朱砂的微生物浸出及其朱砂药效、毒性的重新评价
- 格式：pdf
- 大小：437.57 KB
- 文档页数：9
将 1.0g 粒径不大于 74μｍ的朱砂粉末置于灭菌后的 250mL 锥形瓶中，加入灭 菌后的 9Ｋ无铁液体培养基 90mL，用硫酸调 pH 至 1.75，待 pH 稳定后，接种体积 分数为 10%的 At.f 菌和质量分数为 1%的 FeSO4·7H2O，无菌对照中加入 1%的 FeSO4·7H2O。称取质量后，在 30℃、振荡速度为 120r/min 时摇瓶浸出 25 天。实验 过程中采用 1:1（体积比）的硫酸调节 pH 值，用蒸馏水补充所蒸发的水分。定时取 样用电感耦合等离子体发射光谱（ICP-AES）法测定溶液中的汞离子浓度。并将浸 出末期的矿液抽滤，分成两部分：矿渣 X-ray 分析备用，矿液用细菌滤器过滤除菌 和进一步除去残渣，药效学研究备用。 2.2 矿渣的X-ray衍射分析
3 结果与分析 3.1.微生物对朱砂的浸出效果
浸出液中汞的含量/μg.ml-1
0.30
无菌酸体系
0.25
氧化亚铁硫杆菌
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00 0
5
10
15
20
25
浸出时 间/天
图 1 氧化亚铁硫杆菌处理和无菌酸体系中汞离子随时间的变化
从图 1 可以看出：在无菌酸体系中，矿石的氧化率要比加菌时低得多，浸出 25 ｄ后，溶液中汞的含量只有 0.057μg/ml，而加了 At.f 菌却达到 0.282μg/ml，增加了 将近 4 倍。 3.2 微生物浸出液元素分析
用ICP-AES分析朱砂浸出液中的元素发现：氧化亚铁硫杆菌处理过的朱砂浸出 液中存在大量的微量元素，而且大部分元素含量较无菌酸体系有很明显的上升，显 示氧化亚铁硫杆菌对朱砂中的微量元素有很强的溶出作用。例如元素As，无菌体系 溶出很少，仅0.0192μg/ml，而细菌处理则高达0.3635μg/ml，增加了18倍左右。另外 不加菌的溶液中没有Cu、Mn，而加了菌的则分别为0.203μg/ml和3.116μg/ml。
无菌酸体系中的K元素含量比氧化亚铁硫杆菌处理体系中K元素含量要高出很 多。显示在氧化亚铁硫杆菌浸出过程中，氧化Fe2+形成黄钾铁钒沉淀KFe3 (SO4) 2 (OH) 6，从而使得K大量的减少，这与Toro 等的研究是一致的[24]。
－4－
另外一个独特的现象是无菌酸体系中Zn元素含量远远高于细菌处理，我们推测 是氧化亚铁硫杆菌在浸出过程中利用了Zn元素，但缺乏直接的实验证据。
朱砂的微生物浸出及其朱砂药效、毒性的重新评价1
苏丽春，李红玉* （兰州大学干旱与草地生态教育部重点实验室，兰州大学生命科学学院 甘肃 兰州 730000，*通讯作者）
摘要：论文研究了氧化亚铁硫杆菌对朱砂的浸出作用和其浸出液对小鼠的镇静安神作用。 实验显示氧化亚铁硫杆菌对朱砂具有浸出作用；同时实验显示：服用朱砂浸出液5天后（服用汞 总量≤0.2μg），小鼠各组织器官内未检测出汞，但朱砂浸出液却对小鼠水合氯醛和戊巴比妥钠睡 眠催眠有明显促进作用，并且呈现剂量依赖关系。以上结果表明朱砂浸出液可在十分安全的剂 量下行使朱砂的镇静安神功效，从而展现出巨大的应用前景。
1甘肃省科技攻关项目资助 *通讯作者。Tel：13519640428；E-mail：lihy@
－1－
题[5]。 近年来一个较大的进展是制备朱砂超微颗粒[6]和纳米级粉体[7]，这些技术的使
用与传统的炮制工艺相比较，在一定的程度上增加了朱砂的溶出特性，从而使朱砂 的吸收、分布、生物利用度、药效等方面都得到了不同程度的提高。但这类处理仍 然只能以混悬液入药，尚存在口服引起的胃肠道刺激，服用困难等问题，加之生产 纳米朱砂需要大型设备和先进的技术，普及使用尚有困难[8]。
昆明种小鼠，雄 180 只，体重（20±2）g，由兰州生物制品所实验动物研究中 心提供。
