原代心肌细胞培养方法探讨[1] 3

大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。

乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。

新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。

因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。

建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。

2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。

常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。

3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。

新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。

消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。

4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。

分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。

成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。

溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。

由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。

5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。

操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。

心肌细胞或肝细胞原代培养的方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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相关记录：年月日星期天气：实验内容：C57小鼠心肌细胞培养参加人员：王朗郭源源一、培养前准备：1 器械：取心脏： wpi剪2把、显微镊弯2把、眼科镊1把取心脏后：显微剪1把、持针器2把、吉利刀片2片、眼科镊2把、400目细胞滤网2 器皿：外：烧杯1个 100ml内：盛酒精小烧杯、棉签2包，鼠板盛小鼠尸体，玻璃皿100mm 2，碎冰盆底加两个冰袋，离心管架1，6孔板，EP管，15ml离心管，50ml离心管3 试剂与配制1.培养基：DMEM/F12，添加15%FBS2.提前融化：BrdU溴脱氧尿苷 100X储藏液(10 mM)，小牛血清、II型胶原酶〔10mg/ml储藏液〕、0.25%胰酶提前融化3.D-Hanks液：二方法1 心脏取出1. 加10ml和6ml未加血清的DMEM/F12到2个100mm皿中，平皿放入冰盆预冷。

2. 将20只小鼠婴放入100mm玻璃平皿，镊取小鼠放入75%酒精中浸泡数秒，对其颈部以下消毒，抓取小鼠，固定住上肢与下肢，从颈部剪下头部，剪刀由颈部伸入胸腔沿胸骨左侧剪开，轻轻挤压胸廓，让心脏跳出，迅速用镊子取下心脏，放入盛有10ml DMEM/F12的玻璃平皿中。

3. 轻柔清洗心脏的血液后转入另一个盛有10ml DMEM/F12液的10cm培养皿中，用显微剪将心脏剪成1-2mm的碎片。

4. 以上过程应在冰上30min之内完成。

2 消化细胞1. 将剪碎的组织转入15ml离心管，吸去DMEM/F12，参加酶消化液4ml。

2. 37度水浴中轻摇，消化10min，静止数秒钟，吸取上清液，弃去。

此时消化下的细胞为不需要的红细胞、细胞碎片以与心内膜和心外膜细胞。

3. 37度水浴中轻摇，消化4-5min。

静止数秒钟，吸取上清液，放入预先放好7ml〔体积为上清液体积的2-3倍〕含20%小牛血清的DMEM/F12培养基的15ml离心管中终止消化，并置于冰上。

4. 重复3步骤，循环5-6次。

取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。

原代心肌细胞培养曾石秀;廖伟【摘要】目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察.方法:取出生1～3d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度,结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92％,纯度90％,2～3d出现同步搏动.结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2012(032)002【总页数】3页(P167-169)【关键词】原代心肌细胞;培养;存活率;纯度【作者】曾石秀;廖伟【作者单位】南昌大学医学院,江西南昌330000;赣南医学院第一附属医院心内科,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院心内科,江西赣州 341000【正文语种】中文【中图分类】Q813.1+1原代细胞培养是分子生物学和细胞生物学研究的一项基本技术。

原代心肌细胞可保存其结构和功能上的某些特点，有自发性搏动，不受神经、体液因素的干扰，有利于直接进行生理、病理及药理等多方面的研究［1］。

本研究目的为探讨一种实用的原代心肌细胞培养方法。

1 材料与方法1.1 实验试剂与配制高糖DMEM、胰蛋白酶(Gibco 公司)，Ⅱ型胶原酶、BrdU(5-溴-2＇-脱氧尿苷)、0.4%台盼蓝(Sigma公司)、胎牛血清(Hyclone公司)，α横纹肌肌动蛋白(α-SA)单克隆抗体、免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物工程有限公司)。

