基因工程研究生11

基因工程绪论1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。

作动词：基因的分离和重组的过程。

2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。

供体、受体和载体是基因工程的三大要素。

3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。

以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。

三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。

2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。

5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。

6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。

7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。

8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。

9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。

10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。

提取目的基因的方法
提取目的基因的方法
1、直接分离基因 将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来 目前被较广泛 提取使用的目的基 因有： 因有：苏云金杆菌 抗虫基因、 抗虫基因、人胰岛 素基因、 素基因、人干扰素 基因、 基因、种子贮藏蛋 白基因、 白基因、植物抗病 基因等。 基因等。
被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？
被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？ 被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？ DNA是否具有相同的黏性末端
G AA T T C C T T AA G 用同种限制酶切割 G AA T T C G G AA T T C G G AA T T C C T T AA G
质粒
质粒
质粒是能自主复制的双链环状DNA分子 质粒是能自主复制的双链环状DNA分子 双链环状DNA
质粒
质
粒
标记基因，便于进行检测 标记基因，
基因操作的基本步骤
基因操作的基本步骤
1. 获取目的基因 2. 形成重组DNA分子 形成重组DNA DNA分子 3. 将重组DNA分子导入受体细胞 将重组DNA DNA分子导入受体细胞 4.筛选含有目的基因的受体细胞 4.筛选含有目的基因的受体细胞 5.目的基因的表达 5.目的基因的表达
转基因番茄
以色列研究人员日前宣布，他们利用 以色列研究人员日前宣布， 转基因技术培育出一种具有柠檬和玫 瑰香味的新品种番茄。 瑰香味的新品种番茄。生成类胡萝卜 素的其他农作物和花也可以像番茄一 通过转基因技术改变气味和口味。 样，通过转基因技术改变气味和口味。 吃个番茄也能抗乙肝，这绝非天方夜谭。每天坐在家里， 吃个番茄也能抗乙肝，这绝非天方夜谭。每天坐在家里， 吃上三五只西红柿，人们体内就能产生乙型肝炎病毒的抗体， 吃上三五只西红柿，人们体内就能产生乙型肝炎病毒的抗体， 达到和注射疫苗一样的效果。 达到和注射疫苗一样的效果。 中国农科院生物研究所有关研究人员指出， 中国农科院生物研究所有关研究人员指出，“利用转基 因植物生产乙型肝炎口服疫苗”是国家863 863高新生物技术领域 因植物生产乙型肝炎口服疫苗”是国家863高新生物技术领域 中的一项研究，该项研究经过研究人员的共同努力， 中的一项研究，该项研究经过研究人员的共同努力，现已取得 重大成果，科研人员在研制出转基因马铃薯后， 重大成果，科研人员在研制出转基因马铃薯后，现又将乙型肝 炎病毒包膜中蛋白抗原基因成功导入西红柿并获得稳定和高效 表达，这就意味着，人们不必忍痛， 表达，这就意味着，人们不必忍痛，轻松地吃几个西红柿就能 将谈之色变的乙型肝炎轻松拒之于身外。 将谈之色变的乙型肝炎轻松拒之于身外。 问题

The model of DNA-pol III
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DNA pol I
H B
J
小片段 大片段 （Klenow fragment）
5 ‘ →3 ’聚合功能， 3 ' →5 '外切酶活性 5 ' →3 '外切酶活性
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真核细胞中DNA聚合酶
种类： DNA-pol α、β、γ、δ、ε… DNA pol δ：合成领头链
UGA（终止密码子）：Trp AGA/AGG（Arg）：终止密码子 AUA（Ile）：Met（起始密码子）
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3’
5’ 5’ 3’
OH
P
DNA-pol
5’
3’ 5’
3’
DNA-pol 的 5´3´聚合作用
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外切酶与内切酶作用图解
内切酶 （限制性内切酶） 5´ 3´外切 5’ 3´5´外切 3’
4. 冈崎片段（Okazaki fragment）：
不连续复制的片段
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ori 5. 双向复制 以起始点为中 心，向两个方 向进行复制。
6. 复制子(replicon) 真核生物两个相 邻复制起始点之 间的DNA片段。 ori
ori
ori
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滚环复制
是某些病毒，质粒、线粒体 DNA的特殊复制形式。
性质
Ⅲ 20 100000 有 无 有 复制
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Leading strand synthesis

Lagging strand synthesis


’



form the catalytic core

专题１基因工程1.1 DNA重组技术的基本工具１．基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

操作水平是DNA分子水平，操作环境是在体外。

２．“分子手术刀”──限制性核酸内切酶。

这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。

迄今已从近300种微生物中分离出了约4000种限制酶。

能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列；切开两个两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成黏性末端或平末端。

３．“分子缝合针”──DNA连接酶。

将切下来的DNA片段拼接成新的DNA 分子，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。

种类：1）E.coli DNA连接酶：只能将双链DNA片段互补的粘性末端之间连接起来2）T4 DNA连接酶：既可以“缝合”双链DNA片段互补的粘性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低４．“分子运输车”──基因进入受体细胞的载体。

作为载体的必要条件：能自我复制、有切割位点、有遗传标记基因等。

载体的种类：细菌质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒1.2 基因工程的基本操作程序１．基因工程的基本操作步骤主要包括：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。

２.目的基因的获取方法：从基因文库中获取、利用PCR提取目的基因、人工合成法。

3.PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。

原理DNA双链复制。

条件：模板DNA；RNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq 酶）。

方法：DNA受热变性解旋为单链、冷却后RNA引物与单链相应互补序列结合、DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。

4．基因表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中稳定存在；可以遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。

5．基因表达的载体的组成目的基因 +启动子 + 终止子 + 标记基因6．转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。