－2－
1.4 仪器： 电感耦合等离子发射光谱（ICP-AES）仪，型号：IRIS ER/S；X-ray 衍射仪：
D-max/2400。
2 方法 2.1 朱砂浸出液的制备
元素含量 元素含量
200
空白
150
处理
100
50
0 Mg
p
K
元素
3.0
2.5
空白
2.0
处理
1.5
1.0
0.5
0.0
Ca
Al As Ba Cd Co Cu Mn Pb Se Zn Hg
元素
图 2 朱砂浸出液中的各种元素
3.3 矿渣的 X-ray 射分析
500
400
300
C
200
C
C At.f菌处理后的的朱砂
关键词：微生物浸出，朱砂。
The Bioleaching of Cinnabar and the Re-evaluation on the Potency and Toxicity of Cinnabar
Abstract: It is discussed Acidithiobacillus ferrooxidans leaching on the cinnabar and some pharmacological effects of cinnabar on central nervous system in this paper. Bioleaching process with At.f can leach 0.282ppm of solubility mercury in 25 days. After the rats taking orally 5 days (total mercury ≤0.2μg), it was found to have synergistic interaction with pentobarbital sodium and chloral hydrate in sedative activity depending on the concentration of total mercury. But mercury was not found in the tissue. The results show that the lixivium of cinnabar have the same sedative activity and have understanding effect.
但大剂量不管是和空白组还是和朱砂组相比，都有显著性差异（P<0.01）。
3.5 对水合氯醛催眠作用的影响的结果如下表：
由于以上种种难以克服的问题，在中药制药业出现了一种规避朱砂的趋势，许 多药物因此失去了中医的精髓和原有特色[9, 10]。
目前，一项生物高新技术-微生物冶金技术异军突起[11-13]。在一定的空气、pH、 温度条件下，一些特殊的细菌（氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌等）可将不溶性的 硫化矿转变为可溶性的矿石浸出液，然后对所需元素进行回收[14-16]。该技术的最大 特点是简单、高效、低成本、无污染、条件温和，因而在世界冶金业得到广泛推崇 和应用，目前世界铜产量的30％已来自微生物冶金技术[17]。
将浸出末期的矿液抽滤得到的矿渣，反复用去离子水冲洗，并放于烘箱中烘干 至恒重，用于X-ray衍射分析[20]。衍射条件：工作电压40Kv，电流60mA，扫描范围 0-180°，扫描速度10°/min。 2.3 朱砂浸出液对戊巴比妥钠阈下催眠剂量影响[10, 21]
选用昆明种小鼠，♂，体重（20±2）g，随机分为6组，10只/组。分别以不同剂 量的朱砂浸出液给各个给药组灌胃，对照组分别以同体积的处理空白和朱砂悬浮液 灌胃，1 次/天，连续5天。均于末次给药后30min腹腔注射戊巴妥钠35mg/kg，翻正 反射消失达1 min 以上记为发生睡眠，计算各组睡眠发生率。 2.4 朱砂浸出液对水合氯醛阈下催眠作用的影响[10, 21]
