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拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定

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纯合体鉴定的原理及方法_

纯合体鉴定的原理及方法_

1.T-DNA插入突变体的鉴定T-DNA插入突变体从拟南芥资源中心（Ohio State University，Columbus）索要。

种子被播种在含有卡那霉素（Kan＋）的MS筛选培养基上，待萌发后10天左右，把生长正常的幼苗移置营养土中。

然后取10天后的叶片提取DNA，PCR进一步鉴定。

其原理如下图所示（图5-1）：LP，RP分别为基因的左边界和右边界，LB为T-DNA上的序列。

用三条引物进行PCR扩增，结果如右图所示。

用LP和RP扩不出条带，而用RP和LB能扩出条带的为突变体纯合株。

图5-1 突变体鉴定原理图纯合体鉴定的原理及方法图1：T-DNA插入的位置图2：纯合体鉴定所示条带By using the three primers (LBb1.3+LP+RP) for SALK lines, users for WT (Wild Type - no insertion)should get a product of about 900-1100 bps ( from LP to RP ), for HM (Homozygous lines - insertions in both chromosomes) will get a band of 410+N bps ( from RP to insertion site 300+N bases, plus 110 bases from LBb1.3 to the left border of the vector), and for HZ (Heterozygous lines - one of the pair chromosomes with insertion) will get both bands. The product size should be 200 base larger if using LBa1 instead of LBb1.3. However, the protocol requires the same or similiar TM values for all the LB, LP and RP primers.纯合体鉴定共需两次才能判定是否是真正的纯合体。

拟南芥TDNA插入突变体的鉴定

拟南芥TDNA插入突变体的鉴定

遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。

二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。

植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。

2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。

突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。

拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。

由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。

3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。

人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。

除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。

4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。

T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。

野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。

所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。

因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。

在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。

T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。

在本实验中使用三引物法。

三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。

野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。

上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。

此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。

图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。

能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。

本实验使用CATB抽提DNA。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。

它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。

拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定

拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定

拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定余振洋（高山山、潘红芳）、09级生技1班、200900140156、2011/12/14摘要本实验通过CTAB法提取目的拟南芥的DNA，再用三引物法PCR扩增所需的目的基因后，用电泳检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。

关键词拟南芥;T-DNA；突变纯和体1．引言T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。

T—DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。

单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。

T—DNA插入突变在反向遗传学和功能基因组学研究中发挥着重要作用。

，T—DNA插入突变能方便地进行正向和反向遗传学研究，因而受到重视。

同时，基因组测序工作的完成使得从位点到表型的反向遗传学研究成为可能，从而使通过T—DNA插入技术构建突变体来研究功能的反向遗传学技术逐渐取代了传统的化学诱变、图位克隆等技术。

借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T—DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。

以T—DNA作为插入元件，不但能破坏插入位点基因的功能，而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化，为该基因的研究提供有用的线索。

由于插入的T—DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。

还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。

由此可见，T—DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。

CTAB法提取植物叶片中的DNA是我们常用的方法。

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。

拟南芥atcwinv1基因T_DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察

拟南芥atcwinv1基因T_DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察

河南农业科学,2011,40(5):62 66Jour nal of H enan Ag ricultural Sciences拟南芥atcwinv1基因T DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察阮燕晔*,张 莹,王 波(沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳110866)摘要:以拟南芥atcw inv1基因T DNA插入纯合突变体和野生型植株为材料,比较研究了2种基因型植株在营养期和生殖期的形态差异。

结果表明:拟南芥atcw inv1基因T DNA插入纯合突变体(简称突变体)较野生型萌发率平均下降5 88个百分点;突变体在44d抽薹,较野生型延后4d;分支数平均4支,较野生型下降20 84%;果荚开裂时间6d左右,较野生型延长2d;单株果荚数平均62 27个,较野生型降低11 00%;单株果荚种粒数平均45 87粒,较野生型降低21 46%;突变体的单果荚长度平均14 52cm,较野生型降低10 24%;单株果质量平均50 83mg,较野生型降低23 70%。

