分子生物学第五章分子生物学研究法(上)

第五章分子生物学的研究方法（上）西南大学生命科学学院09级XX(仅代表个人观点)1，哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生和发展？答：1，确定遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质；2，DNA的双螺旋结构模型和半保留复制机制的提出；3，中心法则，操纵子学说的提出和密码子的破译；4，重组工具酶的发现；5，运载体重组质粒的发现。

2，如何理解PCR扩增的原理和过程。

答：原理：DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

过程：1，变性，将DNA在临近沸点的温度下加热使变性，双链打开；2，退火，引物与模版的相结合；3，链的延伸，DNA合成。

3，简述定量PCR的原理和过程。

答：实时定量PCR反应在带透明盖的塑料小管中进行，激发光可以直接头孤傲管盖，使其中的荧光探针被激发。

一逛探针事先混合在PCR反应液中，只有与DNA 结合之后，才能被激发发出荧光。

随着新和成DNA片段的增加，结合到DNA上的荧光探针，即被激发产生的荧光增加。

4，基因组DNA文库和cDNA文库在构建原理和用途上的主要区别是什么？答：基因组DNA是把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合，导入微生物细胞形成克隆。

应用：主要用于基因组作图、测序和克隆序列的对比。

cDNA文库是以mRNA为模版反转录而成的序列，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增。

应用：筛选目的基因、大规模测序、金银芯片杂交等功能基因组学的研究。

5，基因克隆的方法主要有哪几种？简述各种方法的作用和用途。

答：1，RACE技术，用于在已知cDNA序列的基础上克隆5’端和3’端缺失的序列；2，应用cDNA差示分析法克隆基因，在没有任何探针的情况下，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDAN两端接头的方法特异性的扩增目的基因片段。

分子生物学课程教学大纲课程名称：分子生物学（Molecular Biology）课程编号：1313072215课程类别：专业课总学时数：68 课内实验时数：18学分：3.5开课单位：生命科学学院生物技术教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子生物学为高等学校生物技术专业学生必修的一门专业基础课，是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，主要研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。

通过分子生物学的教学，应使学生了解分子生物学的发展历史以及最新研究成果；熟练掌握DNA的结构与功能、RNA在蛋白质合成中的功能、蛋白质的结构与功能、遗传密码及基因表达调控的本质；了解现代分子生物学基本研究方法，并能运用分子生物学的理论知识分析、研究和解决问题，为进一步学习有关专业课程及从事基因工程领域的研究工作奠定基础。

二、本课程与其它课程的联系与分工从学科角度来讲，分子生物学涵盖面非常广，与生物学、生物化学和细胞生物学、遗传学等生命科学课程有交叉，《生物化学》是先修课程。

三、教学内容及教学基本要求[1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”；△表示自学内容；○表示略讲内容；第一章绪论第一节引言创世说与进化论[1]；细胞学说[2]；经典的生物化学和遗传学[3]；DNA的发现[2]第二节分子生物学简史[1]第三节分子生物学研究的主要内容分子生物学的含义[3]；DNA重组技术、基因工程技术概念[3]；分子生物学研究的主要内容[3]第四节展望分子生物学的一些分支学科[1]；分子生物学发展的趋势[1]重点：分子生物学的含义和研究内容难点：分子生物学的研究内容教学手段：多媒体教学教学方法：讲授法作业：1．简述阵德尔、摩尔根和沃森等人对分子生物学发展的主要贡献。

分子生物学考点整理符广勇朱兰第一章．绪论一、分子生物学概念分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子结构与功能相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘、由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。

二、重组DNA技术又称基因技术，是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。

三、基因表达的调控基因表达的调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑三个方面。

四、转录因子转录因子是能与基因5`端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。

第二章．染色体与DNA一、染色体上的蛋白质染色体上的蛋白质主要包括组蛋白和非组蛋白。

根据凝胶电泳性质可以把组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3、H4。

这些组蛋白都含有大量的赖氨酸和精氨酸。

二、组蛋白的特性1．进化上的极端保守性不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是H3、H4。

2.无组织特异性到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白这两个例外。

3．肽链上氨基酸分布的不对称性碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。

4.组蛋白的修饰作用包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化。

5.富含赖氨酸的组蛋白H5三、HMG蛋白叫高迁移率蛋白四、真核细胞DNA序列的分类1.不重复序列2.中度重复序列3.高度重复序列重复序列的意义：若某一重复序列出现错误，对基因的影响不大，稳定性较高；在短时间内可同时产生大量的基因产物。

