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禽流感病毒中和实验及其他方法（一）实验材料1、中和反应实验材料(1)病毒：）的滴定。
一般为鸡胚尿囊病毒液，进行中和实验前，需要进行病毒滴度（TCID50(2)血清样品包括待检血清和阳性以及阴性对照血清。
人血清实验前需要56℃ 30分钟灭活，动物血清需RDE处理。
－20℃储存，避免多次反复冻融。
(3)MDCK细胞和细胞培养试剂1)MDCK细胞（狗肾上皮细胞）2)MDCK细胞培养液：DMEM+5%牛血清+抗生素，过滤除菌500毫升 DMEM（修饰的Eagles培养基）5.5毫升 100×抗生素（100单位/毫升青霉素+100微克/毫升链霉素）5.5毫升 100×L－Glutamine（2毫摩尔）25.5毫升 56℃、30分钟加热灭活的牛血清3)胰酶 / EDTA(4)其它1)平底96孔微量培养板2)病毒稀释液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。
429毫升 DMEM66毫升 7.5%牛血清白蛋白（BSA）5毫升 100×抗生素3)TPCK－胰酶（使用浓度为2微克/毫升）4)固定液：80%的丙酮，即配即用，4℃保存400毫升丙酮100毫升 PBS，PH 7.22、ELISA实验材料(1)抗体1：鼠抗流感病毒甲型核蛋白克隆抗体(2)抗体2：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(3)洗涤液：PBS+0.05%TWEEN－204升 PBS，PH 7.22毫升 TWEEN－20(4)封闭液：PBS+1%牛血清白蛋白+0.05％TWEEN－20867毫升PBS，PH 7.2132毫升牛血清白蛋白1毫升TWEEN－20(5)底物和底物溶液：常用的辣根过氧化物酶（HRP）所用底物为磷苯二胺（OPD）底物溶液为PH5.0磷酸盐－柠檬酸缓冲液（0.05M）底物和底物溶液：10毫克OPD20毫升柠檬酸缓冲液（含0.015%双氧水）即配即用磷酸盐－柠檬酸缓冲液，PH5.058.8克柠檬酸三钠1升蒸馏水用盐酸调节PH为5.0加0.015%双氧水，（临用前加入）* 如果使用磷酸盐－柠檬酸缓冲液胶囊（Sigma）1个胶囊加入100毫升蒸馏水，临用前配制(6)终止反应液：1N硫酸（28毫升浓硫酸+1升蒸馏水）3、其他细胞培养和酶联免役吸附实验的常用设备和仪器（参照英文讲义）备注：A.以上实验材料购自Gibco,，Hyclone，Dynatech，Kirkegaard&Perry和Sigma 公司，材料编号（CAT#）参照英文讲义。
胰酶的配制过程姓名：李达专业：预防兽医学号：2013022060 导师：汤德元一．胰酶-EDTA的配制1、专用PBS缓冲液配方：1000mlPBS: 7.000g NaCl1.100g Glucose·H2O 或 1.000g Glucose0.3700g KCl0.2g Na2PO4H3.000g Tris0.2400g KH2PO40.4000g EDTA超纯水1000ml所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。
0.0010g 酚红5ml PS2.5g 胰酶（HyClone 胰蛋白酶1:250 SH30848.018）2、配制步骤：1）所用容器先泡酸12小时，后用自来水洗至无色后用蒸馏水洗净，再用超纯水洗三遍，最后高压灭菌，烘干。
2）将缓冲液配好后高压灭菌，同时洗好的广口瓶灭一瓶超纯水备用。
3）加入5ml双抗（PS）。
4）以灭菌的超纯水补足高压过程中损失的水分定容至1000ml。
5）转移到1L的试剂瓶中，加入酚红（0.0010g）。
6）调PH至7.2-7.4。
7）低温冰浴中溶解Tryspin2.5g.混匀。
此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。
8）在细胞间里用0.22um的滤膜过滤，分装入灭菌的50ml或1.5ml离心管中。
此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。
-20℃保存。
9）不可反复冻存。
每次解冻后4℃保存，并在短期内用完。
3、注意事项：1）整个分装过程在无菌条件下进行。
2）机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫酶就变性了。
低温可防止酶失活。
3）加入的EDTA可以络合细胞外基质中的Ca2+ ，增加消化效力。
4）在调节PH时一定要注意保护探头，防止损伤电极。
5）分装时不要太满，防止冻存后体积增大而溢出。
50ml离心管装45ml左右，1.5ml离心管装1.4ml左右。
6）分装后的胰酶尽快转移到-20℃冰箱中冻存。
二．0.25%胰酶（无EDTA）的配制1、250ml胰酶配制方法Tryspin 0.625gPS 2.5ml苯酚红0.1g所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。
人抗胰蛋白酶(AT)elisa试剂盒使用说明书Elisa kit规格：48孔配置/96孔配置标准品稀释液：1.5ml×1瓶酶标试剂：3 ml×1瓶（48）/6 ml×1瓶（96）【人抗胰蛋白酶(AT)试剂盒】本试剂仅供研究使用计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
