【精品】PPT课件 离子交换层析ion exchange chromatography

强碱性，聚苯乙烯树脂 弱碱性，二乙氨乙基纤维素
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一些常用的纤维素离子交换剂
离子交换剂 可电离基团 可电离基团结构
阳离子交换剂
CM-纤维素（弱酸性） 羧甲基
P-纤维素（中强酸性） 磷酸基
SE-纤维素（强酸性） 磺乙基
阴离子交换剂
=O
=O =O
-
CH2COO H
–O-P-OH OH
-O- CH2-CH2-S-OH
酸碱处理的次序决定了离子交换剂携带反离子的类型。在每 次用酸(或碱)处理后，均应先用水洗涤至近中性，再用碱(或酸) 处理。末了用水洗涤至中性，经缓冲液平衡后即可使用或装柱。
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再 生：使用过的离子交换剂，可采用一定的方法使 其恢复原来的性状，这一过程叫做再生。再生可以 通过上述的酸、碱反复处理完成 转 型：指离子交换剂由一种反离子转为另一种反离 子的过程。比如，欲使阳离子交换剂转成钠型时， 则需用NaOH处理；欲使其转成氢型时，则需用HCl 处理；欲使其带铵离子时，则需用NH4OH或NH4Cl 处理。
例如： RA + B+
RB + A+
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离子交换剂应满足的基本条件：
① 有高度的不溶性。即在各种溶剂中不发生溶解 ② 有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使交换离子 能在交换剂中进行自由扩散和交换； ③ 有较多的交换基团； ④ 有稳定的物理化学性质。在使用过程中，不因物 理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象。
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分离结束
低
高
盐
盐
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四、操作注意点
（一）离子交换剂的选择
原则： 根据被分离物质的性质选择—同一性质离子交换剂中选用对被分离物质各组分之

此类交换剂是在基质骨架上引入季胺[-N (CH3)3]、叔胺[N(CH3)2]、仲胺[-NHCH3]和伯胺[-NH2]基团后构成的。
依据胺基碱性的强弱,又可分为强碱性(含季胺基)、弱碱性 (含叔胺、仲胺基)及中强碱性(既含强碱性基团又含弱碱性基 团)三种阴离子交换剂。
它们与溶液中的离子进行交换时,反应式为:
依据电荷基团的强弱,可分为强酸型(带磺酸的基团,R－ SO3H)、中强酸型(含磷酸基团或亚磷酸基团,R－PO3H2)及 弱酸型(带羧基和酚基的树脂, R－COOH或R－苯环－OH) 三种。
这些交换剂在交换时,氢离子为外来的阳离子所取代,如下 式所示:
R－COOH＋Na+＝R－COONa＋＋H+
②阴离子交换剂
离子交换层析就是利用离子交换剂的荷电基团,吸附溶 液中相反电荷的离子或离子化合物,被吸附的物质随后为带 同类型电荷的其他离子所置换而被洗脱。由于各种离子或离 子化合物对交换剂的结合力不同,因而洗脱的速率有快有慢, 形成了层析层。
离子交换机理
❖ A+自溶液中扩散到树脂表面 ❖ A+从树脂表面进入树脂内部的
素（ DEAE-C ）
交换剂
— (CH 2 ) 2 N + H (C 2 H 5 ) 2
0.1~1.0
pH<8.6
氨基乙基纤维素 中等碱型阴离
（ AE-C ）
子交换剂
— (CH 2 ) 2 N + H 2
Ecteda 纤维素 （ ECTE-C ）
中等碱型阴离 子交换剂 — (CH 2 ) 2 N + (C 2 H 4 OH) 3
(2) 亲水性离子交换剂
与水亲和性较大,有纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖等。 ①纤维素离子交换剂

（二）交换剂装柱 （1）离子交换色谱柱的选用 （2）装柱
垂直装柱，严防气泡和断层。
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当所用的交换剂与待分离物质各组分之间亲和力差 不多而需要交换剂体积较大时，以增加柱长为宜， 使待分离组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增 加。柱的直径与高度比以1:20左右为宜。
如采用离子强度较大的洗脱液梯度洗脱时，以选用 粗而短的柱子为宜，因为当柱上洗脱液的离子强度 高到足以完全取代被吸附离子时，这些被置换的离 子则以同洗脱液等速率向下移动，如果柱细长，就 增加了脱附离子扩散的机会。
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2、平衡常数
离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律，且 离子交换剂与溶液中的离子或离子化合物所进行的离子交换反应 是可逆的。 阳离子交换剂RA，在溶液中解离出阳离子A+与溶液中的阳离子B+ 发生可逆交换反应：RA+B+ ⇋RB+A+
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，离子交换剂的 选择性可用平衡常数K表示：
1、离子交换剂应具备高度的不溶性，保证在各种溶剂 中不会发生溶解； 2、具备稳定的理化性质，不能因物理化学变化而发生 分解； 3、具有较大的表面积或疏松的孔状结构，确保交换离 子自由地发生扩散和交换。
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离子交换剂
1、疏水性离子交换剂
与水亲和力较小的人工合成树脂 （1）阳离子交换剂 阳离子交换树脂具有酸性基团，电荷基团带负电，反离子带正电， 可与溶液中的阳离子或带正电荷的化合物进行交换反应。 （2）阴离子交换剂 阴离子交换树脂是在基质骨架上引入伯胺[-NH2]、仲胺[-NHCH3]、 叔胺[-N(CH3)2]和季胺[-N+(CH3)3]基团后构成的。
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（三）样品上柱、洗脱和收集 （1）上柱 （2）洗脱 IEC中的洗脱是至关重要的一步，从交换剂上把被吸附 的物质洗脱下来，有两种方法：一种是增加离子强度， 置换出被吸附的离子；另一种是改变pH，使被吸附的 离子解离度降低，减弱其对交换剂的亲和力而被脱附。 （3）收集 用部分收集器分部收集，收集体积一般为柱体积的 1%~2%。

