nature单细胞组学新技术

单细胞测序-I单细胞测序（single cell sequencing）被《自然-方法》（nature method）杂志评为了2013年度生物技术。

2017年10月美国政府启动了以单细胞测序为基础的“人类细胞图谱计划”，这是可以与“人类基因组计划”相媲美的又一个伟大工程。

要了解单细胞测序，我们首先需要了解下何为测序？“单细胞测序技术”是基于“第二代测序技术”上世纪70年代末，Sanger发明了双脱氧链终止法也叫做Sanger测序法，Sanger测序法为基础的DNA测序技术我们把他称作“第一代测序技术”。

“人类基因组计划”就是基于“第一代测序技术”完成的，共花费了30亿美元和耗时15年的时间。

“第一代测序技术”成本高和低通量的问题，逐渐满足不了生命科学领域发展的需求。

经过不断的技术开发和改进，以Illumina公司为代表的“第二代测序技术”大大降低了测序的成本并且大幅度提高了测序通量，所以也被称作“高通量测序技术”。

过去10几年“第二代测序技术”得到了快速发展，甚至突破“摩尔定律”的发展规律，如今完成一个人类的全基因组价格只需要1000美元和几个工作日。

随着“第二代测序技术”的迅猛发展，使得对于每个细胞单独测序成为了可能。

正是“第一代测序技术”的技术革命完成了“人类基因组计划”，同样的“第二代测序技术”掀起的技术革命正在推动着“人类细胞图谱计划”的进行。

当我们了解了“单细胞测序”就是以“二代测序技术”为基础的测序技术，那么下一步就需要了解下什么是细胞？为什么我们要进行单细胞测序？人体的每个细胞都是独一无二的细胞是人体结构和功能的基本单位，每个人大约有40亿-60亿个独立的细胞。

如果把一个人体全部细胞比作地球上的所有人类的话，那么我们的细胞就像地球上每个独立的个人，正如地球上的每个人都是独一无二的，人体的每个细胞也是独一无二的。

人类生命最初只有一个受精卵细胞，从胚胎发育到个体成熟，人体内的细胞数量增加的同时，细胞与细胞间的差异也越来越大，即使来自同一个组织的细胞，最终有的分化成了神经元而有的细胞则变成了神经胶质细胞。

单细胞转录组学的技术及应用随着科技发展的不断推进，人们对于生物学领域的研究也越来越深入。

在这个领域中，单细胞转录组学技术是一个备受关注的革命性技术，可以为生物学研究提供更加深入细致的了解与理解。

一、单细胞转录组学技术的定义和意义单细胞转录组学技术（Single-cell transcriptomics）是一种能够对单个细胞进行分析的生物信息学技术，可以测定其转录组水平，因此也又被称为转录组测序技术。

这种技术能够对细胞的基因表达进行高通量、高灵敏的研究，其主要应用领域是生物医学、致病机制的解析以及个性化医疗的发展等领域。

单细胞转录组学技术的意义在于：在了解每一个细胞的基础上，可以更加感性地了解组织和系统方面的更多相关信息。

比如疾病的研究，单细胞转录组学就可以从一个个细胞的角度看到病变细胞和正常细胞之间的差异。

这可以为转化医学研究提供重要的基础数据。

二、单细胞转录组学技术的研究方法单细胞转录组学技术要求对细胞进行隔离或者微量处理后，通过高通量测序技术获取每个单独细胞的转录本信息，从而建立一个具有生物学意义的单细胞图谱。

这种方法主要有以下几种：1. 微流控技术微流控技术是目前应用比较广的单细胞分离技术，可以将单个细胞分离到微小单元中，进一步完成单细胞转录组学研究。

该技术在去年发表在Nature上的文章中，首次使用混合式多层微流控芯片，实现了超过6万个肺癌瘤细胞（filter cells）的测序，并对这些细胞进行了分类。

2. 磁性珠技术磁性珠技术利用通过连接到表面上的选择性抗体来挑选出感兴趣的单个细胞，这样可以保证筛选出的细胞单一性。

但是该技术在筛选过程中也会影响单细胞的RNA浓度。

因此在使用这种技术时，需要充分考虑上述问题。

3. 转移部分细胞原型尽管微流控和磁性珠技术在单细胞分离上表现出色，但分离效率相对不太高。

因此，一些新兴技术引人注目，例如SPOT，即区分细胞不同阶段的技术。

相比Sanger技术和Illumina高通量测序，该技术在处理细胞材料方面具有明显优势。

拟南芥基因组学的前沿研究Introduction拟南芥是植物学中的一种重要研究材料，因为其基因组规模较小，尤其是经过了多年的基因组重测序和注释，拟南芥成为了基因组学领域中最常用的模式植物。