试剂盒组成：封板膜:2片（48）/2片（96）说明书:1份密封袋:1个标准品：2700ng/L 0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存酶标包被板: 1×48 1×96 2-8℃保存样品稀释液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液: 3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液:（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人抗胰蛋白酶(AT)水平。
用纯化的人抗胰蛋白酶(AT)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入抗胰蛋白酶(AT)，再与HRP标记的抗胰蛋白酶(AT)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的抗胰蛋白酶(AT)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人抗胰蛋白酶(AT)浓度。
胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25%:0.02%)产品简介：胰蛋白酶（Trypsin）是由胰脏产生没有活性的胰蛋白酶原分泌到小肠后，小肠内的肠肽酶会活化该酶原，形成胰蛋白酶。
胰蛋白酶的特点还在于已经活化的胰蛋白酶，能够继续活化更多胰蛋白酶原，这种过程即自动催化。
胰蛋白酶在小肠工作，它会将蛋白质水解为肽，进而分解为氨基酸，其最适温度约为37℃。
Leagene的 Trypsin-EDTA solution，含0.25%胰酶、0.02%EDTA。
该溶液经过过滤除菌，可以直接用于培养细胞的消化，或者一些组织的消化。
该产品通常室温消化1min 左右就可以消化下大多数贴壁细胞。
主要成分：主要由0.25%胰酶、0.02%EDTA等组成，不含酚红，过滤除菌。
自备材料：1、微量移液器2、PBS、Hanks液或无血清培养液3、显微镜4、离心机操作步骤(仅供参考)：1、贴壁细胞的消化①吸除培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。
②加入少量Trypsin-EDTA solution，略盖过细胞即可，室温放置0.5～2min，不同的细胞消化时间有所不同。
③显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。
此时吸除胰酶细胞消化液。
加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。
④如果发现消化不足，则加入Trypsin-EDTA solution重新消化。
⑤如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。
1000～2000g离心1min，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。
2、组织的消化不同的组织需要消化的时间相差很大，通常以消化后可以充分打散组织为宜。
注意事项：1、尽量减少反复冻融的次数，以免失效。
细胞加药技巧
药物选择
在选择细胞培养药物时，需要考虑药物的质量、纯度、浓度、细胞毒性等多种因素。
常用的细胞培养药物包括胰酶、EDTA、PBS等。
选择药物时需注意以下几点：
确保药物来自可靠的供应商，并按照说明书进行配制和使用。
了解药物的保存条件和有效期，避免使用变质或过期药物。
在使用多种药物时，要注意药物之间的相互作用，并遵循医生的建议。
药物配制
根据细胞培养所需的浓度和用量，对药物进行配制。
配制时需注意以下几点：
按照说明书要求的浓度和体积进行配制，确保准确性。
配制过程中要避免污染，使用无菌技术。
对于需要过滤或分装的药品，应使用无菌滤器或注射器进行操作。
细胞处理
在加药前需要对细胞进行处理，主要包括细胞的计数、细胞的接种量、培养液的更换频率等内容。
处理时需注意以下几点：
细胞计数要准确，遵循细胞计数规范。
细胞的接种量要适当，根据细胞类型和实验需求进行调整。
更换培养液时要保证无菌操作，并及时更换。
加药步骤
加药时需要注意以下几点：
按照预定的加药计划进行操作，确保加药量和时间的准确性。
加药前要确认药品的名称、浓度和使用量，避免错误。
加药时要避免对细胞造成冲击，遵循无菌操作规范。
常用液体配制标准操作规程（SOP）国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心二〇〇八年九月修订目录一、细菌培养系统（责任人：郑子峥）二、DNA操作系统（责任人：罗文新、陈瑛炜）三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕）四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛）五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、）六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉）一、细菌培养系统1、LB培养基:每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨 10g，酵母粉5g，用ddH2O 配制，再用10M NaOH调pH至(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。
