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第4章抗菌药物敏感试验一、需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验1.扩散法（K-B法）（1）原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在接种有待检菌的琼脂平板上，该点称为抗菌药源。
药物向周围扩散，形成了随着药源距离增加，琼脂中药物浓度递减的浓度梯度。
在药源周围可抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，形成无菌生长的透明圈即抑菌圈，其大小可以反映待检菌对测定药物的敏感性，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
（2）实验材料①培养基：采用水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH为7.2，琼脂厚度4mm。
对生长条件要求高的细菌，如链球菌属细菌需加入5%脱纤维羊血，嗜血杆菌属细菌需加入1%血红蛋白（含Ⅴ因子）和1%Ⅹ因子复合物。
②抗菌药物纸片：选用直径为6.35mm，吸水量20μl的专用药敏纸片。
制备时取灭菌药敏纸片，经加样或浸泡药物溶液后冷冻干燥，置4℃保存备用，在有效期内使用。
③接种菌液挑取平板上形态相同的菌落4～5个，接种于3～5ml M-H肉汤中，于35℃中培养2～8h。
嗜血杆菌属和链球菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。
用生理盐水或肉汤校正菌液至0.5麦氏比浊标准（相当于1.5×109/ml的含菌量）后在15min内接种。
（3）试验方法以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液（其浊度为0.5麦氏比浊标准），在M-H琼脂表面均匀涂布接种3次，每次平板旋转60°，最后沿平板内缘涂抹１周。
平板置室温干燥3～5min，后用无菌镊子或专用纸片分配器将含药纸片贴于琼脂表面。
纸片应贴得均匀，各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm。
直径为90mm的平板可贴6张纸片。
纸片贴牢后应避免再移动。
平板室温放置15min后倒置于35℃培养箱中培养16～18h后读取结果。
（4）结果解释平板置黑色背景上，从背面量取包括纸片直径在内的抑菌圈直径，单位为mm。
培养基中如果加有血液须打开皿盖从正面测量抑圈菌。
抗菌药物敏感性实验与细节耐药性监测来源：查验医学在线2009-4-15 南网编辑2010-7-6一、需氧菌及兼性厌氧菌的药物敏感实验(一)纸片琼脂扩散法纸片琼脂扩散法又称Kirby-Bauer实验，是操作最简易、利用最普遍的抗菌药物敏感性实验。
1．实验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系，即抑菌圈越大，MIC越小。
2．培育基和抗菌药物纸片(1)培育基：水解酪蛋白(Mueller-Hin-ton，MH)培育基是CLSI/NCCLS采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏实验标准培育基，pH值为～，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。
琼脂厚度为4mm。
配制琼脂平板当天利用或置塑料密封袋中4℃保留，利用前应将平板置35℃孵育箱孵育，使其表面干燥。
(2)抗菌药物纸片：选择直径为6.35mm，吸水量为20ul的专用药敏纸片用逐片加样或浸泡方式使每片含量达到规定所示。