拟南芥突变体在营养生长时期的株高平均10 44cm,较野生型下降21 03%;主根长平均7 62cm,较野生型下降14 96%;单株莲座叶面积平均3 16cm2,较野生型下降13 90%;单株地上部分鲜质量平均81 81m g,较野生型下降11 11%;单株根鲜质量平均6 21m g,较野生型下降17 64%;单株地上部分干质量平均6 17m g,较野生型下降15 60%;单株根干质量平均0 55mg,较野生型下降6 78%。

拟南芥突变体在生殖生长时期的株高平均18 78cm,较野生型增加4 22%;主根长平均16 48cm,较野生型下降5 88%;单株莲座叶面积平均6 80cm2,较野生型下降6 21%;单株地上部分鲜质量平均129 85mg,较野生型下降9 69%;单株根鲜质量平均9 97mg,较野生型下降13 23%;单株地上部分干质量平均9 22mg,较野生型下降4 16%;单株根干质量平均0 70mg,较野生型下降6 67%。

实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定-23页精选文档

实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定-23页精选文档
基础上，通过对靶基因进行特定的加工和修饰，如定 点突变、插入、缺失、置换等，再研究这些修饰对生 物体的表型、性状可能有何种影响，从而了解基因和 其编码蛋白质在生物体内的功能。
模式植物拟南芥
拟南芥（Arabidopsis thaliana ）又称为阿拉伯芥，是一种十字花 科植物，广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究，已成为一种典 型的模式植物。该植物具有以下特点：
植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵； 生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需8周左右； 种子多，每株可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培
养基就可作人工培养； 基因组小，只有5对染色体。 拟南芥是严格的闭花自花受粉植物，
基因高度纯合。易获通过理化处理 获得各种功能的突变体。
外成像仪
实验步骤-拟南芥的栽培
一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使 种子在湿润条件下春化2至3天。
二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的 培养皿中，置于培养室内培养。
三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置 于培养室内培养。
实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法
1. CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇 =24：1、无水乙醇、70%乙醇、TE
2. PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP） 、DNA模版、Taq DNA聚合酶
3. 电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE
❖ 仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫
每小组按10倍准备混合体系； 每个同学需做一颗植株的鉴定（两管PCR）。
LP: JDM17-1NR2 RP: JDM17-1F2 BP: LBb1.3