2、固体培养基:LB培养基中加入琼脂至％，高压蒸汽灭菌15min后使用。
3、10%(g/V) 氨苄青霉素钠（Ap）：注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。
注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。
4、%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan）注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含卡那霉素。
取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。
注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。
5、细菌培养：配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm 培养。
剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。
6、化学感受态制备：1）原理:：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competent cell）。
将细菌置于0℃，低渗CaCl2 溶液中时，菌细胞壁和膜的通透性增强，菌体膨胀成球型。
胰酶的配制过程姓名：李达 专业：预防兽医学号： 2013022060 导师：汤德元NaCl Glucose H 2O 或 I.OOOg Glucose KCl Na 2PO 4HTrisKH 2PO 4 EDTA1OOOml所有试剂全部为细胞培养专用sigma 试剂 O.OO1Og酚红 5ml PS2.5g 胰酶（ HyClone 胰蛋白酶 1:25O SH3O848.O18） 2、配制步骤：1 ）所用容器先泡酸 12 小时，后用自来水洗至无色后用蒸馏水洗净， 再用超纯水洗三遍，最后高压灭菌，烘干。
2）将缓冲液配好后高压灭菌，同时洗好的广口瓶灭一瓶超纯水备用。
3） 加入 5ml 双抗（ PS ）。
4） 以灭菌的超纯水补足高压过程中损失的水分定容至 1OOOml 。
5） 转移到1L 的试剂瓶中，加入酚红（O.OOIOg ）。
6） 调 PH 至 7.2-7.4。
7） 低温冰浴中溶解Tryspin2.5g.混匀。
此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。
8） 在细胞间里用0.22um 的滤膜过滤，分装入灭菌的 50ml 或1.5ml 离心管中。
此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。
-2O C 保存。
9） 不可反复冻存。
每次解冻后4 C 保存，并在短期内用完。
一．胰酶 -EDTA 的配制1、专用 PBS 缓冲液配方：1000mlPBS: 7.000g1.100g 0.3700g 0.2g3.000g 0.2400g 0.4000g 超纯水3、注意事项：1）整个分装过程在无菌条件下进行。
2）机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫酶就变性了。
低温可防止酶失活。
3）加入的 EDTA 可以络合细胞外基质中的 Ca 2+，增加消化效力。
4）在调节 PH 时一定要注意保护探头，防止损伤电极。
5）分装时不要太满，防止冻存后体积增大而溢出。
50ml 离心管装 45ml 左右， 1.5ml 离心管装 1.4ml 左右。
6）分装后的胰酶尽快转移到-20C 冰箱中冻存。
edta试验中的化学操作注意
1.使用edta络合滴定时需要注意一些事项。
2.首先，要注意使用纯净的试剂和仪器设备，以避免可能的干扰物对滴定结果的影响。
其次，要控制好滴定液的pH值，通常在8-10之间，以保证络合反应的进行。
此外，还要注意滴定速度，过快或过慢都可能导致滴定结果的偏差。
另外，滴定过程中要充分搅拌溶液，以确保络合反应充分进行。
最后，要注意记录滴定过程中的数据和观察现象，以便后续的数据分析和结果判断。
3.此外，edta络合滴定还有一些。
例如，可以根据滴定结果计算出样品中金属离子的浓度，从而用于分析样品的成分和含量。
此外，edta络合滴定还可以应用于环境监测、食品安全等领域，用于检测和分析中的金属离子的含量。
同时，edta络合滴定也是化学实验室中常用的一种分析方法，对于学习和掌握化学分析技术具有重要意义。
— 1 —。
病毒中和抗体检测1.病毒TCID50检测TCID50 是指组织培养物（细胞）半数致死剂量。