1.2 实验动物出生1～3 d的SD大鼠的乳鼠，雌雄不限［清洁级，江西中医学院，许可证号 SCXK(赣)2010-0001］。

1.3 实验仪器超净工作台(上海博迅公司，型号SW-CJ-2FD)、CO2培养箱(Thermo公司，型号Forma311)、低速离心机(江苏环宇公司，型号80-2型)、高精度恒温水浴箱(上海博迅公司，型号SSW-600-2S)、倒置相差显微镜(Olympus公司，型号CKX 41)等。

2021简便易行、成活率高的原代心肌细胞培养方法范文 引言 原代心肌细胞培养是一项重要的体外实验技术，其为建造心血管疾病发生发展过程的模型及探讨基因、蛋白质及信号通路的变化提供重要的基础保障。

此外，在体内心肌细胞的活动受到神经、体液等多方因素的影响，限制对其病理变化的过程的研究。

而体外培养的原代心肌细胞不仅具有心肌细胞固有的活性，而且还有不受神经、体液等因素的影响的可控制性。

因此，原代心肌细胞培养的好坏，是影响实验的结果的关键因素之一。

本研究通过比较不同消化时间对原代心肌细胞的影响，探讨一套简便易行、成活率高的原代心肌细胞培养方法。

1材料与方法 1.1 实验动物选择出生 1 ~ 2 d 的 Wistar 大鼠，清洁级，雌雄不限，由内蒙古大学动物研究中心提供，合格证编号： csxk（蒙） 2002-0001.杨木小刨花垫窝，湿度 45% ~50%,温度控制在 21 ~27 ℃。

1.2 主要试剂及仪器 DMEM 高糖培养基（含 100U 青霉素 + 链霉素双抗）、胎牛血清、Ⅱ型胶原酶（ Worthington 公司，美国）、磷酸盐缓冲液（ PBS）、台盼蓝染色液； 5-溴-2-脱氧尿苷（ Brdu）、4% 多聚甲醛、过氧化酶阻断溶液、羊血清、α-actin抗体（兔抗大鼠）、二氨基联苯胺（ 3,3'-diaminobenzidine,DAB）显色试剂盒、SABC（链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法）免疫组化试剂盒、Mayor's 苏木精、二甲苯、TritonX. 100（生工生物工程有限公司，中国）、37 ℃恒温浴锅、医用超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、恒温离心机等。

1.3 实验步骤①将大鼠浸没在 75% 乙醇中消毒2 次，左手固定乳鼠暴露胸部，右手持眼科剪沿其胸骨左侧剪开，压住肺叶，心脏收缩时可见其膨出。

眼科镊钝性分离下心脏，放入有10 mL 10% DMEM培养基（含双抗）的培养皿中。

原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。

2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。

3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。

4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。

5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。

封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。

第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。

之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。

放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。

这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。

（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。

5只鼠铺一个培养瓶。

4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。

心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。

注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。

正常大鼠原代心肌细胞培养一、实验试剂1、培养基：PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement2、冻存液：PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO3、洗涤液：1×PBS（pH 7.4）+ 1% P/S4、染色液：0.4% Trypan Blue5、消化液：PriCells Isolation of Primary Cell Kit6、检测试剂：一抗小鼠抗大鼠α-横纹肌肌动蛋白，二抗FITC标记山羊抗小鼠IgG，乙醇丙酮混合液（1∶1）二、实验器械1、培养皿2、培养瓶3、直剪和眼科剪4、眼科镊5、200目网筛6、玻璃滴管7、烧杯8、15ml离心管三、实验流程取材↓取心肌组织放入D-Hanks中洗涤3次↓剪碎至1mm3 +消化液（PriCells）↓37℃水浴8min，吸弃上层悬液（非心肌细胞）↓余下组织加消化液（PriCells）37℃磁力搅拌10min，60r/min↓上层悬液加消化终止液（PriCells）↓余下组织再加消化液（PriCells）继续消化3-5次↓收集所有混悬液过200目网筛↓收集滤液1000RPM/10min↓去上清，收集沉淀，2ml培养基重悬↓染色计数四、实验操作1、培养瓶预包被。