自从1998年，拟南芥全基因组测序以来，其基因组学成为了植物学和生物学领域中的热门课题。

越来越多的研究人员开始关注拟南芥基因组学的前沿研究，探索它的更多可能性。

1.功能基因组学研究功能基因组学是指利用高通量功能基因检测技术来研究基因或蛋白质在细胞、组织或生理过程中的功能。

如近年来发展了的RNA- seq(测序)技术，可以帮助研究人员在物种整个基因组水平上检测直接参与生命过程的RNA。

研究人员正在利用拟南芥的RNA-seq技术解析植物基因组的功能，从而了解基因在植物生长、发育、变异和适应环境的作用。

近年来，更加高级的单细胞RNA-seq技术也在拟南芥领域得到了应用，如2017年发表在nature的一篇单细胞转录组研究，该研究分析了拟南芥干细胞和早期胚胎的个体细胞的基因转录组。

2.基因组修饰研究基因组修饰是指在特定的位置对染色体上的DNA进行特定的化学修饰，例如甲基化或乙酰化，从而对染色体结构、基因转录调控、功能表达以及性状发生变化。

拟南芥的基因组修饰数据库是基因组学中的重要资源。

该数据库是liu lab 为拟南芥社区建立的，该社区的目的是为了收集整理拟南芥基因组修饰数据、为广大拟南芥领域的研究者提供基因组数据资源。

目前正在进行的一项研究利用基因组高分辨率测序技术，研究拟南芥中基因组修饰的动态变化，以及该修饰与基因转录调控的关系。

3.转录组学研究转录组学研究是指通过对RNA分子的高通量检测，来研究基因的表达模式、从而研究某类特定物质的功能、代谢途径、生产策略等。

拟南芥由于其基因组较小和细胞类型简单性质，使其非常适合进行转录组学研究。

目前正在进行的拟南芥转录组学研究主要包括干旱逆境下的基因表达、生长周期的基因调控、花序发育的分子机制研究等。

单细胞技术梳理（四）回顾单细胞转录组技术梳理（⼀）单细胞转录组技术梳理（⼆）单细胞转录组技术梳理（三）Smart-seq2前⾯我们介绍了下Smart-seq技术。

Smart-seq2是经Smart-seq改进的⼀种测序⽅法，也⽬前最常⽤的单细胞转录组技术之⼀。

Smart-seq于2012年开发，⼀年后针对Smart-seq的改进版Smart-seq2《Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2》发表在《Nature Methods》上 。

与Smart-seq相⽐新的⽅法使⽤锁核酸（LNA）、更⾼浓度的MgCl2 以及三甲基⽢氨酸(N,N,N-trimethylglycine)，并且不再需要纯化步骤，⽐Smart-seq 产量更⾼。

可以更好的⽤于检测可变剪接，SNP突变，融合基因等遗传调控分析。

流程Smart-seq2库准备流程图技术⼤致流程：使⽤相对温和(低渗)的裂解缓冲液（在裂解液中加⼊MMLV逆转录酶、游离的dNTPs、oligo(dT)VN Primer、甜菜碱、MgCl2等），在不⼲扰或抑制RT反应的情况下裂解细胞，制成单细胞悬液加⼊反转录引物和末端转移酶。

Oligo(dT) primer 经过退⽕结合到mRNA的poly(A)，逆转录酶MMLV开始进⾏逆转录。

（模板转换反应依赖于当RT到达RNA的5'端时末端转移酶活性会额外添加到cDNA3'端2-5个⾮模板核苷酸）加⼊含LAN的TSO（模板转换引物），通过逆转录酶进⾏模板切换。

添加ISPCR单引物⽤于cDNA扩增，得到全长cDNA序列利⽤PCR扩增全长cDNA以获得后续步骤所需的⾜够的材料⽚段化，利⽤Tn5转座酶打断并标签化加接头，构建标准的Illumina测序⽂库，然后上机测序优势与局限优势：使⽤相对温和的裂解缓冲液，来尽量达到对后续反转步骤最⼩的影响使⽤甜菜碱（⼀些RNA会形成发卡或者环等⼆级结构使反转酶受到空间位阻可以通过甜菜碱或者海藻糖克服）提⾼酶的热稳定性，反转效率等。