朱砂是典型的硫化矿，HgS 占 96%以上[1-5]，恰好满足微生物冶金技术的应用 条件。
根据以上原理，本实验室提出应用微生物冶金技术对硫化物矿物药进行创新性 炮制的新思路，并进行了较为系统的研究。目前已利用具有自主知识产权的菌种顺 利的实现了雄黄、朱砂、自然铜在温和条件下的浸出，制备出了各自相应的微生物 浸出液[18, 19]。初步的实验结果显示朱砂溶解液可在十分安全的剂量下行使朱砂镇静 安神的功效，从而展现出巨大的应用前景。
－5－
3. 4 对戊巴比妥钠阈下催眠剂量影响的结果如下表：
组别
表1 朱砂浸出液与戊巴比妥钠阈下催眠剂量协同作用的研究
小鼠数
剂量
睡眠发生率
大剂量组
10
相当于0.2398μg朱砂（可溶性汞0.2067μg）
100%12
中剂量组
10
相当于朱砂0.1798μg朱砂（可溶性汞0.1550μg）
－3－
将2.3的小鼠于末次给药做完试验后处死，取其心、肝、脾、肺、肾、大脑消化 后ICP-AES测定其总汞含量。消化方法参照2005年中国药典[22]。 2.7 Fe2+测定
Fe2+采用邻菲罗啉比色法[23]。 2.8 统计方法
数据以x ±s 表示，采用SPSS 11.5 软件进行t检验，以P < 0.05 为显著性差异。
分组与给药同 2.3，并于末次给药后 30min 腹腔注射水合氯醛 0.4g/kg，翻正反 射消失达 1 min 以上记为发生睡眠，计算各组睡眠发生率。 2.5 朱砂浸出液对戊巴比妥钠阈上催眠剂量影响[10, 21]
分组与给药同2.3，并于末次给药后30min腹腔注射戊巴妥钠50mg/kg，记录从注 射时间到翻正反射消失时间（睡眠潜伏期）和翻正反射开始消失至恢复的时间（睡 眠时间）。 2.6 朱砂浸出液中的汞在体内的分布
Key words: bioleaching, cinnabar.
朱砂（Cinnabar）是常用的重镇安神药，在中药中具有举足轻重的地位，但朱 砂在实际使用中却面临着诸多难题[1]。首先，由于朱砂使用量大、而且其中汞含量 很高，常有使用朱砂造成不良反应，甚至引起死亡的报道，致使含朱砂类中药的声 誉受到严重影响[2]。其次，由于朱砂极其难溶，故很少见到对朱砂各种作用形态（成 分）、作用机制、参与中成药组方机理等重大基础问题的系统相关研究[3, 4]。再者， 由于朱砂常以未溶解状态的粗糙矿物原粉入药，一方面造成用量大、毒性严重招标， 另一方面也会引起口服病人的胃肠道刺激，以及药物的吸收及药效的发挥困难等问
3 结果与分析 3.1.微生物对朱砂的浸出效果
浸出液中汞的含量/μg.ml-1
0.30
无菌酸体系
0.25
氧化亚铁硫杆菌
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00 0
5
10
15
20
25
浸出时 间/天
图 1 氧化亚铁硫杆菌处理和无菌酸体系中汞离子随时间的变化
从图 1 可以看出：在无菌酸体系中，矿石的氧化率要比加菌时低得多，浸出 25 ｄ后，溶液中汞的含量只有 0.057μg/ml，而加了 At.f 菌却达到 0.282μg/ml，增加了 将近 4 倍。 3.2 微生物浸出液元素分析
用ICP-AES分析朱砂浸出液中的元素发现：氧化亚铁硫杆菌处理过的朱砂浸出 液中存在大量的微量元素，而且大部分元素含量较无菌酸体系有很明显的上升，显 示氧化亚铁硫杆菌对朱砂中的微量元素有很强的溶出作用。例如元素As，无菌体系 溶出很少，仅0.0192μg/ml，而细菌处理则高达0.3635μg/ml，增加了18倍左右。另外 不加菌的溶液中没有Cu、Mn，而加了菌的则分别为0.203μg/ml和3.116μg/ml。
无菌酸体系中的K元素含量比氧化亚铁硫杆菌处理体系中K元素含量要高出很 多。显示在氧化亚铁硫杆菌浸出过程中，氧化Fe2+形成黄钾铁钒沉淀KFe3 (SO4) 2 (OH) 6，从而使得K大量的减少，这与Toro 等的研究是一致的[24]。
