚糖酶基因转化到毕赤酵母中，探索最佳表达条件，并对葡聚糖酶的基因表达和蛋白质合成情况进行分析和评估。

四、预期结果和意义
通过本研究的鉴定和分析，能够筛选出高效的葡聚糖酶生产菌株并
实现葡聚糖酶基因的高效表达，同时也能为生物制造领域的相关生产提
供重要的理论指导和技术支持。

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及在毕赤酵母中分泌表达

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及在毕赤酵母中分泌表达

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及在毕赤酵母中分泌表达朱龙宝;汤斌;陶玉贵;葛飞;魏胜华;陈涛;李婉珍【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2012(031)009【摘要】为大规模制备β-葡萄糖苷酶,构建重组酵母工程菌,实现β-葡萄糖苷酶的分泌表达.根据已报道黑曲霉(A spergillus niger)β-葡萄糖苷酶cDNA序列设计一对引物,采用RT-PCR扩增,获得黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl).构建了pMD-18T-bgl克隆载体,bgl亚克隆到质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-bgl.经BglⅡ线性化后电转入Pichia pastoris GS115,经过MD、YPD/G418平板筛选阳性克隆,获得分泌表达重组P.pastoris GS115的工程菌.用终体积分数1％的甲醇对其进行诱导表达,SDS-PAGE和酶活测定结果表明,重组毕赤酵母分泌了1个相对分子质量约90000的蛋白质,与该酶基因产物的理论值一致.酶催化的最适温度为50℃,最适pH 5.5,其酶活达到38 U/mL,比已报导重组酶产酶水平有较大程度的提高.【总页数】5页(P973-977)【作者】朱龙宝;汤斌;陶玉贵;葛飞;魏胜华;陈涛;李婉珍【作者单位】安徽工程大学生化学院,安徽芜湖241000;安徽工程大学生化学院,安徽芜湖241000;安徽工程大学生化学院,安徽芜湖241000;安徽工程大学生化学院,安徽芜湖241000;安徽工程大学生化学院,安徽芜湖241000;安徽工程大学生化学院,安徽芜湖241000;安徽工程大学生化学院,安徽芜湖241000【正文语种】中文【中图分类】Q785【相关文献】1.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆 [J], 闫会平;吴兴泉;陈士华;刘昌雄2.葡萄穗霉中β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析 [J], 于海玲;李树伟;王华明3.葡枝根霉TP-02cDNA文库中两种新的β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 [J], 汤斌;丁丽霞;潘海波;汤文晶;张凤琴4.黑曲霉ZF-34脂肪酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达 [J], 苟万晓; 范延超; 吕昂; 胡元森5.黑曲霉β-甘露聚糖酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达 [J], 章亭洲;王碧娇;林路成;徐志伟;陆梦甜;易蒲红;吴石金因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达曾庆梅;魏春燕;靳靖;吴聪;黄博英【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2011(032)017【摘要】以黑曲霉Aspergillus niger基因组DNA为模板,PCR扩增出酸性α-淀粉酶的结构基因,将此基因插入载体pPIC9K,重组质粒pPIC9K-asAA转化毕赤酵母SMD1168,并通过G418平板培养基筛选高拷贝转化子。

在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,酸性α-淀粉酶大量表达并分泌到胞外,该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,摇瓶培养中,2%甲醇诱导培养168h后酶活力达到最大值2838U/mL。

SDS-PAGE结果显示该重组酶的分子质量为58kD。

该酶的最适反应pH值为4.0,在pH3.0～6.0之间酶活力基本保持稳定,最适反应温度为70℃,在工业生产常用温度50℃条件下,该酶能够长时间保持稳定,并具有较高的酶活力。

重组毕赤酵母遗传稳定性良好。

【总页数】6页(P219-224)【作者】曾庆梅;魏春燕;靳靖;吴聪;黄博英【作者单位】合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥230009;合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥230009;合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥230009;合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥230009;合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥230009【正文语种】中文【中图分类】Q814.4【相关文献】1.黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母中的克隆和表达 [J], 汤斌;钱鹏2.黑曲霉中葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 [J], 刘虎军;罗玮;范新蕾;余晓斌3.耐酸性黑曲霉β-甘露聚糖酶的克隆及其在毕赤酵母中的表达分析 [J], 张娟;罗长财4.黑曲霉ZF-34脂肪酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达 [J], 苟万晓; 范延超; 吕昂; 胡元森5.黑曲霉β-甘露聚糖酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达 [J], 章亭洲;王碧娇;林路成;徐志伟;陆梦甜;易蒲红;吴石金因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母中的表达