拟南芥atcwinv1基因T-DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察

变体 （ 简称 突 变体 ） 野 生型 萌发 率平 均 下 降 ５ ８ 较 ． ８个 百分 点 ； 变体在 ４ 突 ４ ｄ抽 薹 ， 野 生 型延 后 较 ４ ； 支数 平 均 ４支 ， 野 生型 下降 ２ ． ４ ； 荚 开裂 时 间 ６ 分 ｄ 较 ０ ８ 果 右 ，较 野 生型 延 长 ２ ； 株 果 荚 ｄ左 单 ｄ 数 平均 ６ ． ７个 ， 野 生型 降低 １． ０ ； ２２ 较 １ Ｏ 单株 果 荚种 粒 数平 均 ４ ． ７粒 ， 野 生型 降低 ２ ． ６ ； ５８ 较 １４ 突变体 的单 果 荚长度 平均 １ ． ２ ｍ，较野 生 型 降低 １ ． ４ ； ４ ５ ｃ ０ ２ 单株 果质 量 平均 ５ ． ３ ， 野 生 型 ０ ８ ｍｇ 较 降低 ２ ． ０／。拟 南芥 突变体在 营养 生长 时期 的株 高平 均 １ ． ４ ｍ， 野 生 型 下 降 ２ ． ３ ； ３ ７ ９ ６ Ｏ４ 较 ｃ １ ０ 主根
ＰＣＲ ｄ ｎ ｉｉａ ｉ ｎ ａ ｄ Ｐｈ ｎ ｔ ｐ ｃ Ｏｂ ｅ ｖ ｔｏ ｆａ ｃ ｉ ｖ Ｉ ｅ ｔｆｃ ｔｏ ｎ ｅ ｏ ｙ ｉ ｓ ｒ ａ ｉ ｎ ｏ ｔｗ ｎ ｌ Ｇｅ ｅ Ｔ— ｎ ＤＮＡ ｎ ｅ ｔｏ ａ ｕ ａ ｔｏ ｒ ｂ ｄｏ ｉ Ｉ ｓ ｒ ｉ ｎ ｌＭ ｔ ｎ ｆＡ ａ ｉ ｐｓｓ
ｕ ｅ ｏ ｃ ｍ ｐａ ｅ ｐ ａ ｓ ｄ ｔ ｏ ｒ ｌ ｎｔｍｏｒ ｈｏｌ ｉ ａ ｉｆ ｒ ｎｃ ｓ ｉ ｈｅ ｐｅ ｉ ｇｅ ａ ｉ ｅ ｇ ｏｗｔ ｎｄ ｒ ｐｒ ｄｕｃ ｐ ｏｇ ｃ ｌｄ ｆ ｅ ｅ ｅ ｎ ｔ ｒｏｄ ｏｆｖｅ ｔ ｔｖ ｒ ｈ ａ ｅ ｏ — ｔｖ ｏ ｈ． ｉ ｅ ｇｒ ｗｔ Ｔｈｅｒ ｓ ｔ ｈ ｅ ｕｌｓ ｓ ｏｗｅ ｈａ ｏ ｐ ｒ ｄ ｔ ｈｅ ｗｉｄ ｔ ｐｅ ｔ ｒ ｉ ａ ｉ ｎ ｒ ｔ ｆａｔｗｉ ｌ ｄ ｔ ｔｃ ｍ ａ ｅ ｏ ｔ ｌ ｙ ｈｅ ｇｅ ｍ ｎ ｔｏ ａ ｅ ｏ ｃ ｎｖ ａ ｅ ａ ｅ ｙ ｄｅ ｒ ａ ｅ ５ ｖ ｒ ｇ ｌ ｃ ｅ ｓ ｄ ｂｙ ．８８ ｐｅ ｃ ｎｔ ｇｅ ｐ ｎ ｓ； ｏｍｐａ ｅ ｏ ｈ ｗｉｄ ｔ ｅ， ｌｉ ｉ ｅ ｆ ａｒ－ ｒ ｅ ａ ｏｉ ｔ ｃ ｒ ｄ ｔ ｔ ｅ ｌ ｙｐ ｂｏ ｔｎｇ ｔｍ ｏ ｃ