它有几个性质我们必须明白：1）它表示的是计量，不是浓度；2）它是一个单位；3）它的值等于1，实际上问它的值等于多少是一个没有意义的问题，就像问km的值等于多少一样，如果非要说出的的值等于多少，那我们只能说它的值在任何情况下都等于1。
理解这三个性质对于理解TCID50非常重要，但是这三个性质经常被误解，所以导致对TCID50的理解出现偏差。
首先我们来看一下这个表示法的意思：病毒滴度为108.2TCID50/ml 。
它表示的是每ml病毒溶液里含有108.2个TCID50的病毒，这和氯化钠的浓度为4.5mol/L表示每L溶液中含有4.5个mol的氯化钠是一样的道理。
经常可以听到人说我的病毒的TCID50是10x.x。
这个说法是不科学的，应该说我这个溶液里含有10x.x个TCID50的病毒或者说我这个溶液的病毒滴度是10xx TCID50/ml。
也可以说病毒的TCID50效价是10-x.x。
TCID50=10^5.64/0.1ml。
即：将病毒悬液作10^5.64稀释后，接种细胞0.1ml，可以使50%的细胞产生CPE。
（将病毒悬液作10^5.64稀释后，0.1ml中含1个TCID50，作其他一些实验时（如中和试验），一般常用100TCID50/0.1ml或者100TCID50/0.05ml）本方法的优缺点:①.优点:出现阳性结果时间较短,且较明显;②.缺点:有时候,在用枪头吸出细胞生长液时,容易出现污染;使用本方法时的注意事项:①.稀释病毒时,每做一个病毒稀释度都需要换枪头,减少浓度误差;②.96孔板,每孔接种的细胞量:一般在此种测定病毒滴度的方法下,要将细胞密度适当调低,至少要比正常传代时低一些,否则细胞生长速度过快,未到7天则细胞出现死亡,对观察CPE不利.一般情况下,小塑料瓶(8-9ml液体为正常用量),培养长慢单层后,消化细胞,加入6ml培养液,吹匀,吸出其中的2ml,到另外的瓶子,在该瓶中加入14-16ml即可,如果不放心,可以用显微镜看一下,细胞数过多则补加培养液,少则补加剩余4ml的细胞悬液;维持液,即病毒培养液,配方为:①.MEM+2%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3; ②. MEM+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3;两种维持液的不同在于是否有FBS(小牛血清).我个人曾经做过实验,在状态很好的细胞上接种病毒,分别使用两种不同的维持液,最终结果是一样的,没有什么不同,所以可以根据个人需要进行选择.另外,曾经请教过专门做中和实验的老师,他认为适当的FBS对细胞有保护作用,而且他说这是国外文献上的报道.1）细胞准备1.1 检查培养瓶中的单层细胞，以5ml胰酶－EDTA轻微冲洗1.2 加入4－5ml 胰酶－EDTA以覆盖单层细胞1.3 放平培养瓶，37℃5％CO2培养箱中孵育10－20min，直到细胞脱落1.4 加入5－10ml培养液，洗下细胞后移到离心管中1.5 以PBS洗细胞两次（12000rpm, 5min）1.6 以D-MEM重悬细胞，并用血球计数板计数1.7 以D-MEM将将细胞浓度调整到1×10^5/ml --1.5×10^5/ml1.8 在微量培养板的各孔中加入100μl细胞, 相当于?×10^4细胞/孔1.9 在37℃5％CO2培养箱中过夜培养（18－22h），用处于生长相刚达到完全融合的细胞进行病毒的滴定2）病毒制备3）病毒稀释3.1 取冻存的病毒，以病毒生长培养液（VGM）稀释10倍，即100微升病毒液+900微升稀释液，共1毫升。
细胞培养实验室操作准则任何首次准备开展细胞实验的人员必须首先认真阅读以下准则，然后在已经熟练掌握细胞培养操作技术人员的指导下开始进行细胞实验，并在以后的实验过程中严格遵守各项准则。
一、细胞实验准备1.进入细胞房前要换鞋，穿无菌服（干净实验工作服），戴手套，接触细胞前喷75%酒精消毒手套。
2.将所需实验用品：培养基（完全培养基、空白培养基）、胰酶（含ETTA）、枪头（1ml、200ul、10ul)、离心管，预先放置到超净工作台，打开紫外照射30min 后开始细胞实验。
3.观察细胞前，用75%酒精纱布擦拭显微镜镜头及台面，进行消毒后方可开始观察细胞。
4.观察细胞主要包括：细胞数量（汇合度）、形态、分布情况（是否均匀）、有无漂浮的死细胞和污染等，观察完及时放回培养箱。
（如图，汇合度约90%，分布均匀）5.每次开始细胞实验前，需关闭紫外照射，打开超净台风机及灯。
用含75%酒精的纱布擦拭超净工作台。
超净台内物品放置情况：左侧（各式枪头，及可常温放置的试剂如PBS等），右侧（5ml枪头及镊子），废弃瓶位于右上角，尽可能远离操作区域，正前方为枪和酒精灯，培养基及胰酶放置左侧便于取用。
6.超净台在使用前后，都需用含75%酒精的纱布擦拭台面至纱布上看不到明显脏物为止，每天操作后废液缸需清洗用紫外照射，此外，从外面拿进超净台的东西都要喷75%酒精消毒。
7、每周四需更换培养箱中高压过的超纯水，每周五对超净台（包括风机）、细胞培养房卫生进行打扫，每月对培养箱进行消毒清洗，确保细胞不受污染。
8、检查培养箱的CO2含量是否正常，如出现异常及时联系细胞平台相关负责人。