ｐＨ ． ．） ． ５８ ［
糖 化 酶酶诱 导 培养 基 ： ０ １ 葡 萄糖 和 １ 淀 粉代 替活 化培 养基 中 １ ２ 葡 萄糖 ， 用 ．％ ．％ 其他 成分 不变． Ｌ Ｂ培养基 ： 白胨 １ ， 蛋 酵母 粉 ０ ５ ， Ｃ ， Ｈ ７ ０ ． Ｎａ １ １ ｐ ． ． Ｙ Ｄ培养 基 ： Ｐ １ 酵母 膏 ， 蛋 白胨 ， 葡萄 糖． ２ ２ 筛 选 培养基 ： 粉 １ ， ＮＨ ） Ｓ ０ ５ ， Ｏ４ ． ， Ｓ ０ ０ ， ａ １ ０ ０ ， 母粉 淀 ０ （ 。 Ｏ ． ％ ＫＨ Ｐ １ Ｍｇ Ｏ ． ５ Ｃ Ｃ ｚ ． １ 酵 ０ ０ ０ ， ％ 半 乳糖 作 为诱 导剂 ， 琼脂 ． ．２ ２ ２ 发 酵 培养基 ： 淀粉 １ ， ＮＨ ） Ｓ ０ ５ ， Ｏ ． ， Ｓ ０ ０ ， ａ １ ０ ０ ， ０ （ Ｏ ． ＫＨ Ｐ ０ １ Ｍｇ Ｏ ． ５ Ｃ Ｃ ｚ ． １ 酵母 粉
第 ２ ７卷第 ２期 ２１ ０ ２年 ６月 文章 编 号 ： ６ ２ — ７ （ ０ ２ ０ — ０ １ ０ １ ７ ２４ ７ ２ １ ） ２ ０ ０ — ４
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大． ７ Ｎｏ ２ １２ ． ．
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＡｎ ｕ ｌｔｃ ｎｃＵｎｖ ｒｉ ｏ ｒ ａ ｈ ｉ ｏ Ｐｏｙｅ ｈ ｉ ｉｅｓｔ ｙ
基 酸 残 基 组 成 的 蛋 白质 ． 学性 质 分 析 显 示 该 酶 的 最 适 反 应 温 度 为 ５ 酶 Ｏ℃ ， Ｈ 为 ５ ０ 经 柱 分 离 纯 化其 发 酵 上 ｐ ．．
清 液 后 ，Ｄ － Ａ Ｓ ＳＰ ＧＥ电 泳 方 法 ， 得 它 的 分 子 量 大 约 为 ７ Ｄ， 条 带 清 晰 ． 测 ０ ｋ 且
关 键 词 ： 曲霉 ； 化 酶 ； 黑 糖 酿酒 酵 母 ； 达 表 文 献 标 识码 ： Ａ

曲霉属糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

摘 要 ： 黑 曲霉 、 花 果 曲 霉 、 曲 霉 中提 取 总 Ｒ 从 无 米 ＮＡ， Ｔ—Ｃ 分 别 获 得 其 糖 化 酶 基 因 ， 得 序 列 在 Ｇ ｎ Ｒ ＰＲ 所 ｅ— Ｂｎ ａｋ数 据 库 中 注册 ， 册 号 分 别 为 Ａ ５ ６７ ＡＹ６２ ２ 注 Ｙ６ ２ １ 、 ４ １０和 Ｄ １ ９ １Ｂ ＡＳ 分 析 显 示 ， 隆 的 曲 霉 属 糖 化 Ｑ２ １７ ． Ｌ Ｔ 克 酶 基 因 与 Ｇ ｎ ａｋ数 据库 相应 序 列 同源 性 很 高． 这 些 糖 化 酶 基 因 与 表 达 载 体 ｐ Ｉ 重 组 后 ， ｅＢ ｎ 将 ＰＣ９ 电转 化 进 毕 赤 酵 母 株 Ｇ ｌ５ 均 获 得 了 分 泌 表 达 糖 化 酶 的酵 母 工 程 菌 株 ． Ｓ１， 甲醇 诱 导 ７ ２ｈ后 ， 化 酶 的 分 泌 量 达 到 最 高 ， 别 为 糖 分 （ １ ６ ． ） （２ ４ ０２ 和 （Ｏ Ｏ ． ） ｍＬ Ｓ ＳＰ ＧＥ显 示 ， 泌 表 达 的糖 化酶 分 子 量 均 约 为 ８ Ｄ ． １ ． 士０ ２ 、１ ． ± ． ） １ ． 士ｏ ２ Ｕ／ ． Ｄ — Ａ 分 ０ｋ ａ
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第４７年 １ 期 ２０ 第月 ０鲞 ． ０ Ｏ
Ａ ｔ ｃｅｔ ｒｍ 大 ｔｒｌ报（ 然 ｓ口ｉ 口ｅｓ ｃａＳ ｉ ｉ ｕ 学学 Ｕ ｒｉ 版） ｎ 南 开 Ｎａ ａｉ ａ 自 科学ｔ Ｎａ ｉｎｉ ｉ ｔ
Ｖ １４ Ｎ ５ ｏ．０ Ｏ ＿
３ Ｏ％＿ ， ２ 但结构 上大体 可分 为 Ｉ （ ） Ⅱ型 （ ］ 型 ＧＡ Ｉ 和 ＧＡⅡ） 两种 ． ＧＡ Ｉ由催 化域 （ａａｙｉ ｄ ｍａｎ Ｃ 、 ｃｔｌｔ ｏ ｉ ， Ｄ） 淀 ｃ
粉结 合域 （ｔｒｈｂｎ ｉｇｄ ｍａｎ Ｓ Ｄ） 连接 Ｃ 与 Ｓ Ｄ 的 Ｏ 糖基化 连接域 （ —ｌｃ ｓ ｌｔｄｌ ｋ ｒｄ — ｓａｃ ｉｄｎ ｏ ｉ ，Ｂ 及 Ｄ Ｂ 一 Ｏ ｇｙ ｏ ｙａｅ ｉ ｅ ｏ ｎ ｍａ ） ３个功 能域组成 ， Ａ Ⅱ ｉ 等 ｎ Ｇ 相对ＧＡ Ｉ 而言 仅缺少 Ｓ Ｄ［． Ｂ １ ］