含药纸片密封贮存2～8℃或-20℃无霜冷冻箱内保留，β-内酰胺类药敏纸片应冷冻贮存，且不超过l周。
利用前将贮存容器移至室温平衡l～2h，避免开启贮存容器时产生冷凝水。
3．细菌接种细菌接种采用直接菌落或细菌液体生长方式。
用麦氏比浊标准的菌液浓度。
校正浓度后的菌液应在15min内接种完毕。
接种步骤如下：①用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂片接种3次，每次旋转60°，最后沿平板内缘涂抹1周；②平板置室温下干燥3～5min，用纸片分离器或无菌镊将含药纸片紧贴于琼脂表面；③置35℃孵育箱孵育16～18h后阅读结果，对甲氧西林和万古霉素药敏感实验结果应孵育24h。
抗菌药物敏感性试验执行标准抗菌药物敏感性试验是临床微生物学中非常重要的一项实验，它可以帮助医生选择最有效的抗菌药物来治疗感染性疾病。
执行标准的严格性和准确性对于试验结果的可靠性至关重要。
下面将介绍抗菌药物敏感性试验执行标准的相关内容。
首先，进行抗菌药物敏感性试验前，需要准备好所需的培养基、试验材料和各种试剂。
同时，要做好实验室的消毒和无菌操作，以确保试验的准确性和可靠性。
在进行试验时，需要按照严格的操作规程进行。
首先，要准备好待测菌株的悬浮液，然后按照一定比例将其接种到含有不同浓度抗菌药物的琼脂平板上。
接种后，要在恒温培养箱中进行培养，培养时间一般为16-18小时。
培养结束后，需要观察菌落的生长情况，并进行相关的数据记录和分析。
根据菌落的生长情况和抗菌药物的浓度，可以判断出菌株对抗菌药物的敏感性。
在记录和分析数据时，要注意细致入微，确保数据的准确性和可靠性。
在执行标准中，对试验结果的解释和判定也非常重要。
根据试验结果，可以判断出菌株对抗菌药物的敏感性、耐药性或者中间敏感性。
这些判定对于临床治疗具有指导意义，可以帮助医生选择最合适的抗菌药物来治疗感染性疾病。
此外，在执行标准中，还需要对试验过程中可能出现的干扰因素进行控制和排除。
比如，培养条件、试剂质量、操作技术等都可能对试验结果产生影响，需要在试验过程中进行严格的控制和调节。
总的来说，抗菌药物敏感性试验执行标准的严格性和准确性对于试验结果的可靠性至关重要。
在实验过程中，需要严格按照操作规程进行，确保试验过程的准确性和可靠性。
同时，对试验结果的解释和判定也非常重要，可以帮助医生选择最合适的抗菌药物来治疗感染性疾病。
在执行标准中，还需要对试验过程中可能出现的干扰因素进行控制和排除，以确保试验结果的准确性和可靠性。
四、抗菌药物敏感性试验（一）药敏试验的目的测定病原微生物对化学治疗药物敏感性的试验称为化疗药物敏感性试验（Drug sensitivity test），简称药敏试验。
药敏试验的主要目的是：①用于测定新的抗菌药物或制剂的抗菌谱；②对病灶分离菌进行流行病学调查，主要应用于测定细菌经过多年后敏感性的变化情况和地区特异性；③在临床治疗感染性疾病时，针对病原菌选择合适的首选药物品种。
（二）药敏试验的原理及种类药敏试验是通过培养基培养的细菌确定细菌对药物的敏感性方法。
将被检菌接种在适当的培养基上，然后加上不同种类或不同浓度的抗菌药物（或制剂），观察细菌生长发育的速度和程度。
用药后，细菌在培养基上停止生长并且死亡，抑菌圈清晰，说明细菌对药物敏感，药物表现有较强的杀菌作用；用药后，细菌停止生长，但液体培养基经过一定时间后还可能出现浑浊或固体培养基上的抑菌圈不清晰，说明细菌对药物比较敏感，预示药物对被检细菌只是起抑菌作用。
通常判定一种药物对细菌的杀菌或抑菌作用的强度指标是固体培养基中抑菌圈的大小，但这也不是绝对的，因为抑菌圈的大小与药物对培养基的渗透性是密切相关的。
药敏试验方法较多，但在原理上不外乎是稀释法和扩散法两大类。
而扩散法（包括纸片法、管碟法）通常适用于临床治疗选择药物。
（三）常用培养基制作法1．普通肉汤培养基牛肉浸膏 3.0克蛋白胨 10.0克氯化钠 5.0克蒸馏水 1000毫升放在三角烧瓶中，微温溶解后，调节pH值至7.4~7.6，煮沸10分钟，冷却后的pH值为7.2±0.2。
