分子生物学：第十一章分子生物学技术

分子生物学——原理与技术分子生物学是现代生物学中的一门重要科学，研究生物体的分子结构、功能和相互作用。

它是以DNA、RNA、蛋白质等重要分子为研究对象，探究它们的生物学意义，是基因工程和生物技术的理论基础，也是解决很多现代生物医学问题的关键。

一、 DNA、RNA和蛋白质分子生物学的研究对象包括DNA、RNA和蛋白质三种重要分子，这三种分子在细胞中各自发挥着至关重要的作用。

1. DNADNA（Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸），是构成基因的物质，是决定遗传信息及其表达的物质基础。

它由四种不同的碱基组成，分别是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（C）和胞嘧啶（G）。

DNA的结构像一条双链，两条链通过碱基互补配对而保持高度的稳定性和准确性，即A氢键与T 碱基配对，C氢键与G碱基配对。

2. RNARNA（Ribonucleic acid，核糖核酸），具有多种功能，如携带遗传信息、参与蛋白质合成、调节基因表达等等。

RNA的组成与DNA相似，同样由四种碱基组成，区别在于RNA中的胸腺嘧啶（T）被尿嘧啶（U）替代，且RNA是单链分子，而不是DNA的双链。

3. 蛋白质蛋白质是生物体内最重要的有机分子之一，也是分子生物学研究的重点之一。

蛋白质通过氨基酸的序列组成，不同的氨基酸序列决定了不同的功能和空间结构。

蛋白质在细胞中扮演着重要的角色，如酶催化反应、维持细胞结构、参与信号传导等等。

二、分子生物学基础技术分子生物学的研究方法主要包括分离、纯化、检测和克隆等技术手段。

下面就一些典型的实验方法进行说明：1. DNA分离与纯化方法（1）酚-氯仿：利用酚（Phenol）和氯仿（Chloroform）进行分离。

由于DNA对极性较弱，所以可以在酚-水界面处沉淀下来，然后利用氯仿分层，最后从水层中分离DNA。

（2）膜过滤：膜过滤法是利用孔径不同的膜进行分离纯化DNA。

一般使用微孔聚丙烯膜，按孔径大小可分为A、B、C三种不同的型号。

第十章DNA的生物合成一、遗传学的中心法则和反中心法则：DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。

DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。

但在少数RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA中。

因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代；通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就称为反中心法则。

二、DNA复制的特点：1．半保留复制：DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semiconservative replication)。

DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M. Meselson 和F. Stahl 所完成的实验所证明。

2．有一定的复制起始点：DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点（复制子）。

在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。

3．需要引物(primer)：DNA聚合酶必须以一段具有3'端自由羟基（3'-OH）的RNA作为引物，才能开始聚合子代DNA链。

RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。

4．双向复制：DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。

但在低等生物中，也可进行单向复制。

5．半不连续复制：由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA链，因此两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。

以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在聚合时基本上是连续进行的，这一条链被称为领头链(leading strand)。

分子生物学实验技术分类分子生物学实验技术是现代生物学研究中不可或缺的一部分，它涉及到对生物体内分子结构、功能和相互作用的研究。

这些实验技术在基础科学研究、医学诊断和药物研发等领域发挥着重要作用。

在分子生物学实验技术中，根据其应用和原理可以进行分类，主要包括以下几类：1. 基因克隆技术，基因克隆技术是分子生物学研究中常用的技术之一，它包括DNA片段的定向克隆、质粒构建、DNA序列分析等。

通过基因克隆技术，研究人员可以将感兴趣的基因或DNA片段放入适当的载体中，进行进一步的研究和应用。

2. 蛋白质分离和纯化技术，蛋白质是生物体内重要的功能分子，其结构和功能的研究对于理解生物学过程至关重要。

蛋白质分离和纯化技术包括凝胶电泳、亲和层析、离子交换层析等方法，可以将混合的蛋白质样品分离并得到纯净的蛋白质。

3. 核酸分离和检测技术，核酸是生物体内的遗传物质，包括DNA和RNA。

核酸分离和检测技术包括DNA/RNA提取、聚合酶链式反应（PCR）、原位杂交等方法，可以用于检测和分析生物体内的核酸序列。

4. 基因组学和转录组学技术，基因组学和转录组学技术是对生物体内所有基因组和转录组的研究，包括全基因组测序、RNA测序、ChIP-seq等方法，可以帮助研究人员全面了解生物体内基因的组成和表达模式。