黑曲霉菌为宿主菌的重组表达性质粒的构建

的黑曲霉菌 DE3F 基因的部分序列片段为探针作两次噬菌斑原位杂交， 从黑曲霉菌 2K 的 (>2 片段， 将其中含 DE3F 基因的 ’ 6 %JK 片段亚克隆至表达性载体 G7F< 中， 获得重组质 粒。对克隆基因进行了全基因测定和分析。以黑曲霉菌 2IHH !’"@& 的 DE3F 缺陷株 LM@ 为受体菌， 用聚乙二 醇 N 氯化钙方法作基因转化实验， 将重组质粒导入该受体菌并在其中表达。结果 从黑曲霉菌 2I该基因的重组表达性载体 DOF ! 6 ’。序列分析表明该基因与黑曲霉 菌 P!!’ 的 DE3F 基因编码序列的同源性为 &% 6 &Q ， 两者经推导的氨基酸的同源性为 &# 6 &Q 。重组质粒 DOF 成为 GE3 R 。结论 ! 6 ’可使黑曲霉菌 2IHH !’"@& 的 DE3F 缺陷株 LM@ 发生基因转化， 础上成功构建了以 DE3F 基因为选择标志， 以黑曲霉菌为宿主菌的重组表达性质粒。 在克隆了 DE3F 基因的基
［ !， ’］ 用 。国内至今尚缺乏这方面的报道。为了将外
（ 、 表达性质 2IHHlt; 和非表达性质粒 D21 @ 6 （ ! 含 2 6 /+T.3 2IHH 也 由 该 所 提 供。质 粒 在 &"’& 菌 株 的 DE 3F 基 因） 用 Z+)T./ 质粒抽提试剂 ! " #$%& (Y M #中进行扩增， 盒 （ Z+)T./，H3)?U.E J+/ T ,:[） 进行提取和纯化。 ! "# DE 3F 基 因 的 克 隆 先 以 D21@ 6 ! 为 模 板 作 该片段含 DE 3F 基 GH= 扩增获得 S""KD(>2 片段，
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参考文献 : [ 1 ] Rood J I ,Cole S T. Molecular genetics and pathogenesis of Clostridium per2 fringens [J ] . Microbiol Rev ,1991 ,55 (4) :621 - 648.
[2 ] Gibert M ,Jolivet - Renaud C , Popoff M R , et al . Beta2 - toxin , a novel
toxin produced by Clostridium perfringens [J ] . Gene ,1997 ,203 :65 - 73. [3 ]许崇波 ,许崇利 ,刘哲 ,等. C 型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与 表达[J ] . 微生物学通报 ,2005 ,32 (1) :62 - 66. [4 ]许崇波 ,许崇利 ,朱永宁 ,等. C 型产气荚膜梭菌β1 毒素基因表达 [J ] . 生物技术 ,2004 ,14 (5) :17 - 18. [5 ]许崇波 ,王玉炯 ,卫广森 ,等. C 型产荚膜梭菌β1 毒素基因克隆与 核苷酸序列分析[J ] . 中国预防兽医学报 ,1999 ,21 (2) :111 - 114.
PCR 扩增仪 ( Gene Amp PCR System 9600) ,PERKIN - ELMER 公司 ;高速冷冻离心机 ,日本 KUBOTA ;DNAΠRNA 定量仪 ,瑞典 Pharmacia Biotech 公司生产 ; - 70 ℃超低温冰箱 ,SANYO 公司 ; 凝胶电泳仪 ,北京六一仪器厂 。 1. 2 方法 1. 2. 1 引物设计 :根据已知的黑曲霉葡萄糖淀粉酶 I 基因序 列[3] 和表达载体 pPIC9 的多克隆位点 ,利用 DNAsis 设计一对 扩增 葡 萄 糖 淀 粉 酶 I 基 因 的 引 物 , 上 游 引 物 为 5′- TACG2 TAGCGACCTTGGATTCATGGTT - 3′,带有 SnaB Ⅰ位点 ;下游引物 为 5′- GCGGCCGCACTATAGCGAAATGGATTGAG - 3′, 带有 Not Ⅰ位点 。
Secretory Expression of GAI Gene of Aspergillus niger in Pichia pastoris
GUO De - jun1 ,LIU Zeng - shan2