要了解单细胞测序技术，这8篇经典综述⼀定要看哦！今天我们继续介绍单细胞测序技术，这是“技术篇——单细胞测序”系列⽂章的第6期了，前⾯5期我们分别从：（1）科研热度（⽤这个技术发表的⽂章中，每4篇中就有1篇10分+，还不赶快了解⼀下！）；（2-3）使⽤单细胞测序发表⾼分杂志的两个案例（⼀篇肿瘤领域的Science和⼀篇⼼⾎管领域的Circulation）；（4）单细胞测序技术的常见问题（关于这个⾼⼤上技术的问题，这篇⽂章早就总结好了！）；以及（5）如果我们经费预算不够，可以使⽤的两个数据库：⾃⼰做不起单细胞测序，别担⼼有数据库可以⽤啊！。

今天我们把中间遗漏的⼀期：单细胞测序的经典综述补上。

正好是假期，如果你不看球，可以静下⼼来看看⽂章。

废话不多说，我们直接上⽂献：1. Unravelling biology and shifting paradigms in cancer with single-cell sequencing.Nat RevCancer. 2017 Aug 24;17(9):557-569.这篇去年8⽉份发表在Nat Rev Cancer杂志上的综述主要从单细胞测序在肿瘤研究中的应⽤来展开，综述了单细胞测序的技术、在研究肿瘤异质性和基因组进化中的作⽤，并以肺癌为例说明了单细胞测序的应⽤场景：Single-cell sequencing for the decomposition of heterogeneous cellular populations and theanalysis of rare cells in lung cancerSingle-cell sequencing can be leveraged to study cancergenetics and biology at all stages ofdisease development.2. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease.Nat Rev Nephrol. 2018 May 22. doi: 10.1038/s41581-018-0021-7.今年5⽉22号发表在Nat Rev Nephrol杂志上的综述，主题是单细胞RNA测序在发育、⽣理和疾病研究中的应⽤，本⽂介绍了单细胞测序技术的流程、不同单细胞捕获⽅法、数据分析流程和软件，以及应⽤等等。

单细胞测序单细胞测序技术是指对单细胞基因组或转录组进行测序，以获得基因组、转录组或其他多组学信息，从而揭示细胞群体差异和细胞发育谱系关系。

传统的测序方法一般获得的信息来自于混合细胞样品，这样测序的方式往往丢失了细胞的异质性信息。

单细胞测序技术结合优化的NGS测序技术，在检测单个细胞之间的异质性、识别稀有细胞、绘制细胞图谱等方面具有极大优势。

可以帮助研究人员研究细胞功能，更好地理解细胞间分化、细胞谱系关系和疾病进化。

单细胞测序还有助于发现潜在的生物标志物和药物靶标，以及分析罕见的细胞类型。

2013年，“Nature Method”将单细胞测序技术列为年度技术。

早期的单细胞测序由于成本高，限制了它的广泛应用。

随着技术的不断发展，许多新的单细胞测序方法被开发出来，单细胞测序技术在各个领域的应用越来越广泛，推动了科学家在单细胞水平上分子机制的研究。

10x Genomics Chromium是目前单细胞测序技术的最优解决方案。

10x Genomics Chromium提供了一个可以大规模，在单细胞水平上，对细胞特征和基因表达进行表征的解决方案。

10x Genomics Chromium单细胞测序系统可以在短时间内将几万个细胞捕获到独立的，可追踪的单细胞文库中。

每一个文库都包含一个可识别的条形码，用于下游分析。

该系统可以同时处理8个样品，一次上机约20分钟，一天可以完成数轮上机测试。

细胞样品捕获不受样品大小影响，新鲜的，冷冻的或甲醇固定的样品均可进行测定。

因为10x Genomics单细胞测序技术能够快速、准确地处理大量的单细胞，为癌症、神经学和免疫学等应用领域提供了解决方案。

10x Genomics Chromium应用广泛：基因表达分析。

免疫分析。

CRISPR筛选。

拷贝数目变异测试。

染色质开放性测序（ATAC-Seq）。

细胞表面蛋白鉴定(CITE-Seq/REAP-Seq)。

百泰派克生物科技使用10x Genomics Chromium系统结合Illumina平台提供单细胞测序一站式解决方案。

单细胞测序10xgenomics单细胞转录组从研究⽅向看上，发育⽣物学、免疫、神经⽣物学、肿瘤是排名靠前的⽅向，这和我们平时遇到的⾼频研究⽅向基本吻合。

另外，作为⼀个新兴的领域，10X 单细胞转录组检测到细胞多，数据庞⼤，信息复杂，对数据分析带来诸多困难，因此算法类的⽂章（Computational method）也⾼达76篇。

