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实验四细菌、真菌、放线菌的分离与培养实验报告课程名称：环境微⽣物学实验实验类型：综合实验实验项⽬名称：微⽣物的分离与培养与菌落观察学⽣姓名：专业：环境⼯程学号：同组学⽣姓名：指导⽼师：实验地点：实验⽇期：2018 年 10⽉16⽇⼀、实验⽬的和要求1.掌握微⽣物接种培养技术2.掌握微⽣物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察⽅法，认识并理解它们的形态特征。
⼆、实验内容和原理⼟壤是微⽣物⽣活的⼤本营，是寻找和发现具有重要价值微⽣物的主要菌源。
在不同⼟壤中，各类微⽣物的数量千差万别。
为了分离获得某种微⽣物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗⽣素抑制不需要的微⽣物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微⽣物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接⾄新鲜平板上，即可使⽬的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微⽣物群体中获得只含有某⼀种或某⼀株微⽣物的过程称为微⽣物分离与纯化。
在分⼦⽣物学的研究及应⽤中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微⽣物群中分离出特定的微⽣物，⽽且还必须随时注意保持微⽣物纯培养物的“单⼀性”，防⽌其他微⽣物的混⼊。
2.平板涂布法：因为将微⽣物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采⽤稀释倒平板法也会使⼀些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧⽓⽽影响其⽣长，因此在微⽣物学研究中常⽤的纯种分离⽅法是涂布平板法。
⽤途上，⼀般多⽤于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进⾏分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微⽣物的⽅法是平板划线法，其原理是将微⽣物样品在固体培养基表⾯多次作“由点到线”稀释⽽达到分离⽬的的。
划线的⽅法很多，常见的⽐较容易出现单个菌落的划线⽅法有斜线法、曲线法、⽅格法、放射法、四格法等。
细菌的分离培养实验报告细菌的分离培养实验报告细菌是微生物中的一类重要生物体，它们广泛存在于自然界的各个环境中，包括土壤、水体、空气以及人体等。
研究细菌的分离培养对于了解其生态特征、代谢能力以及与人类健康相关的病原性等方面具有重要意义。
本次实验旨在通过分离培养的方法，获取和鉴定不同细菌菌株，从而深入了解细菌的多样性和功能。
实验材料和方法：1. 实验材料：含有营养成分的琼脂平板、离心管、移液器、无菌培养皿等。
2. 实验方法：将待分离的样品（如土壤、水样等）加入到含有营养成分的琼脂平板中，用无菌棉签均匀涂抹在平板表面，然后在恒温培养箱中进行培养。
实验结果与讨论：经过一段时间的培养后，我们观察到了琼脂平板上的细菌生长。
细菌形态的多样性令人惊叹，有的细菌呈圆形，有的呈椭圆形，还有的呈链状、菌丝状等。
这种多样性反映了细菌在适应各种环境中的进化和适应能力。
为了更好地了解这些细菌的特性，我们进行了进一步的分离培养。
首先，我们选择了一些形态和颜色不同的菌落进行分离。
通过无菌棉签的转接，我们将这些菌落分别接种到新的琼脂平板上。
经过培养，我们得到了一系列纯培养的细菌菌落。
接下来，我们对这些纯培养的细菌进行了形态观察和生理生化试验。
形态观察包括细菌的大小、形状、颜色等特征，而生理生化试验则包括对细菌的代谢能力、酶活性等方面的测试。
通过这些试验，我们可以初步了解细菌的分类和功能。
在形态观察中，我们发现了一些细菌呈现出独特的特征。
比如，某些细菌呈现出亮黄色的菌落，这可能与其代谢产物有关。
而另一些细菌则呈现出粘稠的菌落，这可能与其产生胶原蛋白等粘附物质有关。
这些特征为我们进一步研究细菌的功能和应用提供了线索。
在生理生化试验中，我们使用了一系列常见的试剂和培养基，如甲基红试剂、氧化酶试剂、柠檬酸盐培养基等。
通过对细菌的反应观察，我们可以初步判断其代谢能力和酶活性。
例如，某些细菌在柠檬酸盐培养基上呈现出黄色，这可能是由于其产生了柠檬酸酶。
第1篇一、实验目的1. 学习微生物学的基本实验操作技能。
2. 掌握细菌的分离纯化方法。
3. 了解细菌的形态学和生理学特征，进行初步鉴定。
二、实验原理细菌是单细胞微生物，广泛分布于自然界。
本实验通过平板划线法或稀释涂布平板法分离纯化细菌，观察其形态学特征，并利用生理生化实验对其进行初步鉴定。
三、实验材料与仪器1. 材料：土壤、无菌生理盐水、牛肉膏蛋白胨琼脂平板、细菌培养箱、显微镜、酒精灯、接种环等。
2. 仪器：高压蒸汽灭菌器、无菌操作台、恒温培养箱、移液器、试管、烧杯等。
四、实验步骤1. 土壤样品的处理（1）取土壤样品10g，加入90ml无菌生理盐水，振荡混匀。
（2）用无菌纱布过滤，收集滤液。