重复序列的应用:应用于分子标记的作用：卫星DNA（便于分子标记）和微卫星DNA五、真核生物基因组与原核生物基因组的区别1.真核基因组庞大，原核生物基因组小2.真核基因组存在大量的重复序列，原核基因组没有重复序列3.真核基因组大部分是非编码序列，原核基因组大多是编码序列4.真核基因组的转录产物为单顺反子，原核基因组转录产物多为多顺反子5.真核基因是断裂基因，有内含子结构，原核基因为连续基因，几乎没有内含子结构6.真核基因组存在大量的顺式作用原元件，包括启动子、增强子和沉默子等，原核基因组基本没有增强子和沉默子7.真核基因组存在大量的DNA多态性，原核基因组很少有8.真核基因组具有端粒结构，原核基因组没有端粒结构六、重叠基因（Overlapping gene）指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上的基因的组成部分。

第五章分子生物学研究法（上）------DNA RNA及蛋白质操作技术1. 简述PCR技术。

课本P165.2 .简述核酸的凝胶电泳。

答：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。

某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。

在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。

将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极 -正极移动。

在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide 染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。

3. 什么是south 杂交？指将经过电泳分离的DNA片断转移到一定的固相支持物的过程第七章基因的表达与调控（上）---- 原核基因表达调控模式1.简述代谢物对基因表达调控的两种方式。

① 转录水平上的调控(transcriptional regulation) ；② 转录水平上的调控(post-transcriptional regulation) ，包括mRNA 加工成熟水平上的调控(differen,tial processing of RNA transcript和翻译水平上的调控(differential translation of mRNA)。

3.简述乳糖操纵子的调控模型。

A、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列0, —个启动子P和一个调节基因I。

B、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态,不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时,乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构,不能结合于操纵序列,乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。

分子生物学研究方法教案一、教学目标1、让学生了解分子生物学的基本概念和研究范畴。

2、使学生掌握常见的分子生物学研究方法，包括其原理、操作步骤和应用领域。

3、培养学生的实验设计能力和科学思维，能够运用所学方法解决实际问题。

二、教学重难点1、重点（1）PCR 技术的原理和应用。

（2）核酸电泳技术的原理和操作。

（3）基因克隆的基本流程。

2、难点（1）PCR 反应体系的优化和常见问题的解决。

（2）基因克隆中载体的选择和构建。

三、教学方法1、讲授法：讲解分子生物学研究方法的基本原理和关键步骤。

2、演示法：通过多媒体展示实验过程和结果，增强学生的直观感受。

3、讨论法：组织学生讨论实验设计和结果分析，培养学生的思维能力。

四、教学过程1、课程导入（1）通过介绍一些与分子生物学相关的疾病诊断、基因治疗等实际应用案例，引起学生的兴趣，引出分子生物学研究方法的重要性。

2、分子生物学研究方法概述（1）简单介绍分子生物学的定义和研究对象，如 DNA、RNA、蛋白质等生物大分子。

（2）列举常见的分子生物学研究方法，如 PCR、核酸电泳、基因克隆、DNA 测序等。

3、 PCR 技术（1）原理：讲解 PCR 技术的基本原理，即通过高温变性、低温退火和适温延伸的循环过程，实现 DNA 片段的指数扩增。

（2）反应体系：介绍 PCR 反应体系的组成成分，包括模板 DNA、引物、dNTPs、Taq DNA 聚合酶和缓冲液等，并说明各成分的作用。

（3）操作步骤：详细讲解 PCR 的操作步骤，包括模板 DNA 的制备、引物设计、反应体系的配制、PCR 扩增程序的设置等。

（4）应用：举例说明 PCR 技术在基因诊断、遗传分析、物种鉴定等方面的应用。

4、核酸电泳技术（1）原理：解释核酸电泳的原理，即根据核酸分子在电场中的迁移速率不同来分离和鉴定核酸片段。

（2）琼脂糖凝胶电泳：介绍琼脂糖凝胶电泳的操作方法，包括凝胶的制备、样品的加载、电泳条件的设置等。

第一章绪论1分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的结构与功能,并从分子水平上阐明蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸之间的互作及其基因表达调控机理的学科。

