分子生物学-10-5-第五章核酸杂交-分子杂交-SNP-芯片
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核酸分子杂交法这是最早用于性病诊断的重组DNA技术。
基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原则形成双链,此杂交过程是高度特异的。
杂交的双方是待测核酸及探针。
待测核酸序列为性病病原体基因组或质粒DNA。
探针以放射核素或非放射性核素标记,以利于杂交信号的检测。
所谓杂交(hydridization)指两个以上的分子因具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体(hybrid),杂交体中的分子不是来自一个二聚体分子。
同一个二聚体中的两个分子在变性解离后重组合称为复性。
利用两条不同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链叫核酸杂交。
与核酸杂交技术相对应的另一项技术被称为探针技术,它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术,我们把标记的分子叫探针(Probe)。
将探针技术与分子杂交技术相结合,从而使分子杂交技术得以广泛推广应用。
目前所用的核酸杂交技术均应用了标记技术。
(一)DNA的变性DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,形成无规则线团,称为DNA变性。
加热、改变DNA溶液中的pH,或有机溶剂等理化因素的影响,均可使DNA变性。
变性的DNA粘度下降,沉降速度增加,浮力上升,紫外吸收增加。
(二)DNA复性变性DNA只要消除变性条件,二条互补链还可以重新结合,恢复原来的双螺旋结构,这一过程称为复性。
复性后的DNA,理化性质都能得到恢复。
核酸分子单链之间有互补的碱基顺序,通过碱基对之间非共价健的形成即出现稳定的双链区,这是核酸分子杂交的基础。
杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补,所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序就可以形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间,由于DNA一般都以双链形式存在,因此在进行分子杂交时,应先将双链DNA分子解聚成为单链,这一过程称为变性,一般通过加热或提高pH值来实现。
分子生物学第五章分子生物学研究法(上)——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段,有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体:质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选,挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板,加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗:第一抗体,识别目标蛋白二抗:抗体的抗体,能增强信号,增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性,发生频率1%或更高例如:某些人的染色体上的某个位置为A,而另外一些人的同样位置是T,染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记:在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记:RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
分子生物学第五章作业1、哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生及发展?答:近半个世纪来,分子生物学主要取得了三大成就:第一,20世纪40年代确定了遗传信息的携带者,即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题;第二,50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题;第三,50年代末至60年代,相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码,充分认识了遗传信息的流动和表达。
但事实上,DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。
其中,限制性内切核酸酶和DNA连接酶等工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。
DNA重组技术的产生及发展过程中比较重要的科学发现和实验如下:1957年A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。
1965年S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定;科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。
1967年年世界上有五个实验室几乎同时宣布发现了DNA连接酶。
1970 年H.O.Smith,K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。
H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。
1972-1973 年H.Boyer,P.Berg等人发展了DNA重组技术,于72年获得第一个重组DNA分子,73年完成第一例细菌基因克隆。
1978 年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。
1981 年R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠;A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。
1982 年美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素;Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。
广州医科大学本科课程学习大纲课程名:分子生物学课程学时: 36学分: 2.0开课单位:生物化学教研室广州医科大学教务处编印二〇一六年九月一、课程简介分子生物学是从分子水平来研究生命现象的科学,其核心内容是通过生物的物质基础—一核酸、蛋白质、酶等生物大分子的结构,功能及其相互作用等运动规律的研究来阐明生命现象的分子基础,从而探索生命的奥秘。