2. 细菌的分离纯化（1）取滤液1ml，加入9ml无菌生理盐水，制成10^-1稀释液。
（2）取10^-1稀释液0.1ml，涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂平板上。
（3）重复步骤（2），制作10^-2、10^-3稀释液的涂布平板，共计3个。
（4）将平板倒置，放入细菌培养箱，37℃培养24小时。
3. 细菌的形态学观察（1）将长出的菌落挑取少量，制作临时玻片。
（2）在显微镜下观察菌落的形态、大小、颜色等特征。
4. 细菌的生理生化实验（1）将长出的菌落分别接种于下列培养基：a. 硫酸铜琼脂培养基：用于检测硫化氢产生。
b. 硝酸盐还原培养基：用于检测硝酸盐还原。
c. 氧化酶试验培养基：用于检测氧化酶活性。
（2）将接种后的培养基放入细菌培养箱，37℃培养24小时。
（3）观察并记录实验结果。
五、实验结果与分析1. 细菌的分离纯化通过平板划线法，成功分离出细菌纯培养。
2. 细菌的形态学观察在显微镜下观察到菌落呈圆形、表面光滑、边缘整齐、颜色为白色。
3. 细菌的生理生化实验a. 硫化氢产生实验：菌落周围出现黑色沉淀圈，说明该菌能产生硫化氢。
b. 硝酸盐还原实验：菌落周围出现红色沉淀圈，说明该菌能还原硝酸盐。
c. 氧化酶活性实验：菌落周围出现蓝色，说明该菌具有氧化酶活性。
细菌的分离与培养实验报告一、实验目的1、掌握细菌分离与培养的基本原理和方法。
2、学习并熟悉无菌操作技术。
3、观察细菌在不同培养基上的生长特性。
二、实验原理细菌在自然界中广泛存在，通常以混合群体的形式存在。
为了研究某一种细菌的特性，需要将其从混合菌群中分离出来，并在适宜的条件下进行培养。
本实验采用平板划线法和稀释涂布平板法进行细菌的分离，利用不同的培养基为细菌提供生长所需的营养物质，使其能够生长繁殖形成单个菌落，从而达到分离和纯化的目的。
三、实验材料与设备1、样品：土壤、污水等。
2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、马丁氏培养基等。
3、试剂：无菌水、75%酒精、碘酒等。
4、仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、移液器、接种环、酒精灯等。
四、实验步骤（一）无菌操作准备1、开启超净工作台的紫外灯，照射 20 30 分钟，关闭紫外灯，打开风机，通风 10 分钟左右。
2、用 75%酒精擦拭超净工作台台面和双手。
（二）样品处理1、称取 10g 土壤样品，放入装有 90ml 无菌水的三角瓶中，充分振荡，制成 10⁻¹浓度的土壤悬液。
2、用移液器吸取 1ml 10⁻¹浓度的土壤悬液，加入装有 9ml 无菌水的试管中，充分混匀，制成 10⁻²浓度的土壤悬液。
依次类推，制成10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵等不同浓度的土壤悬液。
（三）平板划线法分离细菌1、点燃酒精灯，在酒精灯旁将接种环在火焰上灼烧灭菌，冷却后蘸取 10⁻³浓度的土壤悬液，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上进行划线。
2、划线的方式可以采用连续划线法或分区划线法。
连续划线法是从平板的一端开始，连续作紧密的波浪式划线，直至平板的另一端；分区划线法是将平板分成四个区域，每次划线都从上次划线的末端开始，使细菌逐渐被分散和稀释。
3、划线完成后，将平板倒置，放入 37℃恒温培养箱中培养 24 48 小时。
一、实验目的1. 掌握细菌分离培养的基本原理和方法。
2. 学会使用平板划线法分离纯种细菌。
3. 了解细菌在固体培养基上的生长特征。
二、实验原理细菌分离培养是指从含有多种细菌的混合物中，通过特定的方法将所需细菌分离出来，形成纯培养的过程。
常用的分离方法有平板划线法、稀释涂布平板法等。
平板划线法是一种简便、常用的分离方法，其原理是通过接种环在琼脂平板上划线，使菌液逐渐稀释，从而使单个细菌生长成单个菌落，便于分离纯种细菌。
三、实验材料1. 菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。
2. 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基。
3. 工具：接种环、接种针、酒精灯、无菌镊子、无菌移液器、无菌吸管、无菌培养皿、恒温培养箱等。
四、实验方法1. 平板划线法分离纯种细菌（1）将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，用接种环在平板上划线。
（2）将划线平板倒置，放入恒温培养箱中培养。
（3）观察菌落生长情况，挑取单个菌落，接种于新的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，重复划线分离。
2. 细菌在固体培养基上的生长特征观察（1）将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，用接种环在平板上划线。
（2）将划线平板倒置，放入恒温培养箱中培养。
（3）观察菌落生长情况，记录菌落特征，如菌落大小、形状、颜色、边缘等。