拟南芥突变体的功能鉴定及应用

拟南芥突变体的功能鉴定及应用拟南芥是一种模式植物，因其具有小型、短周期、基因底子丰富等特点，成为了植物学和遗传学领域的研究工具。

通过突变体的筛选，拟南芥成为了研究植物生长发育和基因功能的重要模式植物之一。

在拟南芥突变体筛选中，以T-DNA插入技术为主，通过敲定不同基因，以观察植物的生长发育状态，挖掘新的生物学机制。

拟南芥突变体是利用突变体筛选技术，自然形成的或通过基因操作人工获得，产生了某些特殊表型的植物。

以T-DNA插入技术为例，将T-DNA随机插入到植物基因组中，导致部分基因的功能紊乱，从而产生了特殊的表型表现。

因此，拟南芥突变体不仅具有丰富的基因型资源，也是研究基因功能、分子生物学和植物生长发育的重要材料，其发现和应用有直接联系。

因此，如何鉴定拟南芥突变体的功能尤为重要。

目前鉴定方法主要包括：表型分析、基因克隆、启动子分析、蛋白质相互作用网络分析、分子标记等技术手段。

表型分析是首先考虑的鉴定方法，通过比较突变体与野生型在不同生长条件下的表型差异，筛选出表现异常的突变体。

对鉴定有难度的突变体，使用其他鉴定方法，如基因克隆，会有更好的效果。

其中，启动子元素克隆有助于探究基因表达特异性。

蛋白质相互作用网络分析有用于探究基因调控网络方式。

分子标记在表型特征不明显时，如果phentoype特征无法激活突变体，可以发现突变原因及搜索对应的遗传切口。

同时，拟南芥突变体在研究中的应用也非常广泛。

例如：研究花器官发育中的关键基因，通过拟南芥突变体突变鉴定方法，筛选出相关基因，进而探究开花的分子机制。

利用拟南芥突变体进行耐盐性、耐旱性等方面的研究。

在探究植物防御基因的调节网络时，拟南芥突变体也广泛地使用。

此外，还可用作药物和环境污染物筛选的生物传感材料，如zinc、生物染色体修复等方面的研究。

拟南芥突变体是全面了解植物生物学机理的重要材料，是揭示生长发育和基因功能的主要途径之一。

随着逆境应对、营养吸收、发育调控等方向的研究的深入，对拟南芥突变体的催生和应用必将愈加广泛。

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定.

2. 65℃水浴0.5 h，其间轻摇混匀。 3. 向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下
轻轻混匀10 min，然后12000 rpm离心15 min，再转移上 清入新管中。 4. 向上清液中加2倍体积的无水乙醇，小心混匀。-20 ℃ 放置30 min，12000 rpm离心15 min，弃上清。 5. 用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 6. 将沉淀再空气中晾干10 min或37 ℃ 烘箱中3-4 min。加 20 μ L TE (pH 8.0)室温溶解。-20 ℃保存。
在这个网页里可以从上面的一 些文字得到常用中间引物的序 列，在下面的输入框里输入 SALK_151561.52.85.n号 后，即可得到左侧和右侧的引 物：
也即：SALK_151561.52.85.n PRODUCT_SIZE 1170
PAIR_ANY_COMPL 0.00 PAIR_3'_COMPL 0.00
DIFF_TM 0.55 LP TCTAGGAAATCGATCGGGTTC
Len 21 TM 60.40 GC 47.62 SELF_ANY_COMPL 0.55
3'_COMPL 0.00 RP GAGAGCATGTAAGGATGCTGG
Len 21 TM 59.85 GC 52.38 SELF_ANY_COMPL 0.55
现在，特异性敲除基因的拟南芥种子库已经创建，向 全世界的科研人员开放。研究一个特拟南芥生物资源中心订购。
2012.11.28
5
AT1G69120基因
AT1G69120基因即APETALA1，已有实验证明 AT1G69120是拟南芥花分生组织特征基因。
7
查找基因AT1G69120

实验五 拟南芥T DNA插入突变纯合体的鉴定


一ml 一三五 三’引物[一0 mmol/L] 一ml 一三五 三’引物[一0 mmol/L]
三0ml反应体系二：
三0ml反应体系四：
二ml 植物基因组DNA样品[WT]
二ml 植物基因组DNA样品[一一一]
三ml 一0×扩增缓冲液
三ml 一0×扩增缓冲液
0.五 ml Taqase [五U/ml]
0.五 ml Taqase [五U/ml]
0.五 ml dNTP[一0 mmol/L]
0.五 ml dNTP[一0 mmol/L]
一ml 一三五 三’引物[一0 mmol/L] 一ml 一三五 三’引物[一0 mmol/L]
一ml LBa 引物[一0 mmol/L]
一ml LBa 引物[一0 mmol/L]
电泳检测
• 每个大组选两个人点样,电泳结果扫描保存, 下次课看结果,
• LBa一 of pBIN-pROK二 for SALK lines： TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
植物基因组DNA的快速提取
[一]取植物叶片[拟南芥一片叶子],置于一.五ml离心管中,加入四00 ml提取缓冲液;
[二]用研磨棒研磨植物材料,直至缓冲液变为绿色; [三]在台式离心机上一三000 rpm离心五分钟; [四]离心后将上清三00 ml转移至一个新的一.五 ml离心管中; [五]在上清中加入三00 ml异丙醇,混匀后于室温下一三000 rpm条
用无菌水补足体积,
PCR反应条件
八四℃ 三min 三0循环 [八四℃/一min,五五℃/一min,七二℃/一min]; 七二℃ 延伸一0min,
注：反应条件需根据所要扩增产物的大小和 引物的性质进行合适的调整,
PCR安排
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拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
实验目的
1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法； 2．掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突 变体的方法。
T-DNA插入鉴定的原理
突变体鉴定的步骤
1. 2. 3. 4. 5. 6. T-DNA插入基因的基因组序列； T-DNA插入方向的确定； T-DNA插入位置的确定； 引物设计； PCR扩增； 电泳检测。
点击突变体编号后进入的网页

