冰冻切片免疫荧光中组织固定方法研究

免疫荧光双染 Revised by Hanlin on 10 January 2021免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。

冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。

将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。

（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。

去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。

冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。

将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。

（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。

去除PBS 后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

用于多重免疫荧光染色的小鼠肺组织冰冻切片制备方法优化研究叶倩宸;徐丹;文富强;陈俊;汪涛【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2024(34)1【摘要】目的优化小鼠肺组织冰冻切片制作方法,提高肺组织冰冻切片质量,有利于提高免疫荧光染色的特异性,获得更准确可靠的实验结果。

方法使用C57BL/6小鼠,分别采用传统冷冻后固定法、冷冻前固定法、改良灌注冷冻前固定法3种方法制作冰冻切片,经免疫荧光染色后使用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察肺组织染色情况。

使用荧光显微镜对肺组织切片进行全片扫描,计算单位面积内完整气道数量。

结果传统冷冻后固定法制作的小鼠肺组织冰冻切片,肺泡结构破坏,气道壁断裂严重,存在非特异性染色;冷冻前固定法制作的小鼠肺组织切片,肺泡和气道结构相对完整,但肺泡塌陷,部分气道结构破坏;改良灌注冷冻前固定法制作的小鼠肺组织切片,肺泡和气道结构形态均完整、清晰,多重免疫荧光染色定位准确。

改良灌注冷冻前固定法制作的小鼠肺组织冰冻切片单位面积内完整气道(直径≥100μm)数量高于冷冻前固定法((0.66±0.15)/mm^(2) vs(0.33±0.14)/mm^(2),P<0.05),也显著高于传统冷冻后固定法((0.66±0.15)/mm^(2) vs(0.02±0.04)/mm^(2),P<0.01)。

结论使用改良灌注冷冻前固定法制作冰冻切片,利于保持小鼠肺组织形态完整,利于获得高质量的多重免疫荧光染色结果。

【总页数】7页(P96-102)【作者】叶倩宸;徐丹;文富强;陈俊;汪涛【作者单位】四川大学华西医院/华西临床医学院呼吸病学研究室;四川大学华西医院临床研究管理部;四川大学华西医院呼吸与危重症医学科【正文语种】中文【中图分类】R-33【相关文献】1.肾活检标本冰冻切片与石蜡切片免疫荧光染色结果的比较2.用于免疫荧光染色的大鼠视网膜冰冻切片的制作体会3.冰冻切片免疫荧光中组织固定方法研究4.肾活检标本冰冻切片与石蜡切片免疫荧光染色对比分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

固定组织*冻切片的有效方法据研究学者作切片之前将组织侵泡于蔗糖溶液和对载玻片进行防脱片处理可以极大地提升*冻切片的质量，下面是小编搜集的一篇相关论文范文，欢迎阅读借鉴。

*冻切片是将生物组织置于低温下迅速冻结达到一定硬度后进行切片的一种实验技术，与常规的石蜡切片相比，它不经脱水、透明、浸蜡等步骤，因此组织不会收缩，易保持原有生活形态，具有快速、简便、易*作等优点，常用于组织化学、免疫定位及原位杂交等研究[1,2].由此可知，*冻切片具有制作迅速，耗时短的优点，但是固定组织在制片过程中经常出现组织脱片，组织肿胀或过度收缩，*晶形成过多等问题。

这些问题将导致实验信息的丢失，使最终得出的结果不准确。

因此，本试验以福儿马林固定的猪肺为试验材料进行*冻切片，通过对载玻片进行防脱片处理，以及将材料浸泡于蔗糖溶液中降低*晶的产生等方法，探索固定组织*冻切片的有效方法，为临床病理学诊断提供试验依据。