五、实验结果与分析1. 平板划线法分离纯种细菌经过平板划线分离，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均成功分离出纯种细菌。
2. 细菌在固体培养基上的生长特征观察金黄色葡萄球菌菌落呈金黄色，边缘整齐，表面光滑；大肠杆菌菌落呈无色或淡黄色，边缘整齐，表面光滑；枯草芽孢杆菌菌落呈白色，边缘不整齐，表面有皱纹。
六、实验讨论1. 平板划线法是一种常用的分离纯种细菌的方法，其原理是利用接种环在琼脂平板上划线，使菌液逐渐稀释，从而使单个细菌生长成单个菌落。
细菌分离培养实验报告细菌分离培养实验报告一、引言细菌是一类微小的单细胞生物，广泛存在于自然界中，包括土壤、水体、人体等各种环境中。
细菌的分离培养是研究细菌的基础工作，通过分离培养可以得到单一种类的细菌，方便进行后续的鉴定、培养和功能研究。
二、实验目的本实验旨在通过分离培养的方法，从土壤样品中分离出不同种类的细菌，并观察其形态特征、生长情况和代谢能力。
三、实验材料与方法1. 实验材料- 土壤样品- 琼脂培养基- 离心管- 灭菌棉签- 培养皿- 显微镜2. 实验方法（1）准备土壤样品从自然环境中采集适量的土壤样品，并将其放入离心管中。
（2）制备琼脂培养基按照琼脂培养基的配方，将琼脂粉溶解在适量的水中，并加热煮沸，待冷却后倒入培养皿中。
（3）分离培养细菌将土壤样品加入到离心管中，并加入适量的生理盐水，用灭菌棉签搅拌均匀。
然后，取少量土壤样品溶液，用灭菌棉签在琼脂培养基表面均匀涂抹。
将培养皿倒置放置在恒温培养箱中，培养温度为30℃。
（4）观察细菌生长情况在培养箱中培养一段时间后，观察培养皿上是否有菌落形成。
如果有菌落形成，将其分离至新的琼脂培养基上进行纯化培养。
（5）观察细菌形态特征将纯化培养的细菌涂抹在玻片上，用显微镜进行观察。
观察细菌的形态特征，如形状、大小、颜色等。
（6）代谢能力测试通过对细菌进行生理和生化试验，了解其代谢能力。
如对氧气需求的试验、产气能力的试验等。
四、实验结果与讨论经过一段时间的培养后，我们成功地从土壤样品中分离出了多个菌落。
观察这些菌落的形态特征，我们发现它们形状各异，有的呈圆形，有的呈长条状，还有的呈不规则形状。
颜色方面，有的呈白色，有的呈黄色，还有的呈深褐色。
通过进一步的生理和生化试验，我们发现这些细菌具有不同的代谢能力。
例如，通过对氧气需求的试验，我们发现有些细菌是厌氧菌，只能在无氧条件下生长，而有些细菌是好氧菌，需要氧气才能生长。
此外，我们还进行了产气能力的试验，发现有些细菌能够产生气泡，而有些细菌则不能。
实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。
从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。
分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。
细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。
目的要求1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。
2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。
3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。
4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。
操作步骤一．需氧性细菌分离培养法1. 平板划线分离法菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。
但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。
划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。
划线法示意图见图4-3。
（1）连续划线法以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。
将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余菌体。
将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却，然后从接种细菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30～40度角，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠。
划线完毕，关上皿盖。
灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。
培 养皿倒置于适宜的恒温箱内培养。
培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。
(2)分区划线法（四分区划线法） 取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。
分区划线法划线分离时平图4-1连续划线法 图4-2分区划线法图4-3 划线分离示意图板分4个区，故又称四分区划线法。