试验前一天预包培养瓶，置于超静台吹干或45℃烘箱烘干（切记保持无菌），4℃冰箱放置，备用。

2、取材：出生1—3天幼鼠。

3、材料预处理：将获取的心脏放入含有1% P/S的1×PBS（pH 7.4）中，剪去心房，反复洗涤，至心室内无血渍，洗涤液澄清为止。

4、消化：将心室肌用眼科剪剪成1mm3大小组织块，加入消化液10ml，37℃水浴8min后，吸取上层混悬液遗弃；余下组织加入消化液10ml，37℃水浴并用磁力搅拌器搅拌10min；吸取上层混悬液，终止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至组织块完全消化。

新生大鼠心肌细胞原代培养实验具体步骤及方法将大鼠的心肌细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

一、实验材料准备1. 动物出生后1-4 天SD 乳鼠15 只。

2. 试剂低糖DMEM、胰酶(含EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。

0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精，培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。

3. 手术器械和仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。

二、方法1. 将胰酶用D-Hank's 液配成0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。

2. 解剖取材：将乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。

左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。

这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。

然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's 液中。

重复以上过程。

取材完毕后，撤掉取材的手术器械。

注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。

3. 用第二套手术器械进行下列操作。

用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。

大鼠心肌细胞培养一、乳鼠原代心肌细胞培养（一）、试液配制1．DMEM培养液：配制方法同前。

按每90ml 培养液加入10ml 胎牛血清即为10%DMEM 培养液。

2．0.1%胰酶：移取0.5g 胰酶，加入５00ml 生理盐水，充分溶解后，调pH至７.2~7.4,过滤除菌后，分装冻存于-２０℃。

3．１0mmol/L 5-溴脱氧尿苷：（二）、操作步骤１．取１天龄的新生乳鼠，断头处死，固定于泡沫板上；２．应用碘酊及７０％酒精常规消毒；３．从左侧肋下缘剪开胸腔，用镊子取出心脏，置入含无血清DMEM培养液的平皿中；４．全部心脏取出后，剪去心房及周围血管组织，移入一干平皿中；５．剪碎，用无血清培养液洗１～２遍后，转移入５０ml 离心管中；６．按３０～５０个心脏加１０～1５ml胰酶液，于３２～３５℃，不停搅动１５０～２００rpm,消化１５～２０min;７．让组织块自然沉淀，上清移入另一离心管中，立即加入等量含１０％血清的培养液以终止胰酶的作用。

最初２～３次消化液因含较多的细胞碎片及红细胞，可弃去。

８．组织块可反复加入胰酶消化５～８次，所得细胞悬液在１０００rpm离心５min , 弃去上清，沉淀用少量培养液重悬；９．细胞计数后，将细胞稀释成１×106cells/ml的浓度，转移入培养瓶中，３０cm2的培养瓶加入５ml ，轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分布；10.37℃95%空气－５％CO2条件下培养１h，然后轻轻摇动，将未贴壁的细胞转移到新的培养瓶中继续培养；11.２4h后更换含０.1mmol５－溴脱氧尿苷的培养液，以后每２天更换一次培养液。

心肌细胞全部汇合，自主搏动良好即可用于实验。

（三）、注意事项１．心脏是由多种细胞群组成的，心肌细胞约占５０％。

决定心肌细胞培养成败的关键是：１）不能污染，在整个操作过程中都要注意无菌操作，所用器皿都要严格消毒，所用试液都要预先检验无菌后方可使用。

２）尽量减少非心肌细胞的存在。

乳鼠心肌细胞原代培养综述乳鼠心肌细胞原代培养综述【摘要】：目的乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但是心肌细胞成活率、搏动率，纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。