进入网站/cgi-bin/tdnaexpress 查找基因突变体及插入方向
实验设计
T-DNA方向
3’引物
基因方向
5’引物
引物设计
• 基因上面引物的设计可以通过下面提供的拟南芥 网站/tdnaprimers.html进行 自动生成，也可以根据自己的需要进行设计。一 般进行鉴定的引物距离T-DNA插入的位置300bp 以上为宜，即300+N bp。
T-DNA插入基因的基因组序列

点击基因编号进入网页

点击sequence viewer进入

点击nucleotide view进入

PCR反应条件
94℃ 3min 30循环 （94℃/1min，55℃/1min，72℃/1min）； 72℃ 延伸10min。 注：反应条件需根据所要扩增产物的大小和 引物的性质进行合适的调整。
PCR安排
每小组四个PCR反应，引物和DNA模板分别如下： 1.WT基因组模板2个PCR反应：引物分别为基因自 身的5‘和3’端引物；5‘引物和LBa引物。 2.突变体基因组为模板2个PCR反应：引物分别为基 因自身的5‘和3’端引物；5‘引物和LBa引物。
• LBa1 of pBIN-pROK2 for SALK lines： TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
植物基因组DNA的快速提取
（1）取植物叶片（拟南芥一片叶子），置于1.5ml离心管中，加 入400 ml提取缓冲液； （2）用研磨棒研磨植物材料，直至缓冲液变为绿色； （3）在台式离心机上13000 rpm离心5分钟； （4）离心后将上清300 ml转移至一个新的1.5 ml离心管中； （5）在上清中加入300 ml异丙醇，混匀后于室温下13000 rpm条 件下，离心5分钟； （6）弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温下干燥沉淀； （7）100 ml TE溶解沉淀，将制备好的样品在4℃保存备用。
30ml反应体系2： 30ml反应体系4： 2ml 植物基因组DNA样品（WT） 2ml 植物基因组DNA样品（111） 3ml 10×扩增缓冲液 3ml 10×扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 3’引物（10 mmol/L） 1ml 135 3’引物（10 mmol/L） 1ml LBa 引物（10 mmol/L） 1ml LBa 引物（10 mmol/L）
电泳检测
• 每个大组选两个人点样，电泳结果扫描保 存，下次课看结果。
（此方法提取的基因组DNA只适用于PCR的鉴定，不适合酶切和大片段基因的扩增）
PCR鉴定
30ml反应体系： 2ml 植物基因组DNA样品 3ml 10×扩增缓冲液 0.5ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 引物1（10 mmol/L） 1ml 引物2（10 mmol/L） 用无菌水补足体积。
135号突变体的鉴定（7-11组）
30ml反应体系1： 2ml 植物基因组DNA样品（WT） 3ml 10×扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5’引物（10 mmol/L） 1ml 135 3’引物（10 mmol/L） 30ml反应体系3： 2ml 植物基因组DNA样品（111） 3ml 10×扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5’引物（10 mmol/L） 1ml 135 3组）
30ml反应体系1： 30ml反应体系3： 2 ml 植物基因组DNA样品（WT） 2 ml 植物基因组DNA样品（111） 3 ml 10×扩增缓冲液 3 ml 10×扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10mmol/L） 0.5 ml dNTP（10mmol/L） 1 ml 046 5’引物（10mmol/L） 1 ml 046 5’引物（10mmol/L） 1 ml 0463’引物（10mmol/L） 1 ml 0463’引物（10mmol/L） 30ml反应体系2： 30ml反应体系4： 2 ml 植物基因组DNA样品WT 2 ml 植物基因组DNA样品（111） 3 ml 10×扩增缓冲液 3 ml 10×扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1 ml 046 5’引物（10 mmol/L） 1 ml 046 5’引物（10 mmol/L） 1 ml LBa 引物（10 mmol/L） 1 ml LBa 引物（10 mmol/L）