－4－
另外一个独特的现象是无菌酸体系中Zn元素含量远远高于细菌处理，我们推测 是氧化亚铁硫杆菌在浸出过程中利用了Zn元素，但缺乏直接的实验证据。
朱砂的微生物浸出及其朱砂药效、毒性的重新评价1
苏丽春，李红玉* （兰州大学干旱与草地生态教育部重点实验室，兰州大学生命科学学院 甘肃 兰州 730000，*通讯作者）
摘要：论文研究了氧化亚铁硫杆菌对朱砂的浸出作用和其浸出液对小鼠的镇静安神作用。 实验显示氧化亚铁硫杆菌对朱砂具有浸出作用；同时实验显示：服用朱砂浸出液5天后（服用汞 总量≤0.2μg），小鼠各组织器官内未检测出汞，但朱砂浸出液却对小鼠水合氯醛和戊巴比妥钠睡 眠催眠有明显促进作用，并且呈现剂量依赖关系。以上结果表明朱砂浸出液可在十分安全的剂 量下行使朱砂的镇静安神功效，从而展现出巨大的应用前景。
1甘肃省科技攻关项目资助 *通讯作者。Tel：13519640428；E-mail：lihy@
－1－
题[5]。 近年来一个较大的进展是制备朱砂超微颗粒[6]和纳米级粉体[7]，这些技术的使
用与传统的炮制工艺相比较，在一定的程度上增加了朱砂的溶出特性，从而使朱砂 的吸收、分布、生物利用度、药效等方面都得到了不同程度的提高。但这类处理仍 然只能以混悬液入药，尚存在口服引起的胃肠道刺激，服用困难等问题，加之生产 纳米朱砂需要大型设备和先进的技术，普及使用尚有困难[8]。
昆明种小鼠，雄 180 只，体重（20±2）g，由兰州生物制品所实验动物研究中 心提供。
－2－
1.4 仪器： 电感耦合等离子发射光谱（ICP-AES）仪，型号：IRIS ER/S；X-ray 衍射仪：
D-max/2400。
2 方法 2.1 朱砂浸出液的制备
元素含量 元素含量
200
空白
150
处理
100
50
0 Mg
p
K
元素
3.0
2.5
空白
2.0
处理
1.5
1.0
0.5
0.0
Ca
Al As Ba Cd Co Cu Mn Pb Se Zn Hg
元素
图 2 朱砂浸出液中的各种元素
3.3 矿渣的 X-ray 射分析
500
400
300
C
200
C
C At.f菌处理后的的朱砂
关键词：微生物浸出，朱砂。
The Bioleaching of Cinnabar and the Re-evaluation on the Potency and Toxicity of Cinnabar
Abstract: It is discussed Acidithiobacillus ferrooxidans leaching on the cinnabar and some pharmacological effects of cinnabar on central nervous system in this paper. Bioleaching process with At.f can leach 0.282ppm of solubility mercury in 25 days. After the rats taking orally 5 days (total mercury ≤0.2μg), it was found to have synergistic interaction with pentobarbital sodium and chloral hydrate in sedative activity depending on the concentration of total mercury. But mercury was not found in the tissue. The results show that the lixivium of cinnabar have the same sedative activity and have understanding effect.
