固相萃取技术的研究

固相萃取技术的研究赵利剑杨亚玲夏　静(昆明理工大学生化学院,昆明,650093)摘 要 本文从原理、分类、操作、应用等各个方面对固相萃取技术作了全面的介绍,对了解固相萃取技术起到重要的参考意义。

关键词:固相萃取吸附洗脱吸附剂1　前言固相萃取(Solid Phase Extraction,SPE)技术是基于液相色谱理论的一种分离、纯化方法。

1962年,Anton A H等人首次对该技术进行了研究,用吸附剂氧化铝净化样品。

其后SPE技术以其高效性、高选择性、高可靠性、高自动化程度以及低耗性等特点被广泛地应用在制药、精细化工、生物医学、食品分析、环境分析等领域,得到了快速地发展。

目前国外SPE技术在样品的预处理方面已经逐步取代了液2液分离;国内对此的研究起步较晚,但呈现出良好的发展前景[1—3]。

2　基本原理及特点SPE技术基于液2固相色谱理论,采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化,是一种包括液相和固相的物理萃取过程;也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。

固相萃取过程可分为吸附和洗脱两个部分。

在吸附过程中,当溶液通过吸附剂床时,由于吸附剂对目标物质的吸附力大于溶剂的吸附力,因此目标物质被选择性地吸附在吸附床上进行了富集。

在此过程中由于共吸附作用、吸附剂选择性等因素的存在,部分干扰物也会在吸附床上吸附。

吸附过程完成后就进入了洗脱阶段。

“洗脱”是一种使保留在吸附剂上的物质从吸附剂上去除的过程,通过加入一种对分离物的吸引大于吸附剂的物质来完成。

在此过程中,首先要选用适当的溶剂对吸附在吸附床上的干扰物进行洗脱,然后再用洗脱剂对目标物质进行洗脱,最终得到目标物质。

固相萃取同传统的液相萃取法相比主要有以下几个特点:211克服了乳化现象的发生,保证了样品中痕量目标物质的回收。

212萃取精度高、范围广。

固相萃取可应用于包括生物样本中的痕量物质检测在内的多个领域中的痕量检验。

213操作条件温和,适应的p H范围广。

214操作简单易行,周期短,节省试剂,回收率高。

215　效率高。

由于近年来固相萃取与TL C、GC2 MS、H PL C2MS、CE等技术联用,实现了在线操作,自动化程度大大提高,可以进行大批量的物质测定。

3　分类3.1　离线萃取和在线萃取按照操作的不同,固相萃取可分为离线萃取和在线萃取。

离线萃取是指萃取过程完成后再使用一些分析手段进行分析;在线萃取出现于80年代,萃取和分析同步完成,可靠性、重现性、以及操作性能和工作效率都得到很大程度的提高。

由于L C2MS/MS、HPL C等新技术在各个领域的广泛应用,在线萃取已经成为固相萃取技术的发展重点。

3.2　正、反相和离子交换固相萃取按照选用吸附剂的不同,固相萃取可分为正相、反相和离子交换固相萃取。

正相萃取过程中目标物质的极性官能团与吸附表面的极性官能团发生极性作用(包括氢键作用、偶极矩作用以及诱导作用等),从而使溶解于非极性溶剂中的极性物质在吸附剂表面吸附、富集;反相萃取过程中目标物质的碳氢键与吸附表面官能团产生非极性作用(包括范德华力或色散力),使得极性溶剂中的非极性以及中等极性的物质在吸附剂表面吸附、富集;离子交换固相萃取又可分为强阳离子固相萃取和强阴离子固相萃取两种,作用机理都是目标物质的带电荷基团同吸附剂表面的带电基团发生离子静电吸引,从而实现吸附分离。