9、5mL枪头清洗高压的流程:(1)用洗洁精将枪头超声一遍（2）更换干净的自来水超声清洗3遍（3）用超纯水超声清洗1遍（4）将枪头捞出后再用超纯水荡洗3遍（5）放入烘干箱烘干（6）装在铁盒中，注意枪头放置顺序一致，放入高压锅，选择橡胶类（7）高压后放入烘干箱烘干后方可拿入细胞房使用1ml、200ul、10ul装入枪盒后放入高压锅高压烘干后方可拿入细胞房使用二、细胞传代1.细胞传代前要观察细胞，细胞汇合度达到80%-90%时可以进行传代。
胰酶（pancreatin)是一种自猪胰中提取的多种酶的混合物，主要为胰蛋白酶（将蛋白质消化成蛋白胨）、胰淀粉酶（将淀粉消化成糖)与胰脂肪酶（将脂肪消化成甘油和脂肪酸）。
其通过在特定位置上降解蛋白，使细胞间结合处蛋白降解，这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力作用下成为球形，从而使细胞分开。
不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。
使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。
因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。
终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
胰酶本身就是消化蛋白的，而细胞膜又富含各种膜蛋白，消化过头会对细胞造成损伤的。
细胞之间是通过CAM（细胞粘性分子）相连的，而很多粘性分子只有在有+2价金属离子，如Ca2+,Mg2+，的存在下才能行使这种功能。
在胰酶中加EDTA的作用是熬合这些二价离子，使细胞被消化成单细胞形态。
EDTA是乙二胺四乙酸，一种金属螯合剂。
一般和胰蛋白酶配合使用。
原因在于，钙，镁等金属离子会降低胰酶活力，故在使用胰酶消化液时要配合加入EDTA。
它可以螯合这些离子，消除对胰酶的抑
制。
ED TA用得非常多,一般浓度在0.02%左右。
作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。
注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。
因此，配制时应调节好酸碱度。
它不能被中和。
因此，消化下来的细胞要拿PBS洗一遍。
胰酶
这是用得最多的，常用浓度在0.25%。
作用时间根据细胞种类、作用温度、作用ph等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。
0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。
主要作用于细胞间。
配制时不能用含钙、镁离子的平衡液，否则影响活性。
终止是用血清蛋白，血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂。
保存于-20度。
胶原酶。
这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下细胞。
这种方法作用温和，对细胞损伤较小，价格也较贵，不易保存，使用期限短，中止同样是用血清蛋白。
胰酶使用注意
1．在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌、支原体污染。
2．胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，过长会损伤细胞，导致细胞铺板后生长状况较差。
贴壁细胞的消化
1．吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的死细胞/血清。
2．加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，根据胰酶效率差异可以增加惑减少胰酶用量，室温放置2-5分钟（不同的细胞消化时间有所不同）。
3．显微镜下观察，细胞明显皱缩成圆形，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状；或者在瓶壁上有部分成点状区域细胞脱落；或者用手拍打克氏瓶正好能够使细胞脱落；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。
4．此时加入含血清的完全细胞培养液停止消化，吹打下细胞，即可直接用于后续实验；如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。
钙离子、镁离子和血清蛋白的存在会降低胰酶活力。
因此，胰酶溶液常用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks’平衡盐溶液配制成0.25%溶液。
消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，或胰蛋白酶抑制剂能终止胰蛋白酶对细胞的消化作用。
如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。
1000-2000rpm离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。
影响因素
•影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。