但大剂量不管是和空白组还是和朱砂组相比，都有显著性差异（P<0.01）。
3.5 对水合氯醛催眠作用的影响的结果如下表：
由于以上种种难以克服的问题，在中药制药业出现了一种规避朱砂的趋势，许 多药物因此失去了中医的精髓和原有特色[9, 10]。
目前，一项生物高新技术-微生物冶金技术异军突起[11-13]。在一定的空气、pH、 温度条件下，一些特殊的细菌（氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌等）可将不溶性的 硫化矿转变为可溶性的矿石浸出液，然后对所需元素进行回收[14-16]。该技术的最大 特点是简单、高效、低成本、无污染、条件温和，因而在世界冶金业得到广泛推崇 和应用，目前世界铜产量的30％已来自微生物冶金技术[17]。
将浸出末期的矿液抽滤得到的矿渣，反复用去离子水冲洗，并放于烘箱中烘干 至恒重，用于X-ray衍射分析[20]。衍射条件：工作电压40Kv，电流60mA，扫描范围 0-180°，扫描速度10°/min。 2.3 朱砂浸出液对戊巴比妥钠阈下催眠剂量影响[10, 21]
选用昆明种小鼠，♂，体重（20±2）g，随机分为6组，10只/组。分别以不同剂 量的朱砂浸出液给各个给药组灌胃，对照组分别以同体积的处理空白和朱砂悬浮液 灌胃，1 次/天，连续5天。均于末次给药后30min腹腔注射戊巴妥钠35mg/kg，翻正 反射消失达1 min 以上记为发生睡眠，计算各组睡眠发生率。 2.4 朱砂浸出液对水合氯醛阈下催眠作用的影响[10, 21]
朱砂是典型的硫化矿，HgS 占 96%以上[1-5]，恰好满足微生物冶金技术的应用 条件。
根据以上原理，本实验室提出应用微生物冶金技术对硫化物矿物药进行创新性 炮制的新思路，并进行了较为系统的研究。目前已利用具有自主知识产权的菌种顺 利的实现了雄黄、朱砂、自然铜在温和条件下的浸出，制备出了各自相应的微生物 浸出液[18, 19]。初步的实验结果显示朱砂溶解液可在十分安全的剂量下行使朱砂镇静 安神的功效，从而展现出巨大的应用前景。
－5－
3. 4 对戊巴比妥钠阈下催眠剂量影响的结果如下表：
组别
表1 朱砂浸出液与戊巴比妥钠阈下催眠剂量协同作用的研究
小鼠数
剂量
睡眠发生率
大剂量组
10
相当于0.2398μg朱砂（可溶性汞0.2067μg）
100%12
中剂量组
10
相当于朱砂0.1798μg朱砂（可溶性汞0.1550μg）
－3－
将2.3的小鼠于末次给药做完试验后处死，取其心、肝、脾、肺、肾、大脑消化 后ICP-AES测定其总汞含量。消化方法参照2005年中国药典[22]。 2.7 Fe2+测定
Fe2+采用邻菲罗啉比色法[23]。 2.8 统计方法
数据以x ±s 表示，采用SPSS 11.5 软件进行t检验，以P < 0.05 为显著性差异。
分组与给药同 2.3，并于末次给药后 30min 腹腔注射水合氯醛 0.4g/kg，翻正反 射消失达 1 min 以上记为发生睡眠，计算各组睡眠发生率。 2.5 朱砂浸出液对戊巴比妥钠阈上催眠剂量影响[10, 21]
分组与给药同2.3，并于末次给药后30min腹腔注射戊巴妥钠50mg/kg，记录从注 射时间到翻正反射消失时间（睡眠潜伏期）和翻正反射开始消失至恢复的时间（睡 眠时间）。 2.6 朱砂浸出液中的汞在体内的分布
Key words: bioleaching, cinnabar.
朱砂（Cinnabar）是常用的重镇安神药，在中药中具有举足轻重的地位，但朱 砂在实际使用中却面临着诸多难题[1]。首先，由于朱砂使用量大、而且其中汞含量 很高，常有使用朱砂造成不良反应，甚至引起死亡的报道，致使含朱砂类中药的声 誉受到严重影响[2]。其次，由于朱砂极其难溶，故很少见到对朱砂各种作用形态（成 分）、作用机制、参与中成药组方机理等重大基础问题的系统相关研究[3, 4]。再者， 由于朱砂常以未溶解状态的粗糙矿物原粉入药，一方面造成用量大、毒性严重招标， 另一方面也会引起口服病人的胃肠道刺激，以及药物的吸收及药效的发挥困难等问