(1. Food College of Heilongjiang August First Land Reclamation University ,Daqing 163319 ;2. Jilin University ,Changchun 130062 ,China)
黑曲霉葡萄糖淀粉酶 I 基因的克隆及在酵母中的表达 郭德军1 ,柳增善2
(1. 黑龙江八一农垦大学食品学院 ,黑龙江 大庆 163319 ;2. 吉林大学和平校区 ,吉林 长春 130062) 摘要 :采用 RT - PCR 技术 ,从黑曲霉的菌丝体 RNA 中扩增出葡萄糖淀粉酶 GAI 的结构基因 ,将其连接到 pPIC9 载体中 ,转入
第 15 卷第 2005 年 10
5期 月
:3
生 物 技 术 BIOTECHNOLOGY
Vol115 ,No15 :3 Oct12005
核糖体结合位点 ( RBS) ,在β2 毒素基因的 3′端有一段能形成 发卡环结构的反向重复序列 ,构成一个不依赖ρ因子的转录 终止子 。β2 基因产物编码 265 个氨基酸 ,其中 N - 末端的 30 个残基构成疏水性区域 (6～26 位残基) ,形成一跨膜区 ,这 30 个氨基酸为信号肽序列 。成熟蛋白起自 31 位的赖氨酸 (Lys) 共编码 235 个氨基酸 。β2 毒素基因与β1 毒素基因或其它已知 的产气荚膜梭菌基因序列没有明显的同源性 。免疫学实验表 明 ,抗β2 毒素的抗体能识别纯化的β2 毒素 ,并能与β1 毒素发 生弱反应 。相反 ,抗β1 毒素的抗体只能与β1 毒素反应 ,而不 能与β2 毒素发生反应 ,表明β1 毒素与β2 毒素的免疫相关性较 差 ,其机理尚不清楚 。我们现已克隆和表达了α、和β1 毒素基 因[3 - 5] ,如今又表达了β2 毒素基因 ,其表达水平占菌体总蛋白 相对含量的 13. 26 % ,为下一步研制α、β1 和β2 毒素多价基因 工程亚单位苗提供了理想基因材料 。
DNA 凝胶回收试剂盒购自北京鼎国生物公司 ;T4 DNA 连接酶 、 各种限制性内切酶 (SnaB Ⅰ、Not Ⅰ、Bgi Ⅱ) 购自 TaKaRa 公司 ,反 转录酶 AMV、Taq plus 购自 Sangon 公司 。 1. 1. 2 培养基
黑曲霉液体发酵培养基 :0. 05 % KH2 PO4 ,0. 05 % MgSO4 ,
fect of multiple copies and prefer codon on efficiency of secretory expression was also discussied in detail. etc.
Key words : Aspergillus niger ; Glucoamylase I ; Pichia pastoris ;secretory expression 黑曲霉葡萄糖淀粉酶是一种酸性糖蛋白 ,具有外切酶活 6 %玉米淀粉 ,1. 5 %玉米浆 ,pH3. 0 。LB 培养基 、YPD 培养基 、
1 材料与方法
1. 1 材料 1. 1. 1 实验材料
黑曲霉 T - 21 、DH5α为本室保存菌株 , Pichia pastoris 表达 系统购 自 Invitrogen 公 司 ; 总 RNA 提 取 试 剂 盒 购 自 Promega ,
MD 培养基 、MM 培养基 、BMMY 和 BMGY 培养基配方及配制方 法见 Invitrogen 公司 pPIC9 载体使用说明 。 1. 1. 3 仪器
[6 ] Henricus L , Klaasen B M ,Molkenboer J C H , et al . Detection of the alpha
- toxin gene of Clostridium perfringens in diarrhoeic piglets in the Netherlands