•加入胰蛋白酶-EDTA溶液，视细胞瓶的大小加入体积为2ml或更多（依培养器皿的大小而定），以使充分浸润。
•一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶底由半透明（细胞单层连接成片）转为透明、点状（出现细小空隙）时，弃去细胞消化液，或看见培养瓶壁呈白茫状即可，并加入适量的完全培养液终止消化，吹打分散；如见大量细胞片状脱落，已消化过头，这样会造成大量细胞从瓶壁上脱下，甚至造成细胞破碎，此时迅速加入完全培养基终止反应。
* 血清终止的原理
其一解释其实是竞争抑制，就是用过量的牛血清中含有的蛋白来和胰酶结合，不给胰酶消化细胞蛋白的机会。
其二解释就是终止是用血清蛋白，血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂。
* 为什么用胰蛋白酶消化
离；广义上讲，还是取决于其特异性。
谷氨酰胺
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。
在配制各种培养液中都应该补加一定量（3/10000g)的谷氨酰胺。
由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。
加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。
一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。
可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。
配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。
上面是用5个MOI的PRRSV感染Marc-145，72小时后得到的细胞病变图片。
上图是CPE，下图是正常细胞对照。
EDTA
EDTA 是一种重要的络合剂。
EDTA用途很广，可用作彩色感光材料冲洗加工的漂白定影液，染色助剂，纤维处理助剂，化妆品添加剂，血液抗凝剂，洗涤剂，稳定剂，合成橡胶聚合引发剂，EDTA是螯合剂的代表性物质。
能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶性配合物。
1基本信息
【名称】：
中文名称：乙二胺四乙酸。
EDTA[1]
化学名称：Ethylene Diamine Tetraacetic Acid。
化学简称：EDTA
中文别名：四乙酸二氨基乙烷（二氨基乙烷四乙酸），托立龙。
俗名：依地酸（特别是它的钙盐络合物，医学上称为依地酸钠钙）。
英文名称：Ethylenediaminetetraacetic acid
英文别名：(Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid,Edathamil
【线性分子式】：(HO2CCH2)2NCH2CH2N(CH2CO2H)2
【分子式】：C10H16N2O8
【分子量】：292.248（注：EDTA二钠为372.2）。
【密度】: 1.566 g/cm3
【熔点】：250℃
【贮藏】：密封保存。
常温即可。
2理化性能
白色无臭无味、无色结晶性粉末，熔点240℃(分解)。
不溶于冷水、乙醇及一般有机溶剂，微溶于热水，溶于氢氧化钠，碳酸钠及氨的溶液中，能溶于160份100℃沸水。
其碱金属盐能溶于水，钠盐在水中的溶解度见下表(g/L)。
一般用乙二胺四乙酸的钠盐代替
EDTA。
3用途
本品为钙离子络合剂，洗涤剂，血液抗凝剂。
生化研究中用作钙螯合剂，消除微量重金属导致的酶催化反应中的抑XXX用。
EDTA是化学中一种良好的配合剂，它有六个配位原子，形成的配合物叫做螯合物，EDTA在配位滴定中经常用到，一般是测定金属离子的含量，在生物应用中，用于排除大部分过度金属元素离子（如铁（III），镍（II），锰（II））的干扰。
在蛋白质工程及试验中可在不影响蛋白质功能的情况下去除干扰离子。
EDTA用途很广，可用作彩色感光材料冲洗加工的漂白定影液，染色助剂，纤维处理助剂，化妆品添加剂，血液抗凝剂，洗涤剂，稳定剂，合成橡胶聚合引发剂，EDTA是螯合剂的代表性物质。
能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶性络合物。
除钠盐外，还有铵盐及铁、镁、钙、铜、锰、锌、钴、铝等各种盐。
主要用途：乙二胺四乙酸主要用作络合剂，广泛用于水处理剂、洗涤用添加剂、照明化学品、造纸化学品、油田化学品、锅炉清洗剂及分析试剂。
1、高分子化学工业：用作丁苯胶乳聚合活化剂、腈纶生产装置的聚合反应终止剂；
2、日用化学工业：用作多种洗涤剂、护肤品、烫发护发剂的添加剂；
3、造纸业：用作纤维蒸煮时的处理剂、提高纸张白度，减少蒸锅中的结垢；
4、医药工业：与甲酰胺环合可制得乙亚胺，是一种主要用于治疗银屑病的药物，还作为某些疫苗的稳定剂及血液抗凝剂；
5、纺织印染业：提高染料上色率和印染纺织品的色调和白度；
6、在食品行业：可在罐头加工等食品行业中作螯合剂，驱除金属离子的干扰。
7、在分子生物学实验中：是二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性。
此外，EDTA也可用来使有害放射性金属从人体中迅速排泄起到解毒作用。