2医学分子生物学是分子生物学的一个重要分支,是从分子水平上研究人体和疾病相关生物在正常和疾病状态下的生命活动及其规律, 从分子水平上开展人类疾病的预防、诊断和治疗研究的一门科学。

3顺反子是编码一条多肽链的单位。

有关基因就是一个顺反子4 C值(C value :单倍体基因组中 DNA 的含量。

第二章染色体与 DNA1基因:基因是产生一条多肽链或功能 RNA 所必须的全部核苷酸序列 , 是决定遗传性状的功能单位。

2基因组:细胞或生物体的一套完整单倍体的遗传物质的总和。

3C 值矛盾也称 C 值悖论,指生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象。

4DNA 的一级结构是指 4种脱氧核苷酸的连接(磷酸二酯键及其排列顺序, DNA 序列是这一概念的简称。

5DNA 的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构。

6DNA 的高级结构是指 DNA 双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。

是一种比双螺旋更高层次的空间构象。

7DNA 的半保留复制是由亲代 DNA 生成子代 DNA 时, 每个新形成的子代DNA 中, 一条链来自亲代 DNA ,而另一条链则是新合成的,这种复制方式称半保留复制。

8复制子是 DNA 复制时在复制的局部将链解开,形成复制单位,称为复制子。

9 复制叉是复制时 DNA 双链解开分成二股单链‚新链沿着张开的二股单链生成,复制中形成的这种 Y 字形的结构称为复制叉10 DNA 的半不连续复制是 DNA 复制时其中一条子链的合成是连续的,而另一条子链的合成是不连续的,故称半不连续复制。

11前导链是在 DNA 复制时,合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链; 合成方向与复制叉移动的方向相反,形成许多不连续的片段,最后再连成一条完整的 DNA 链为滞后链。

分子生物学的研究方法例题和知识点总结分子生物学作为一门研究生物大分子结构与功能的学科，对于理解生命现象的本质具有至关重要的意义。

其研究方法多种多样，涵盖了从分子水平到细胞水平，再到整体生物个体水平的多个层次。

下面我们将通过一些具体的例题来深入探讨分子生物学的研究方法，并对相关知识点进行总结。

一、分子克隆技术分子克隆技术是分子生物学研究中最常用的方法之一，它能够实现特定 DNA 片段的复制和扩增。

例题：假设我们需要从一个复杂的基因组中克隆出编码某种特定蛋白质的基因。

首先，我们通过设计特异性引物，利用 PCR（聚合酶链式反应）技术扩增出目标基因片段。

然后，将这个片段插入到合适的载体（如质粒）中，转化到宿主细胞（如大肠杆菌）中进行扩增和表达。

知识点：1、 PCR 技术的原理：基于 DNA 半保留复制的原理，通过高温变性、低温退火和适温延伸的循环过程，实现 DNA 片段的指数级扩增。

2、载体的选择：常见的载体有质粒、噬菌体和病毒等，需要根据实验目的和宿主细胞的特性来选择。

3、转化方法：包括化学转化法、电穿孔法等，目的是将重组载体导入宿主细胞。

二、核酸杂交技术核酸杂交技术是基于核酸分子的碱基互补配对原则，用于检测特定核酸序列的存在。

例题：为了检测某一细胞样本中是否存在特定的 mRNA 分子，我们可以设计与之互补的 DNA 探针，进行 Northern 杂交实验。

知识点：1、 Southern 杂交：用于检测 DNA 分子。

2、 Northern 杂交：用于检测 RNA 分子。

3、探针的标记：可以采用放射性同位素标记或非放射性标记（如荧光标记、生物素标记等）。

4、杂交条件的优化：包括温度、离子强度等，以保证特异性杂交的发生。

三、基因测序技术基因测序技术能够确定 DNA 或 RNA 分子的核苷酸序列。

例题：对一个未知基因进行测序，以确定其碱基组成和排列顺序。

知识点：1、 Sanger 测序法：通过双脱氧核苷酸终止法进行测序。

第一章分子生物学定义：分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。

分子生物学简史：○11962年，Watson（美）和Crick（英）因为在1953年提出DNA的反向平行双螺旋模型与Wilkins共享诺贝尔生理医学奖，后者通过对DNA分子的X线衍射证实了DNA模型。