本文探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。

【关键词】乳鼠心肌细胞原代培养1．新生大鼠鼠龄的选择乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。

2．消化酶的选择使用分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。

消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。

其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。

所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。

另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶。

且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。

61 g·L-1，我们使用的为0。

8 g·L-1。

胶原酶最好现用现配。

3．污染防治虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。

细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养㈠、概述整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。

小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。

㈡、[试剂]1、培养液：1：1混合的DMEM/F12培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。

2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05%，用pH7.2-7.8的D-Hanks溶液配制，-20℃保存。

3、D-Hanks溶液（pH7.2-7.8）：KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaCl8.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4？7H2O0.09g，酚红0.01g1L㈢、[实验步骤]1、取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心脏剪成1mm3大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5min，自然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min 振摇几下），用吸管吹打1min后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000rpm5min，弃上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml，1500rpm10min，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液。

（为节约时间，以下步骤省略）上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中置二氧化碳培养箱中（37℃5%CO2）培养。

西藏小鼠心肌原代干细胞培养技巧（一）前言西藏小鼠是我国唯一野生高原兽种，具有高寿命、高抗氧化、高抗缺氧、高红细胞密度等特性。

为了更好地研究和利用这一资源，在研究中心的引导下，我积极参与了有关西藏小鼠心肌原代干细胞培养技术的学习和研究工作。

在这一过程中，我积累了许多经验并发现了一些问题，现将我的一些心得体会分享给大家。

（二）心肌原代干细胞的提取提取心肌原代干细胞是研究心脏干细胞的一个重要步骤。

在提取过程中，需要仔细操作，以确保提取到的细胞数量和质量达到要求。

1. 准备工作。

在提取心肌原代干细胞前，需要准备好所需的仪器和试剂，例如工作台、培养皿、培养液、离心机等。

2. 切割心脏组织。

首先，需要将小鼠的心脏组织切割成小块。

切割时应注意不要受到污染。

3. 消化组织。

将心肌块加入消化液中，并放入恒温水浴中，可使心肌块中的细胞逐渐分离。

4. 筛选出心肌原代细胞。

将消化液中的细胞用过滤网进行筛选，将细胞培养在含有胰酶的培养液中几分钟，胰酶可使心肌细胞逐渐分离。

（三）心肌原代干细胞的培养1. 培养基的选择。

为了更好地培养心肌原代干细胞，我们选择了以DMEM/F12为基础的培养基，添加适量的FBS、酵母抽提物、L-谷氨酰胺、丝氨酸等营养成分，促进心肌干细胞的生长。

2. 恒温箱的设定。

在细胞培养的过程中，需要保持适宜的温度和湿度，使细胞能够良好地生长和繁殖。

3. 细胞培养周期的控制。

要保证心肌干细胞能够稳定地生长和繁殖，需要控制细胞培养周期和对培养液中营养成分的添加。

（四）细胞活力的检测细胞活力是心肌干细胞繁殖和生长的重要指标，也是评价心肌干细胞培养质量的重要标准。

因此，在进行心肌干细胞培养的过程中，需要对细胞活性进行监测和控制，以确保实验的可靠性和有效性。

1. 测定细胞的生长曲线。

生长曲线是细胞生长和繁殖的重要指标，通过细胞培养基中的OD值来测定细胞生长情况。

2. 检测细胞彗星现象。

细胞彗星现象是细胞死亡的标志之一，通过对细胞DNA的断裂情况和细胞核的形态进行观察和检测，可以得出细胞的生命状态和活性。

心肌细胞培养方法详述配液：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。

取鼠：鼠盆用棉铺好，取鼠。

准备：事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。

其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。

新洁尔灭（0.1％）泡纱布（用10ml5％的新洁尔灭加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液）。