15磅压力下灭菌15分钟（115℃灭菌30分钟）即得。
本培养基可用作为固体、鉴别、选择等培养基制造的基础原料，大部分细菌都能在其中生长。
1．普通肉汤琼脂培养基照上述普通肉汤培养基的配方及制法，加入15~20克琼脂，加热溶解后，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟，即得。
3．0.5%葡萄糖肉汤培养基蛋白胨 10克氯化钠 5克葡萄糖 5克牛肉浸膏 3克蒸馏水 1000毫升微温溶解后，调节pH值至弱碱性，煮沸后，加葡萄糖溶解，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟，即得。
4．马丁氏（Martin’s）肉汤培养基蛋白胨液 500毫升肉浸液 500毫升冰醋酸 1毫升醋酸钠 6克葡萄糖 10克将蛋白胨与肉浸液混合，加热至80℃，加冰醋酸1毫升，搅拌均匀，再煮沸5分钟，加15%氢氧化钠20毫升，调整pH至7.2。
加醋酸钠6克，再调整pH 至7.2。
继续煮沸10 分钟，用滤纸过滤，每1000毫升滤液加葡萄糖10克，分装于500毫升三角烧瓶，高压蒸汽灭菌（15磅）15 分钟。
本培养基可用作传染性胸膜肺炎病原体等的分离与培养。
5．革兰氏阴性菌（G-N）增菌培养基胰蛋白胨 20克去氧胆酸钠 0.5克葡萄糖 1克无水磷酸二氢钾 4克甘露醇 2克无水磷酸氢二钾 1.5克枸橼酸钠 5克氯化钠 5克水 1000毫升将各组分加热溶化，调整pH值至7.0，用滤纸过滤；分装于18×100毫米小试管中，每管约1.5毫升，高压蒸汽灭菌（15磅）15 分钟，置冰箱备用。
用于粪便选择性疾病杆菌，样本接种后，最初6小时无论在室温还是在37℃都有增菌作用。
而在这一时期中，大肠杆菌和变形杆菌等生长很少，故在6小时后，再作用平板分离。
（四）临床用药选择药敏试验法——扩散法（Diffusion method）扩散法是在琼脂培养基（多采用平板培养基）上接种被检菌，将药物（药剂）配成一定浓度加在培养基上，培养一定时间后观察接种菌是增殖还是抑制.这是测定药物（药剂）对被检菌抗菌力强度的方法，本法可用于多种药物（药剂）对一种细菌的抗菌作用进行同时测定，有利于为临床选择药物。
首先把可流动的固体培养基（加热后的固体培养基）平铺在平皿内冷却使其凝固，在其表面上将菌液（被检菌）均匀地涂抹开（也可将培养基溶解后在其凝固前将菌液与之稀释制成双碟，见后）。
然后在其中以适当的间隔放置已知浓度的药物（药剂）（例如含有药剂的纸片、片剂、滤纸、小钢管等），药液（药物）向培养基内及其周围渗透扩散。
将上述的平皿放在一定的条件下（通常为37℃）的培养箱中培养一定时间（通常为16~24h）。
以是否形成抑菌圈或抑菌带及其抑菌圈大小来判定被检菌对药物的敏感性，测定药物（药剂）的抗菌强度。
1．敏感性圆片法（Sensitivity disc method）本法所使用的圆片即含有一定量的抗菌药物的干燥圆形滤纸（或片剂）。
使用这些圆片检查病料中细菌的敏感性的方法有间接法和直接法两种。
间接法是将脓汁、血清、粪便滤液等临床材料在不含药物的分离培养基中进行分离培养后，采取分离培养的典型菌落进行敏感性试验。
直接法是将病料直接涂抹在琼脂培养基上，在其上放置含药纸片进行培养观察细菌对药物的敏感性方法。
在接种有病原菌的琼脂培养基上，放置含有药剂的纸片的地方，如果其药物对病菌有抑制作用，则在其纸片的周围会出现抑菌圈或抑菌带，测量其抑菌圈（带）的有无及其大小就可能判定菌株对药物的敏感性。
直接法以非混合感染只含有某一种细菌的脓汁、血清、粪便滤液等作为被检材料时，其优点是它比间接法能更快地得到结果，缩短药敏试验的时间。
但若在被检材料中除目的病原菌以外，还混有其他细菌则会给结果判定带来困难。
间接法虽然需要时间，但能从临床病料中较准确地测定目的病原菌对药物的敏感性。