○21965年，Jacob（法）和Monod（法）提出并验证了操纵子作为调节细菌细胞代谢的分子机制而与Iwoff共享诺贝尔生理医学奖。

○31968年，Nirenberg（美）由于在破译DNA遗传密码方面的贡献，与Holly和Khorana 共享了诺贝尔生理医学奖。

○41980年，Sanger因设计出一种测定DNA分子内核苷酸序列的方法，而与Gilbert 和Berg分享诺贝尔化学奖。

○51989年，Altman（美）和Cech（美）由于发现某些RNA具有酶的功能（称为核酸）而共享诺贝尔化学奖。

○61997年，Prusiner（美）由于发现阮病毒是阿尔茨海默病毒（老年痴呆症）等疾病的病原并能直接在宿主细胞中繁殖传播而获得诺贝尔生理医学奖。

作业：你认为二十一世纪初分子生物学将在哪些领域取得进展？第二章C值：生物单倍体基因组DNA的总量。

C值反常现象：动物形态学复杂程度与C值大小不一致的现象称为C值反常现象。

也称“C 值谬误”真核细胞DNA序列：⑴不重复序列⑵中度重复序列⑶高度重复序列核小体定义：核小体是由H2A、H2B、H3、H4各两个分子生成的八聚体和由大约200bpDNA 组成的。

八聚体在中间，DNA分子盘绕在外，而H1则在核小体的外面。

每个核小体只有一个H1。

核小体是染色体结构的第一个层次，构成染色质的基本结构单位。

真核生物基因组的结构特点： 1. 基因组庞大；2.存在大量的重复序列3. 大部分为非编码序列4. 转录产物为单顺反子5. 有内含子结构6. 存在大量的顺式作用元件7. 存在大量的DNA多态性8. 有端粒结构原核生物的基因组特点：1、结构简练；2、存在转录单元；3、有重叠基因DNA的二级结构：分为右手螺旋和左手螺旋相邻碱基对平面之间的距离为0.34nm，即顺中轴方向，每隔0.34nm有一个核苷酸，以3.4nm为一个结构重复周期。

分子生物学研究方法
分子生物学研究方法是研究生物分子结构、功能和相互作用的一系列实验方法和技术。

这些方法帮助科学家了解细胞的基本结构和功能，研究生物分子在疾病发展、遗传变异和进化中的作用。

以下是一些常用的分子生物学研究方法：
1. DNA提取：从细胞或组织中提取DNA，以用于后续实验。

2. 聚合酶链式反应（PCR）：用于扩增DNA片段，以便进行分析和检测。

3. 凝胶电泳：用电场将DNA、RNA或蛋白质分离成不同大小的片段，以便研究其结构和功能。

4. 蛋白质纯化：通过一系列步骤将目标蛋白质从混合物中纯化出来，以获得足够的纯度用于研究。

5. 克隆：将DNA序列插入到载体中，以产生大量目标DNA 分子，用于进一步的分析和实验。

6. 基因测序：确定DNA序列的顺序，以研究基因功能、分析遗传变异或进行进化研究。

7. 基因表达：将目标基因转录成mRNA，并翻译成蛋白质，以研究基因功能和调控机制。

8. 蛋白质相互作用：使用技术如亲和层析、酵母双杂交等研究蛋白质之间的相互作用关系，以探索细胞信号传导和代谢途径。

9. 基因编辑：利用技术如CRISPR/Cas9，对细胞或生物体的基因进行精确的编辑，以研究基因功能或治疗遗传疾病。

分子生物学研究方法的不断发展和创新使得科学家可以更深入地了解生物分子的结构、功能和相互作用，为疾病治疗和生物技术的发展提供了基础。