其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。
为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120度左右。
先将接种环蘸取少量菌在平板上1区划3-5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60～70度。
灼烧接种环，待在平板边缘上冷却后，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平行划线。
第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60～70度，同样依次在3、4区划线。
划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，倒置于37℃恒温箱中培养24h后，在划线区观察单菌落。
2. 倾注平皿分离法被检材料若含有两种或两种以上细菌时,可借助溶化的琼脂将细菌稀释，待琼脂冷凝后,分散的细菌就被固定在原地形成菌落.这样也能达到分得纯种的目的。
根据材料中存在菌数的多少，倾注平皿前可将被检材料不稀释或用生理盐水作适当稀释。
其具体方法如下：取三支预先准备的普通琼脂培养基试管，水浴加热融化，冷至约50℃，用火焰灭菌接种环钓取待分离物接种至第一管内，充分摇匀后，自第一管取一接种环内容物至第二管，以同样方法自第二管移种至第三管。
然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置于37℃温箱内培养24h。
结果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面，通常第一个平板内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。
3. 芽胞需氧菌分离培养法如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，置于80℃水浴箱中维持15～20分钟，或85℃加热10分钟，再进行培养。
材料中若有带芽孢的细菌仍可存活而生长繁殖，不耐热的细菌繁殖体则被杀灭。
4．利用化学药品的分离培养法（1）抑菌作用有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对另外一些细菌没有抑制作用，所以可利用这种特性进行细菌的分离，例如通常在培养基中加入结晶紫或青霉素等化学药品来抑制革兰氏阳性菌的生长，以分离得到革兰氏阴性菌。
（2）杀菌作用将病料如结核病料用15％硫酸溶液处理，其他杂菌均被杀死，而结核杆菌因具有抗酸性而存活。
（3）鉴别作用利用细菌对某种糖的分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴别某种细菌。
例如远藤氏培养基可以用来鉴别大肠杆菌与沙门氏杆菌。
5. 实验动物分离法被检病料中疑有某种病原菌存在，可将病料以无菌操作取出，放入灭菌乳钵或组织匀浆器内，加3～5倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射（肌肉、腹腔、皮下或静脉）入易感实验动物,待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。
例如，疑有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体，鸽死后，再取其脾脏以分离猪丹毒杆菌，可得到纯培养。
6. 琼脂斜面分离法取琼脂斜面3管，用接种环蘸取欲检病料少许（如为脏器，先将表面烧烙后，用灭菌解剖刀切开，以灭菌接种环由切口插入、转动、钓取组织），混合于第1管的凝集水中，再作斜面划线；然后抽出接种环，不经烧灼，继续在第2管、第3管斜面上作同样划线。
划毕，置37℃温箱中培养。
经此法分离培养后，第2管的菌落较第1管为少，第3管的菌落更少，如此较易得到单个菌落，达到纯培养之目的。
7. 琼脂平板涂布分离法被检病料如血液、腹水等，可用灭菌毛细吸管或吸管吸取1～2滴置于平板中央，用灭菌的L形玻棒作均匀涂布。
如估计细菌数很多，可直接用火焰灭菌的接种环钓菌，并做分区划线。
如为脏器病料，可先作成乳悬液再行涂布；或取其一小块，用镊子夹住，表面烧烙后，用灭菌刀切开，以其切面直接进行涂布，此法适用于含菌量较少的病料的分离。
8. 营养肉汤分离法当组织病料中含病原菌少，或有抗菌药残留时，用上述琼脂斜面或平板分离法可能无菌落长出，这时可以无菌操作剪取一小块病料直接投入肉汤，经37℃培养，在肉汤中长出细菌后，再用琼脂斜面或琼脂平板分离。
二、厌氧性细菌分离培养法细菌接种后，直接放在恒温箱内培养，可以使需氧菌与兼性厌氧菌生长繁殖；但对厌氧菌，则需将培养环境或培养基中的氧气除去，或将氧化型物质还原，降低其氧化还原电势，才能生长繁殖。
在有氧的环境下，培养基的氧化还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。
为使培养基降低电势，降低培养环境的氧分压是十分必要的。
现有的厌氧培养法很多，主要有生物学法、化学法和物理学法，可根据各实验室的具体情况而选用。