其基本理论和技术是生命科学、医学实践及研究的共同语言与工具。
通过本课程学习,旨在是学生掌握分子生物学基本理论与常用实验技术方法,为后续课程的学习及今后的工作实践和科学研究奠定基础。
本课程需要有机化学、细胞生物学、生物化学、遗传学等作为先修课程。
本课程共36学时,其中理论30学时,实验6学时。
本课程适用临床医学、中西医临床医学、生物技术专业、检验技术、医学影像学、麻醉学、预防医学、药学、食品质量与安全等专业。
本大纲是以国家级规划教材《生物化学与分子生物学》第八版中第4篇为基础,并配以我校生化教研室自编的补充教材作为编写的蓝本。
Molecular biology is one science study the life phenomena at molecular level, its core content is by the study of the biological material basis, namely the structure, function and interaction with each other of nucleic acids, proteins and other biological macromolecules, to clarify the molecular basis of biological phenomena, in order to explore the mysteries of life. Molecular biology basic theory and technology are the common language and tools to life sciences, medical practice and related research. This course describes in the form of topics about the basic theories and methods of some common technology of molecular biology. This course is designed to enable students to master the molecular biology basic theory and commonly used experimental techniques, to lay the foundation for future learning of medical curriculum, scientific research and clinical practice . This course requires organic chemistry, cell biology, biochemistry, genetics, etc as prerequisite courses.This course contains a total of 36 classes, including 30 classes of theory (containing self-study 3 classes), 6 classes of laboratory. This course is suitable for undergraduate medical examination technology.二、学时分配三、预期学习结果(一)知识第一章核酸杂交、基因芯片【掌握】1. 核酸变性、复性和核酸杂交的基本概念;掌握Tm值、核酸探针定义;掌握缺口平移和随机引物法原理和过程。
郜刚分子生物学教案
教学单元教案格式
第5章研究方法-5-核酸杂交-分子杂交-SNP-芯片课程教案
多克隆位点
β半乳糖苷酶
N 段编码序列启动子裂开的N 端
外源DNA 裂开的N 端
转化细菌在含有X-gal 和Lac 操纵子诱导剂的培养基上培养
β半乳糖苷酶C 段编码序列
含有重组体pUC18的白色菌落
含有载体pUC18的
白色菌落
染色体
染色体pUC18pUC18
pUC18pUC18E,coli E,coli
转化
挑白稀释
PCR
电泳印迹一下
蛋白转移核酸转移操作简便,不需要特殊转移仪器,但转移效率低,(扩散法为70%,毛细管法80%)耗时多
(Capillary blotting method )
(electro blotting )
(Vaccum bllotting )
转移速度与凝胶的速度和厚度成反比,在相同转移率(50%)时,真空法比毛细管法快6%,而毛细管法损失率20%。
找到特异的目的片段
标本用限制性内切酶消化后,经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片
Tris缓冲液中和,高盐下通过毛吸作用将
至硝酸纤维素滤膜上,烘干固定,凝胶中
片段转移到滤膜的过程中继续保持着。
5.4.1 定义
单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
不同个体间,基因组DNA某部位的单核苷酸的变异。
•1996年,Lander报道了用单核苷酸多态性
•标记(single nucleotid polymorphism SNP)
•制备第三代遗传连锁图的遗传标记。
5.4.2 SNP 的特征
•是单个核苷酸变化引起的
•在基因组中分布广泛
•分布位置随机
基因编码区SNP,cSNP
基因调控区SNP,pSNP
随机非编码区SNP,rSNP
•多个相关联的SNP组成一个单倍
型
5.4.3 SNP检测方法
1、基因芯片技术(本质上是利用严格的核酸杂交来排除具有SNP的序列,后者不能杂交):
2、Taqman技术(本质同上);
3、分子信标技术(本质同上);
4、焦磷酸测序法(以后再讲)
但不管哪一种方法,首先必须进行靶序列的扩增,然后才能进行其它检测。
补充资料
生物芯片
生物芯片是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术,主要是指利用机器人进行操作,通过缩微技术、微加工技术、光引导化学合成技术和微电子技术等,自动在硅片、玻璃片、凝胶或尼龙膜等物质制造的固体芯片表面上,将成千上万的具有生物活性的大分子(DNA等)制作成微阵列。
生物芯片的一般类型
1. 按照芯片基质上固定的生物材料的不同,可以将生物芯片划分为DNA或基因芯片、蛋白质芯片、RNA芯片、细胞芯片、组织芯片、芯片实验室(Lab on chip)。
如果芯片上固定的是肽或蛋白,则称为肽芯片或蛋白芯片;
如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或DNA,就是DNA芯片。
“芯片实验室”通过微细加工工艺制作的微滤器、微反应器、微泵、微阀门、微电极等以实现对生物样品从制备、生化反应到检测和分析的全过程,从而极大地缩短的检测和分析时。