离子交换(IEC)的应用及特点
GFC — 主要用于产物的初步纯化和中后期脱盐 IEC — 是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要纯化 手段 IEC分离的特点：
（1）料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流速下操作； （2）应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提高分离的 选择性，所需柱长较短； （3）产品回收率高； （4）商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格也远低 于亲合吸附剂。
洗脱方式： 恒定洗脱法：洗脱液（流动相）的离子强度不变； 缺点：对于在吸附柱上分配系数相差较大的蛋白 质很难实现很好的分离。 线性梯度洗脱法或阶段梯度洗脱法： 除GFC以外的层析操作均采用此种方法。 在洗脱过程中，流动相的离子强度线性增大 或阶段梯度增大，因此溶质的分配系数连续降低， 移动速度逐渐增大，使恒定洗脱条件下难于脱附 的溶质得到洗脱。
三、HIC操作 上样及洗脱的一般规律： 在高盐浓度条件下，蛋白质与固定相疏水缔 合；浓度降低时，疏水作用减弱，逐步被洗脱下 来。一般用pH 6-8的盐水溶液[如（NH4）2SO4]。 盐的浓度影响蛋白质的疏水性，从而影响蛋白质 的保留值。 盐：Na2SO4，KH2PO4，NaHPO4，(NH4)2SO4，NH4OAc， KOAc，NaOAc，NaCl 盐析作用增强
是介于等度洗脱和线性洗脱中间 的洗脱手段 盐 浓 度
时 间
阶段梯度洗脱示意图
线性梯度洗脱和阶段梯度洗脱法的优缺点如下：
（1）线性梯度洗脱法： 优点：流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干 扰峰，操作范围广； 缺点：需要特殊的调配浓度梯度的设备。 （2）阶段梯度洗脱法： 优点：利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗 脱，不 需要特殊梯度设备，操作简单； 缺点：因为流动相浓度不连续变化，容易出现干扰峰。 此外，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象，因此 洗脱操作参数（如盐浓度，体积）的设计较困难。

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三、离子交换剂的选择原则
1、离子交换剂的选择
（1）如果被分离物质带正电荷，则选用阳离子交换剂；如果带负
电荷，应选用阴离子交换剂。
（2）强型离子交换剂适用的pH范围很广，用来分离一些在极端pH
中解离且较稳定的物质；弱型则适宜用来分离生物大分子，活性不
易丧失。
（3）在分离生物大分子物质时，由于亲水性基质对被分离物质的
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2、平衡常数
离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律，且 离子交换剂与溶液中的离子或离子化合物所进行的离子交换反应 是可逆的。 阳离子交换剂RA，在溶液中解离出阳离子A+与溶液中的阳离子B+ 发生可逆交换反应：RA+B+ ⇋RB+A+
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，离子交换剂的
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四、离子交换色谱的基本操作
图3 IEC装置示意图
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（一）交换剂的预处理、再生 （1）用水浸透使干树脂吸水溶胀，再用酸、碱 处理除去水中的不溶性杂质。 （2）再生是指将用过的离子交换剂恢复原状的 处理过程。
（二）交换剂装柱
（1）离子交换色谱柱的选用
（2）装柱
垂直装柱，严防气泡和断层。
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（三）样品上柱、洗脱和收集
（1）上柱
（2）洗脱
IEC中的洗脱是至关重要的一步，从交换剂上把被吸附
的物质洗脱下来，有两种方法：一种是增加离子强度，
置换出被吸附的离子；另一种是改变pH，使被吸附的
离子解离度降低，减弱其对交换剂的亲和力而被脱附。
（3）收集

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分配系数K值大,说明物质在层析中被 固定相吸附得比较牢固,随流动相迁移的速 度较慢,留在固定相中的时间较长,在洗脱液 中后出峰。若分配系数K值小，则该物质在 洗脱液中较早出峰。
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从一个混合物中分离和纯化一种生物 物质的纯度如何，取决于混合物中各组分K 值的差异程度。
混合物中各组分若 K值相差较大, 则能 较易地把混合物中的生物物质分离。反 之,K值相差较小,不易把混合物中的生物物 质分离。
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四.凝胶的结构与性能
1.葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex） 结构： 葡聚糖用交联剂1-氯代-2 ,3-环丙烷使葡聚糖
之间通过醚键(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交联
OH
聚合而成的三维空间网状结构。
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特点：
Sephadex 的三维空间网状结构的网孔大小取决于交 联度,交联度的大小可在合成Sephadex 时控制加入 交联剂的百分比决定.交联剂的百分比高,交联度大, 网状结构愈紧密,孔隙愈小,吸水后膨胀也愈小,机械 强度高,分离物质的分子量也小。反之,交联剂的百 分比低,分离物质的分子量大。G类Sephadex的型号 表示每克干凝胶吸水量x10,如G-50表示每克干凝胶 吸水量为5ml。
（最好有颜色以便于观察如Hb、印度黑墨水） 通过实际测量求出.Vi可由g·Wr求得（g为干 凝胶重,单位为克,Wr为凝胶的吸水量以ml/g 表示）。
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Ve - Vo Kd = ————
Vi （1）Kd = 0时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排阻 于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相 分布为0,而最先流出。 （2）当Kd = 1时,Ve = Vo + Vi,意味着该分子完全 不被排阻,可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部,它 能均等地分布在流动相和固定相里,在两相分配的 比值为1,而最后流出. （3）当0 <Kd <1, Ve = Vo + ViKd为处于两种极 端行为之间的分子。