用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

物品：白大衣、饭盒小剪子、小镊子（4套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织，一套剪碎心脏）瓶皿（2套）[两个小圆培养皿，培养皿内加DMEM液，先后装取出的心和剔出纤维组织后的心] [一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]250ml烧杯3个[一个用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸] [一个装0.1％新洁尔灭150ml左右，消毒小鼠]500ml烧杯1个，用作废液缸。

50ml烧杯3个（剪碎心肌组织，最后配液）三角烧杯（50ml）+小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压）离心管及帽（12-14个），两个试管吸管（5~8个）大镊子（两把，持物，例夹棉球等）台面：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装0.1％新洁尔灭浸泡）、试管架、泡沫塑料板、五个针头（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、3个250ml烧瓶（一个装一蒸水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用）1个500ml烧瓶（废液缸）、温度计、PH试纸（事先调PH值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10个）[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml 6个（胰酶、DMEM、小牛血清）1ml 2个（双抗液）20ml备用2个、微量加样器1000ml及500ml 以上物品均用紫外线照30分钟。

另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机+一把小锁、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。

1 材料1.1动物出生后1-4 天SD 乳鼠15 只。

1.2 试剂低糖DMEM、胰酶(含EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。

0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精。

培养液：培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。

1.3 手术器械和仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。

2 方法2.1 将胰酶用D-Hank's 液配成0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。

2.2 解剖取材：将乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。

左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。

这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。

然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's 液中。

重复以上过程。

取材完毕后，撤掉取材的手术器械。

注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。

2.3 用第二套手术器械进行下列操作。

用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。

心肌细胞的分离及培养器械：饭盒、烧杯、弯头解剖剪（2）、小镊子（2）、平皿（4）、毛玻片、滤网、离心管（15ml）、移液管、培养瓶、废液缸、PE手套、橡胶手套、冰盒溶液：PBS、DMEM（含血清）、DMEM（free）、胰酶动物：小鼠准备：用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束，提前半小时将培养液、胰酶37℃温浴。

培养过程：1、两个圆皿中加入5ml的PBS培养液，将小鼠浸入70％酒精<5min，用小剪子及小镊子开胸取心。

2、取出的心放在一个装有PBS的平皿中，剔除心脏周边的血凝及纤维组织。

3、PBS再冲洗后，转移至另一个预先装好5ml胰酶的平皿中，用剪子将平皿中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入15ml离心管中，加入3-5ml胰酶冲洗平皿转移到离心管中。

4、放入水浴锅中，温和摇动，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血红细胞、细胞碎屑和死细胞。

5、再将8-10ml胰酶加入盛有组织的离心管，吸管轻轻吹打1min，消化10min，小心转移上清+2ml DMEM至另一离心管中，细胞悬液离心，1000转×10min，弃上清，加培养基为管1。

6、重复第5步，3-8次，直至至组织块消化为止。

7、将多次细胞悬液经100目滤网过滤，混合。

8、加入1ml DMEM重悬，显微镜下观察并计数。

9、培养1-1.5小时，收集培养液中的非贴壁细胞，小心不要晃动。

10、显微镜观察并计数，细胞密度调至5×105-6×105细胞/ml。

11、4-6小时后，用培养基轻轻冲洗2次，加入培养基继续孵育过夜。

或从第5步起，加胰酶10-15ml，30min 37℃水浴，每5min用吸管吹打5ml完全培养基终止。

原代心肌细胞培养方法探讨1邵伟（山东省千佛山医院山东济南250014）周苏宁邵建华（山东大学医学院山东省立医院山东济南250021）摘要探讨培养Wister新生大鼠心肌细胞的可靠方法。

原代培养心肌细胞1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g?L1,我们使用的为0.8 g?L1.胶原酶最好现用现配.3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1)转速一般控制在60~80 r?min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染.6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞.7换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g?L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.8抗污染措施除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道.比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会.(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率.9培养液pH值适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：(1) pH值会在过滤后上升0.1~0.3.(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关.(3)应及时换液.(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH上升.每次配好的培养液尽量在2 wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用.。