1材料和方法1.1试验材料。

用中*福儿马林固定猪肺，由延边大学农学院动物医学系病理实验室提供。

1.2方法1.2.1载玻片的处理。

将新购未经处理的载玻片经1%盐*浸泡24h,流水冲洗，再经洗涤剂浸泡24h,流水冲洗，烘干，分别经蛋白甘油、多聚赖氨*、明胶硫*铬钾处理，1.2.2组织的处理。

将取好的组织，分为两组，第一组流水冲洗24h.第二组流水冲洗24h,再浸泡在20%蔗糖24h,30%蔗糖3天。

1.2.3切片(1)包埋：从*冻机中取出包埋托，用水冲洗略去掉表面*霜，用干纱布擦干，滴加0.3cm厚包埋剂，然后将取材的组织放在包埋剂上。

对于含水分较多的组织先用纱布吸干组织表面水分再进行包埋。

包埋后在组织周围进一步补充包埋剂，尽量将组织包在其中[4].(2)时间及温度：将包埋好的组织放入*冻机的冷冻台上冷冻。

根据不同组织将温度控制在-18℃~-30℃。

严格控制冷冻时间，以刚刚冻上即止为宜。

(3)切片及贴片：组织冻好后，进行切片、贴片。

冰冻切片免疫荧光组化
冰冻切片和免疫荧光组化技术是生命科学中广泛应用的技术。

以
下是两种技术的简介：
1. 冰冻切片技术：冰冻切片是把组织或细胞快速冻结并切成薄
片的技术。

不同于石蜡包埋技术，冰冻切片不需要前期的化学处理和
固定，具有样品保留完整活性、切片速度快、质量高等优点。

冰冻切
片广泛应用于免疫荧光组化、原位杂交、基因组学等技术中。

2. 免疫荧光组化技术：免疫荧光组化技术是一种利用特异性抗
体对目标分子进行标记和检测的技术。

该技术在机体免疫学、病毒学、肿瘤学和神经科学等领域广泛应用，可用于检测病毒、肿瘤标志物、
蛋白质表达、分子相互作用等。

通过将免疫球蛋白标记荧光染料或酶
标记物质后，通过显微镜或荧光显微镜观察样品上的染色，并进行分析。

该技术具有灵敏、特异、可视化等优点，已成为生命科学研究中
必不可少的技术之一。

免疫荧光双染集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。

冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。

将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。

（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。

去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

免疫荧光染色实验步骤1.标本固定：将所需分析的细胞、组织或细胞培养物固定在载玻片上，常用的固定方法有：乙醛、甲醛、乙酸醋酸洗等。

固定时间视具体对象而定，一般为10-30分钟。

2.细胞透膜处理：对于细胞，需进行细胞透膜处理，常用方法有：冷冻切片、石蜡包埋切片、异丙醇造液切片等。

其中，冷冻切片方法操作简单，适用于原代组织、生物样品等。

3.抗原解膜：将标本解膜以增强抗原表面表达，使其易于与抗体结合。

常用方法有：酸性解膜（如：使用0.01M蛋白酶K）、热解膜（如：使用高温蒸气）等。

解膜时间和条件因抗原种类、标本类型而异。

4.阻断非特异性蛋白质结合：使用蛋白质阻断剂（如：牛血清白蛋白、小鼠胶原蛋白等）对标本进行阻断，以防止非特异性蛋白质与抗体结合。

阻断剂的浓度和时间视实验要求而定，一般为30分钟。

5.抗体结合：将与目标抗原相关的特异性一抗加入到试管中，与待检样本中的抗原结合。

一抗的浓度和孵育时间需进行优化，一般为1-2小时。

6.清洗：使用缓冲液对载玻片或试管中的非结合抗体进行清洗，以去除非特异性、非结合的一抗。

常用的缓冲液有：PBS、TBS等。

7.二抗结合：加入特异性的荧光标记的二抗（如：荧光染料标记的抗小鼠IgG）与一抗结合。

二抗的浓度和孵育时间需进行优化，通常与一抗相同。

8.清洗：重复第6步骤，去除非结合的二抗。

9.盖玻片：将载玻片或切片用透明胶带盖住，以防止样本干燥。

10.显微镜观察：用荧光显微镜观察载玻片，记录目标抗原的荧光信号分布。

除了以上的步骤，还有一些增强免疫信号的步骤可选用，如增强素方法，例如亲和素-酶联生物素-生物素-(酶)染色。

总结：免疫荧光染色实验步骤齐全且繁多，每一步骤的条件、孵育时间和浓度等都需进行优化和调整。

实验者应根据实验目的、所用抗体和标本的特性，进行合理的实验设计和优化操作，确保得到准确可靠的实验结果。

免疫荧光通用操作规程冰冻切片的免疫荧光1, 动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4C过夜后，OCT 包埋。