目前许多新型的固相吸附剂常常综合应用多种作用机制,从而提高了各种固相萃取方法的范围。

4　操作4.1　基本流程典型的固相萃取一般分为五个基本步骤,基本流程如图1所示。

图1　固相萃取基本流程41111　吸附柱根据检测量的大小、待检物质的化学、物理性质选择合适的吸附柱。

41112　活化填料活化填料(一般采用甲醇来活化)有利于吸附剂和目标物质相互作用,提高回收率。

另外甲醇还能起到除杂的作用。

41113　进样使样品流经吸附柱进行吸附。

41114冲洗用水或者是适当的缓冲溶液对吸附柱进行冲洗,将杂质冲洗掉。

41115洗脱选择适当的洗脱剂进行洗脱,收集洗脱液,然后进行浓缩、检验,或者是直接进行在线检验。

4.2吸附剂吸附剂是固相萃取的核心环节,吸附剂选用的好坏直接关系到能否实现萃取以及萃取率的高低,同时新型吸附剂的研发也是固相萃取技术发展和应用的关键所在。

4.2.1传统吸附剂早期的吸附剂多为活性炭、氧化铝等强吸附性材料。

目前常用的传统型固相吸附材料主要有正相、反相和离子交换吸附剂三种。

正相吸附剂主要有硅酸镁、氨基、氰基、双醇基硅胶、氧化铝等,适用于极性化合物;反相吸附剂主要有键合硅胶C 18、键合硅胶C 8、芳环氰基等,适用于非极性至相当极性化合物;离子交换吸附剂包括强阳离子吸附剂(苯磺酸、丙磺酸、丁磺酸等)和强阴离子吸附剂(三甲基丙基胺、氨基、二乙基丙基胺等),适用于阴阳离子型有机物。

4.2.2　新型吸附剂当前固相吸附剂的开发主要集中在两个方面,其一是将极性、非极性以及离子(阴阳)交换基团或高分子树脂混合,研制复合型吸附剂。

其二是免疫亲合型吸附剂及分子印记型吸附剂的研制。

复合型吸附剂综合运用了氢键、极性、非极性以及离子间的相互作用,发挥了各种吸附剂自身的特点,使各种吸附剂在性能上互补,因此这种复合型吸附剂的适用范围更广,适用条件更宽。

目前国内外已经研制出多种复合型吸附剂。

聚合二乙烯苯2N 2乙烯吡咯烷酮及其盐是一种性能独特的反相吸附剂,它独有的亲水和亲脂性质使得它在水中保持湿润,能同时萃取极性物质和非极性物质;以氯甲基化的高分子树脂PS 2DVB (苯乙烯2联苯乙烯共聚物)二乙撑三胺反应制成的一种新型的阴离子交换聚合树脂,能同时萃取离子型和非离子型化合物;将碳化吸附剂与PS 2DVB 合用,能同时萃取强极性化合物和离子型化合物;将未封尾的C 18硅胶与单官能团的C 18硅胶混合,可以扩大C 18柱的极性范围。

免疫亲合型吸附剂是基于抗体2抗原相互作用的原理而研制出来的一种新型的固相吸附剂。

即首先制备一种专属性的抗体,然后将其固定在琼脂糖或硅胶上,当样品通过吸附床时发生抗原2抗体结合,从而专属性地将目标物质分离出来。

这种吸附剂是目前已知选择性最强的固定相吸附剂。

这类新型吸附剂充分利用了生物免疫抗原2抗体之间的高选择性和高灵敏性,适用于干扰物浓度较高的复杂基质中痕量的分析。

由于这种吸附剂的选择性极高,而且操作简单,萃取、浓缩、分离可一步完成,所以特别适用于在线操作。

近年来这种吸附剂越来越多地被应用于医学、生物学以及环境分析等领域。

免疫亲合型吸附剂虽然选择性极高,但是每种分析物必须要有一种选择性抗体,所以免疫亲合型萃取的应用范围很窄,而且抗体研制需要的时间也很长(一般需要一年左右的时间)。

分子印记型吸附剂是在解决免疫亲合型吸附剂存在问题的基础上而研制的一种新型的替代产品。

是通过共价键或非共价键的方式制备出来的一种高稳定的聚合物,耐高温、耐酸碱、开发周期较短,能从复杂的生物基质中选择性地提取出微量分析物。

免疫亲合型吸附剂和分子印记型吸附剂目前仍处于实验室阶段,市场上尚未有正式商品,但是毋庸置疑的是,这两种新型吸附剂的研制将是固相萃取技术未来发展的主要方向。

4.3　洗脱剂在固相萃取中,洗脱剂的选择与目标物质的性质以及所选用洗脱剂的性质有关。

选择洗脱剂的时候首先应考虑其对固相的适应性和对目标物质的溶解度,其次是传质速率的快慢。

一般来说,洗脱正相吸附剂吸附的目标物质的时候,选用非极性有机溶剂(如正己烷、四氯化碳等);洗脱反相吸附剂吸附的目标物质的时候,一般选用极性有机溶剂(如甲醇、乙腈、一氯甲烷等);对于离子交换吸附剂,常采用的洗脱剂是高离子强度的缓冲液,中和目标物质或吸附剂官能团所带的电荷,破坏静电吸引,实现洗脱。