（一）生物学方法培养基中含有植物组织（马铃薯、燕麦、发芽谷物等）或动物组织（新鲜动物组织小片，或加热的肌肉、心脑等），因组织的呼吸作用，以及组织中可氧化物质的氧化而消耗氧气（肌肉、脑磷脂中不饱和脂肪酸的氧化，碎肉培养基的应用），造成厌氧环境，以利于厌氧性细菌的生长繁殖。
同时，组织中所含的还原性化合物（谷胱甘肽）也可使氧化-还原电势下降。
此外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一环境中，则环境中的氧被需氧菌消耗，造成厌氧环境，也有利于厌氧菌的生长繁殖。
1. 动物组织及其他物质加入法在液体培养基内加入肝脏、肾脏等动物脏器，因其中的半胱氨酸的一SH基极不稳定，为强还原剂，所以可利用此培养基进行厌氧培养，在培养之前将肝片肉汤加热，以驱出空气，冷却，然后接种培养。
2. 共栖培养法将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一个平皿内，利用需氧菌的生长繁殖将氧气消耗后，造成厌氧环境利于厌氧菌生长。
其具体方法是将培养皿的一半接种消耗氧气能力极强的需氧菌如灵杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌等。
另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37℃恒温箱中培养2～3d，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。
（二）化学方法利用还原能力强的化学物质，将环境或培养基内的氧气消耗，或还原氧化型物质，降低氧化-还原电势。
1. 焦性没食子酸法焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧而造成厌氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。
通常100cm3空间用焦性没食子酸1g及10％氢氧化钠或氢氧化钾10m1。
具体方法有下列几种：（1）平板培养法将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板，取一小团直径约2cm的脱脂棉，置于平皿盖的内面中央，其上滴加0.5ml 10％氢氧化钠溶液；在靠近脱脂棉的一侧放置0.5g焦性没食子酸，暂勿使两者接触。
立即将已接种的平板覆盖于平皿盖上，迅速用融化的石蜡密封平皿四周。
封毕，轻轻摇动平皿，使被氢氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子酸接触，然后置37℃恒温箱中培养24～48h后，取出观察。
（2）Buchner氏试管法（图4-4）取一大试管，在管底放焦性没食子酸0.5g及玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝。
将已接种的培养管放入大试管中，迅速加入2％NaOH溶液0.5ml，立即将试管口用橡皮塞塞紧，必要时周围用石蜡密封。
37℃培养24～48h后观察。
（3）瑞氏厌氧培养法（图4-5） 将已接种细菌的培养管的脱脂棉棉塞在火焰中灼烧灭菌后，塞入管中离培养基1～1.5cm 处，置适量焦性没食子酸于其上，加入10%NaOH 溶液2ml ，迅速用橡皮塞将管口塞紧，以胶泥或石蜡严密封闭置温箱中培养。
（4）史氏厌氧培养法 用图4-6所示的厌氧培养皿，在皿底一边置焦性没食子酸，另一边置NaOH 溶液，将已接种的平皿翻盖于皿上，并将接合处用胶泥或石蜡密封，然后摇动底部，使氢氧化钠与焦性没食子酸混合，置温箱中培养。
（5）平皿厌氧培养法 置一片中有小圆孔的金属板于两平皿之间，上面的平皿接种细菌，下面的平皿盛焦性没食子酸及氢氧化钠溶液，用胶泥封闭后置温箱中培养（图4-7）（6）玻罐或干燥器法 置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，将培养皿或试管置于隔板上，并在玻罐内置美兰指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶液于罐底，将焦性没食子酸用纸或纱布包好，用线系住，暂勿与氢氧化钠接触，等一切准备好后，将线放下，使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中，立即将盖盖好，密封，置温箱中培养。
2. 李伏夫（B.M.JIbBOB ）氏法 此法是利用连二亚硫酸钠（Sodium hyerosulphite ）和碳酸钠以吸收空气中的氧气,释放二氧化碳造成厌氧环境。
其反应式如下：Na 2S 2O 4+Na 2CO 3+O 2→Na 2SO 4+Na 2SO 3+CO 2取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内（如是液体培养基，则直立于罐内），最上端保留可容纳1～2个平皿的空间（视玻罐的体积而定），按玻罐的体积每1000cm 3空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各30g ，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。