-20C保存3月，-80C长期保存。

请勿保存于液氮。

2, 冰冻切片机切片至少10um,空气干燥2分钟后，-20C储存3，切片从-20 取出后，在通风橱放10-30 分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20 C 丙酮固定15分钟置通风橱2小时4, 1XPBS 清洗玻片, 3X5min 从此请保持玻片湿润5, 有时,抗原修复3 小时会得到更好的结果。

为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压•微波修复•高压修复•隔水加热•电炉加热）… 关注修复的温度 ,时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间）,抗原修复液必须遵循自然降温规律, 使用足量的抗原修复液… 选择不同PH 值的修复液（A 液枸盐酸缓冲液PH6.0, B 液EDTA-Na缓冲液PH8.0, C液枸盐酸缓冲液PH4.5）6, 室温封闭1 小时封闭液：5%BSA+1 0%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in IxPBS （细胞因子,无需封闭的蛋白7, 一抗4C过夜请用封闭液稀释一抗8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （dyelight ）in 封闭液，避光室温1 小时10, Wash,1XPBS, 3x5min11, DAPI 染核5min，12，DDW Rinse13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14,干片后4C保存石蜡切片的免疫荧光1 ，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤），制成石蜡包块2,组织学染色切片厚度2um,免疫荧光染色切片厚度至少6um,切片复水：58 °C 20mi n-xylene 2x10min-100%EtoH2x10min95%EtoH2x10min-70%EtoH10min-, DDW5min4, Rinse 玻片1xPBS, 从此请保持玻片湿润5，抗原修复过夜。

冰冻切片免疫荧光
1.处死实验动物，打开脑壳，避免损伤脑组织，
2.把把脑组织小心取出，放置于平皿中，取出目标部位；
3.用室温下的PBS或生理盐水漂洗目标部位1-3遍，把血液漂洗干净（血液导
致背景较高）；
4.小心把目标部位转移至滤纸上，小心把组织表面的溶液用滤纸吸干；
5.再把目标部位转移干燥平皿中，在-20℃或-80℃冻结（绝对避免用液氮冻结）
后，再把目标部位转移至管子中（绝对避免挤压组织，应使用硬性管子），做好相应标记，存储于-20℃或-80℃（绝对避免复融，如需进行其他实验，组织应在冻结前分切好）；
6.利用Leica CM 1850 UV切片机进行冰冻切片；
7.冰冻切片丙酮固定10分钟。

8.PBS洗2次，每次5分钟。

9.10%正常山羊血清封闭30分钟。

10.一抗（通过预实验筛选抗体的最优浓度，利用免疫一抗稀释液稀释抗体）4℃
孵育过夜。

11.PBS洗3次，每次5分钟。

12.荧光标记二抗（通过预实验筛选的抗体最优浓度，利用免疫二抗稀释液稀释
抗体）室温湿盒避光孵育1小时。

13.PBS洗3次，每次5分钟，避光操作。

14.DAPI室温湿盒避光孵育5分钟。

15.PBS洗一次，5分钟，避光操作。

16.抗荧光淬灭剂封片。

17.镜检，拍照。

18．备注：如果进行双标，相应一抗应来源于不同的种属（例如一个是属抗，另一个是兔抗）；如果背景较高，应使用背景荧光淬灭剂处理；通过预实验确定一抗、二抗的最优浓度，以及是否需要使用背景荧光淬灭剂处理；。