为提高的回收率,洗脱剂多选用小分子的有机溶剂,增大洗脱剂用量。

这样可使吸附剂上的目标物质尽可能地被洗下,但同时可能会引进一些杂质,给分析带来干扰。

值得注意的是,以甲醇为洗脱剂洗脱树脂时,如果甲醇体积过大,则会引起树脂的充分溶胀,目标物质深入到树脂的内部间隙,很难再被洗脱,这就导致了洗脱不完全,回收率降低。

5　应用同传统的液2液萃取相比,固相萃取技术存在着诸多优点,尤其是它的高选择性是液2液萃取不能相比的。

因此固相萃取技术的应用使得原本用液2液萃取方法难以分离或者分离效果不好甚至不能分离的物质得以很好地分离。

近些年固相萃取技术得到很快地发展并且被广泛地应用在许多领域。

本文主要从以下几个方面进行概括性地介绍。

5.1　在生物样本分析中的应用Raggi等用SPE2H PL C同时测定人血浆中的氯氮平及其活性代谢物去甲氯氮平的含量,回收率在88%以上,检测限为1ng/mL[4];Okazaki等用C82SPE柱吸附奥弗拉辛及其二甲基和N2氧基代谢物,所有分析物回收率均达98%[5];L u等以SPE2 HPL C荧光检测法测定了血浆中痕量的甲氨喋呤和72羟基甲氨喋呤,甲氨喋呤的最低检出限为0105ng/mL[6];Stafford等采用二羟基及C18Bond Elut小柱处理血浆中抗癌药G I147211的内酯及羧基型成分,最低检出量分别为0105ng/mL和011ng/mL[7];Lacroix等建立了SPE2HPL C荧光检测法测定了人血浆中的神经肌阻滞剂米伐库铵对映异构体及其代谢物,检测灵敏度达319ng/mL[8];谭力等建立了SPE2H PL C测定依纳普利血药浓度的方法,最低检测浓度为115ng/mL[9];Moriyama 等应用C18柱萃取,仅用20μL血浆,同时测定了抗癫痫药扑米酮及其活性代谢产物苯乙基丙二酰和苯巴比妥[10];See等采用Sep2Pak小柱将L TD4拮抗剂M K0476从介质中萃取,以离子色谱法分析了原料药中残留的醋酸盐[11];Kupferschm idt等运用SPE方法研究爱滋病患者血样中3′,22迭氮基2,3′, 22去氧胸腺嘧啶脱氧核苷,使极大地减少了样本处理量,提高了实验操作的安全性[12]。

5.2　在微量毒物分析中的应用以XAD22树脂为吸附剂可以提取尿液中的四氢大麻酚及其主要代谢物,也可以用来提取胆汁中的吗啡、可卡因等物质,收到了良好的效果[13];用Chem Elut固相萃取柱可以提取血液、尿液中的吗啡、大麻酚、可卡因、苯甲酰爱冈宁等四种成分以及其代谢物,联用GC/MS能检出血中治疗量浓度,也可以用来筛选分析尿中苯二氮杂卓类药物原体及在生物体内的缀合物和葡萄糖醛酸结合物;用SepPak C18柱,可以用来提取血液和脑脊液中的普鲁卡因、利多卡因、丁卡因以及苯环已派啶等,也可以用在萃取尿中的安眠镇静药类分析中[14];T1K ojima 等人用Extrelut柱萃取测出了服用有机磷杀虫剂33h后血液中的杀螟松原体和66h后尿中的代谢物:氨基杀螟松、氨基杀螟松2xon、乙酰基杀螟松等成分;C1L1Holder等人用硅胶柱萃取,联用GC/ ECD检测生物体内磺胺甲基嘧啶杀菌剂,取得良好的结果;Hold等人运用Bond2Elut Certify固相柱,联用GC/MS测定毛发中的可卡因、阿片以及它们的代谢物咖啡因、爱康宁等成分,检测限均达500pg/mg[15];Carmichael等人运用C18柱对细菌污染的牡蛎中麻痹毒素和致腹泻毒素作了提取,优化了提取步骤[16];Fiori等人运用SPE技术,联用L C2 MS对牛奶中非法添加的地塞米松等9种皮质类固醇进行测定,检测水平达20pp b[17];Skog等人运用SPE技术,联用GC2MS检测高温烤肉中的致癌物质杂环胺进行了测定,检测水平达到ng/g级别[18];李青等运用SPE技术,联用GC2MS设计出一种检测粮食中的五氯硝基苯的方法,检出限达5×10-9 mg/g,满足了我国对粮食中五氯硝基苯含量的监督、监测需要[2]。