从物种上看，⼩⿏和⼈牢牢占据主流。

毕竟⼈类医学研究还是⽣物领域的最⼤热门，⼩⿏也是头号模式动物。

其他“飞禽⾛兽”已经慢慢都有涉及，但⽐较少的是植物（这⾥只有两例拟南芥的⽂章）。

植物因为细胞壁的存在，制备单细胞悬液的难度更⼤，从⽽限制了⼤规模应⽤。

不过这些困难也已经慢慢在摸索中被克服。

从组织类型上看，研究内容⼏乎涵盖了动物体内⼤部分组织器官，尤其在脑、⾎液、实体瘤、肺等四类样本发⽂的数量都已经超过50篇。

所以，后续在⼈、⼩⿏领域没有任何实验设计，仅仅对此类已被⼤量研究的热门组织直接进⾏测序是发不了好⽂章的。

所以，对已被⼤量⽂献报道的热门组织开展研究，个性化的实验设计尤为重要。

当然，对于冷门的组织或者没有⽂献报道过的物种（例如⼤部分植物），只要成功测到数据，任何结果都是创新，则可以较少考虑复杂的实验设计问题。

在已发表的⽂献上看，截⾄2020年，10X单细胞转录组的⽂章依然很⼤⽐例发表在⾼分的主流期刊上。

但这样的新技术红利不会⼀直持续下去，所以对于关注新技术的⽼师，还是早关注，早启动，早发⽂章才能保证有好的产出。

图2 10x单细胞转录组⽂章涉及的领域⽅向（注意，分类上会有重复，⽐如研究⽅向涉及两个，所以细分之和会超过总数）10x 免疫组库（VDJ-seq）截⾄2020年5⽉，⼀共发⽂56篇。

这是仅次于10X RNA-seq的热点⽅向，因为很多关⼼免疫细胞的⽼师会进⾏10X RNA-seq的时候，配对进⾏scVDJ-seq。

但⽬前10X scVDJ-seq标准化试剂盒只针对⼈和⼩⿏，其他物种的⽤户如果想做只能⾃⼰去设计定制探针系统（显然难度⽐较⼤），这限制了其他动物利⽤该技术开展研究。

单细胞测序 ,你为何如此令人痴迷？最近几年 ,关于单细胞测序的报道日益增多。

事实上 ,单细胞测序是一个新兴的领域。

据了解 ,单细胞测序萌芽于2019年 ,2019年是单细胞基因组学突飞猛进的一年。

2019年谢晓亮教授哈佛大学课题组与北京大学BIOPIC李瑞强研究员小组合作 ,将创立的MALBAC技术应用于人类单个精子基因组的测序研究中。

2019年12月10日 ,解放军总医院诞生了一对特殊的双胞胎—国内首例应用单细胞扩增技术〔MALBAC〕同时进行PGD/PGS 阻断了遗传性耳聋的健康双胞胎。

单细胞测序分为单细胞转录组测序和单细胞基因组测序。

单细胞转录组测序分为：单细胞DGE、单细胞polyA测序、单细胞lncRNA测序。

单细胞基因组测序分为：单细胞外显子组测序和单细胞全基因组重测序。

单细胞开展的历史据了解 ,1990年 ,NormanIscove的课题组首次证实对单细胞进行转录组分析是可行的 ,他们用PCR技术实现了对cDNA分子的指数级扩增。

2019年7月 ,来自斯坦福大学的StephenQuake在Cell上发表了一篇文章?Genome-wideSingle-CellAnalysisofRecombinationActivityandDeNo voMutationRatesinHumanSperm? ,研究采用单细胞测序的方法 ,测定了来自一项研究的100个精子的重组率 ,发现了许多新的重组热点和与间接方法发现的相一致的比率。

同年 ,纽约冷泉港实验室的研究生TimourBaslan 正利用单细胞技术来研究癌细胞。

2019年1月?自然—方法学?〔NatureMethods〕上发表年度特别报道 ,将“单细胞测序〞〔Singledoutforsequencing〕的应用列为2019年度最重要的方法学进展。

2019基因组学前沿研讨会将单细胞组学单独列为一个单元 ,可见单细胞测序在当前基因组学前沿研究中的热度。