（1）单一药物浓度圆片法即采用含有一种药物浓度的圆片所进行的药敏试验法。
其操作过程如下：琼脂平板用培养基制备要求培养基中不含使药物抗菌力降低的成分，而且应选择对多种细菌都能生长发育良好的培养基（见普通肉汤培养基）。
平板的制备将融化的琼脂培养基约20毫升倒入内径为85~90毫米的玻璃或塑料平皿中制成平板，操作应在水平的平面上进行，使培养基均匀水平地分布在平皿内（有要求血液的被检菌时，如链球菌、肺炎球菌、白喉菌、巴氏杆菌等）应在普通肉汤琼脂培养基中加5%的血液。
琼脂平板凝固后，在接种前应放在孵化器中30 分钟使琼脂表面水汽干燥。
菌量及接种法被检菌液，用灭菌生理盐水等制备成5×108个/毫升的菌液，用1白金耳（约0.05毫升）在琼脂培养基表面上接种，接种采用直径为4~6毫米的灭菌玻璃球20个滚动使菌液均匀涂布在整个平皿琼脂平板的表面（约使琼脂表面的菌数为1~10×104/cm2）。
圆片的放置与培养用灭菌镊子轻轻地夹起含药圆片，放置在培养基的表面，使圆片与琼脂面紧密相贴，通常可在一个平板培养基上等间隔放置3~6个圆片，放置圆片后立即放到37℃的培养箱内培养（16~24小时，平皿应盖上陶瓷盖）。
结果判定培养后，测定圆片周围抑菌圈的直径，将该药剂对被检菌敏感性的抑菌圈直径与敏感标准的抑菌圈相比较，判定结果分为4级：最敏感（+++）；相当敏感（++），稍敏感（+）；耐药（-）。
另外，用本法，根据其抑菌圈的出现可求出最小抑菌浓度（MIC）。
由于各种因素如培养基种类、平板培养基厚度、接种的菌量、药物在培养基中的扩散能力、培养时间，均能影响试验结果。
因此测定时应尽可能将试验条件保持一致，降低测定误差。
（2）三种浓度圆片法本法是采用一种药物（药剂）含有高、中、低3个等级药物浓度的圆片组成的药敏试验法。
操作过程与上述一种浓度法基本相同，但在判定时不需再测定抑菌圈直径，因此，培养基的种类、培养基量、接种菌量对结果的判定影响不是十分明显，且在一个平板上可放置3种（9片）纸片。
判定方法根据含药圆片周围有无抑菌圈来确定其敏感性。
具体地说，从圆片周边算起有1毫米以上的抑菌圈时均为阳性，1毫米以下为阴性。
高中低三种浓度圆片都有抑菌圈时为（+++）极敏感；仅中高浓度有抑菌圈时为较敏感（++）；仅高浓度有抑菌圈时为比较有耐药性；高浓度圆片也无抑菌圈时为有耐药性。
2．管碟法（1）器械琼脂平皿、无菌吸管、无菌小钢管（牛津杯）、无菌镊子、无菌滴管、游标卡尺。
（2）分离并培养被检菌种将病料如脓汁、血液、粪便滤液、组织放在分离选择培养基上培养，挑起典型目的菌落，增殖培养制取菌液并对被检菌液进行细菌计数。
（3）双碟制备肉汤琼脂培养基底层：将肉汤琼脂培养基液化，取10毫升倒入灭菌玻璃平皿内，放在水平平面上，使培养基水平均匀地铺在平皿内；肉汤琼脂培养基菌层：吸取被检菌液（106~108个/毫升）0.1~1毫升分别与100毫升冷至45—50℃的肉琼脂培养基混匀，取5毫升均匀摊布在底层培养基上。
即得双碟。
（4）待双碟中培养基凝固后，在每碟中均匀放置小钢管（即牛津杯，内径6.0±0.1毫米，高10.0±0.1毫米，外径7.8±0.1毫米）4~6个，用陶瓦盖复盖。
（5）然后将不同种类不同浓度的药液用无菌滴管加入小钢管中（不同浓度的药液以100微克/毫升为起点，用2倍稀释法，使其药液效价为100、50、25、12.5……0.025微克/毫升）。
用蒸馏水作对照。
（6）置37℃恒温箱中培养16~24小时，用游标卡尺量取抑菌圈的大小，判定其结果：①如果抑菌圈清晰，即表示为杀菌作用；②如果有抑菌圈，但不清晰，即表示为抑菌作用；③在一定的范围，抑菌圈的大小一般与药物作用（抗菌）成正比例；④如果抑菌圈比小钢管（牛津杯）的外径7.8毫米大1毫米，即表示有抑菌作用，因此可根据这一标准，通过试验找出某一药物对某一病菌的最小抑菌浓度（MIC）；⑤如果没有抑菌圈即表示耐药。
(操继跃)。