Abstract :Amplified gene of Glucoamylase I from total RNA of Aspergillus nigerπs mycelium by RT - PCR technology. Inserted it into pPIC9 vector . Then we transformed the recombinant plasim into Pichia pastoris GS115 by electroporation ,and got 12 strains of Muts. The activity of Glucoamy2 lase I was maximum 180UΠml in BMMY medium by methanol induction. Glucoamylase I account for 38 % of total protein in media supernate. Ef2
力的淀粉水解酶 ,从淀粉 、及其相似聚合物的非还原末端催化 水解α- 1 ,4 糖苷键和α- 1 ,6 糖苷键 ,释放β- D - 葡萄糖 。葡 萄糖淀粉酶是由多个域组成的 ,催化部位是通过 o - 糖基化链 与淀粉结合区域相连接 。在工业上 ,葡萄糖淀粉酶被广泛应 用于人造葡萄糖和果葡糖浆的生产 ,具有极高的商业价值 [1] 。 作者欲充分利用毕赤酵母菌具有较高糖基化能力 ;向细胞体 外分泌较少蛋白质 ,易提取表达产物[2] ; 生长速度比黑曲霉 快 ,易大规模工业化培养等特性 ,通过分子生物学技术 ,为在 酵母中高效分泌表达葡萄糖淀粉酶 I 探索一条新的途径 。
1. 2. 2 RT - PCR 扩增 : 第一步 ,黑曲霉保藏菌种经查氏斜面 培养基活化后 ,接种于 100ml 灭菌的黑曲霉液体发酵培养基 中 ,加少量玻璃珠 ,220rΠmin、30 ℃,培养 66 - 70h ,以其为实验材 料 ,利用总 RNA 提取试剂合提取黑曲霉的总 RNA。第二步 ,以 总 RNA 为模板 ,以下游引物进行反转录 ,获得 cDNA 第一条 链 。65 ℃热变性 5min ,冰浴 ,然后加入反转录酶 ,置于 PCR 仪
巴斯德毕赤酵母 GS115 中 ,获得 12 株 Muts 重组酵母 ;甲醇诱导目的蛋白分泌表达 ,葡萄糖淀粉酶酶活最高达 180UΠml ,占上清液 蛋白的 38 %。通过 GAI 在巴斯德毕赤酵母中的表达 ,重点讨论了目的基因拷贝数 ,基因的偏爱性等对外源基因分泌表达的影响 。
关键词 :黑曲霉 ;葡萄糖淀粉酶 ;毕赤酵母 ;分泌表达 中图分类号 :Q786 ;Q785 文献标识码 :A 文章编号 :1004 - 311X(2005) 05 - 0003 - 03
4 生 物 技 术 第 15 卷第 5 期
的片段 。将回收产物连接到 p GEM - T 载体上 ,转化 DH5α感 受态菌 ,利用α互补法进行阳性克隆的6 - 14 ;修回日期 :2005 - 08 - 04 作者简介 :郭德军 (1968 - ) ,男 ,硕士 ,副教授 ,从事食品微生物及生物 制药的研究 ;柳增善 (1959 - ) ,男 ,博士 ,教授 ,博士生导师 ,从事食品 安全及生物制药的研究 。
中 ,30 ℃10min ,42 ℃1h ,94 ℃2min。再以反转录产物为底物 , PCR 扩增目的基因 ,反应条件为 :94 ℃ 3min 热变性 ;94 ℃ 30s , 54 ℃50s ,72 ℃2min ,40 个循环 ;72 ℃延伸 10min。反应结束后 , 经琼脂糖凝胶电泳 ,用 DNA 凝胶试剂盒回收大约 1. 9kb 的目
New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1989. 1 - 50. [ 8 ]Meacock P A ,Cohen S N. Partitioning of bacterial plasmids during cell divi2 sion : a cis - acting locus that accomplishes stable plasmid inheritance [ J ] . Cell ,1980 ,20 (2) :529 - 542. [ 9 ]Steinporsdottir V ,Fridriksdottir V , Gunnatsson R , et al . Expression and pu2 rification of Clostridium perfringens beta - toxin glutathione S - transferase fu2 sion protein[J ] . FEMS Microbiol Letters ,1995 ,130 :273 - 278.