5. 蛋白质-核酸相互作用技术，蛋白质和核酸之间的相互作用对于细胞内的生物学过程至关重要。

蛋白质-核酸相互作用技术包括免疫共沉淀、荧光共聚焦、电泳迁移变性等方法，可以帮助研究人员研究蛋白质和核酸之间的相互作用。

以上是分子生物学实验技术的一些分类，这些技术的不断发展和创新为生物学研究提供了强大的工具，也推动了生物医学领域的进步。

在未来，随着技术的不断进步，分子生物学实验技术将继续发挥重要作用，为人类健康和生命科学研究带来更多的突破和进展。

第十一章真核基因表达调控1．课程教学内容(1) 真核基因表达调控的特点(2) 真核基因表达调控的不同层次(3) 染色体水平的调控(4) DNA水平的调控(5) 真核基因转录水平的调节调控2．课程重点、难点真核生物基因表调控的特点、组蛋白乙酰化和DNA甲基化对基因表达的影响及机理、真核基因转录水平调控的机理。

3．课程教学要求（1）掌握真核生物基因表达调控的特点和方式；（2）掌握真核生物的多层次对基因的表达调控的机理和特点，理解真核生物与运河生物的基因调控的异同；（3）了解真核生物的其他表达调控方式。

▲真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约 4×106bp ，哺乳类基因组在109bp 数量级，比细菌大千倍；大肠杆菌约有 4000 个基因，人则约有 10 万个基因。

▲真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分 ( 如线粒体 DNA 等 )▲▲如前所述，细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元，共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron) 的 mRNA ；真核生物则是一个结构基因转录生成一条 mRNA ，即 mRNA 是单顺反子 (monocistron) ，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到▲原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中仅约 10% 的序列为蛋白质、 rRNA 、 tRNA 等编码，其余约 90% 的序列功能至今还不清▲原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子 (exon) 和内含子 (intron) ，转录后需经剪接(splicing) 去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节▲原核基因组中除 rRNA 、 tRNA 基因有多个拷贝外，重复序列不多。

分子生物学技术近年来，心血管疾病的发病率和死亡率急剧增加，已成为危害我国人民群众生命和健康的重大疾病。

人们逐渐认识到,包括心血管疾病在内的许多疾病的生理、病理机制的本质问题是相关基因的表达及其调控。

随着研究的深入, 心血管疾病的研究已深入到分子生物学水平。

人们寻找疾病相关基因, 研究其表达调控机制, 希望在分子水平阐明疾病发生机制, 以期更有效地进行疾病的诊断、治疗。

相应地, 很多分子生物学研究技术也应用到对心血管疾病的研究中来, 成为不可或缺的基本手段, 如分子杂交技术、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR）技术、反义核酸技术、DNA微阵列、转基因技术等等。

分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据的一门学科。

1953年Watson & Crich发现DNA 双螺旋结构, 标志着分子生物学时代的到来。

随着研究的进展, 人们对心血管疾病的研究也逐步深入到分子水平, 很多分子生物学的研究技术也在疾病机理、药物机理的研究中广泛应用, 成为基本的研究手段。

人类基因组计划完成后, 生命科学研究进入后基因组时代, 进行功能基因组学、蛋白质组学的研究, 相应的实验技术也广泛应用并不断发展。

在过去的短短的10余年中,检验医学发展日新月异、发展迅猛,临床实验室的实验设备已高度自动化及网络化，“实验室全自动化”（Total Laboratory Automation,TLA）、分子诊断（MolecularDiagnostics）、床旁检验（Point of Care Tests,POCT）、循证检验医学（Evidence basedlaboratory medicine,EBLM）的兴起为心血管疾病的诊疗提供了极大帮助。

一、分子生物学技术由于分子生物学技术的快速发展,以及人类基因组序列认识的逐渐完善,以PCR为代表的体外核酸扩增技术已在临床基因诊断中得以较为广泛的应用,如病毒、细菌的基因快速检测,遗传性疾病的诊断,肿瘤的基因诊断等。

现代分子生物学技术及实验技巧1 自由基技术自由基技术是分子生物学中的一种技术，它能够探测分子物质中的自由基浓度以及自由基的反应，从而深入研究分子物质的性质。

自由基技术采用的是自由基信号分子，通过对其进行观察或者对其进行探测和量化，可以了解分子物质的反应过程和分子物质中自由基的浓度。

2 聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应技术是一种分子生物学技术，是一种能够进行DNA 复制的技术。

聚合酶链式反应技术可以迅速扩增DNA片段，因此被广泛应用于DNA检验、生物工程、基因工程等领域。

聚合酶链式反应技术的原理是，在适当的酶和DNA单链片段存在的条件下，通过反复进行变性、退火和扩增等步骤，将DNA片段快速扩增至数量足够进行检验。

3 基因编辑技术基因编辑技术是一种通过人工干预改变生物个体基因组序列的技术。

基因编辑技术主要应用于基因治疗、育种、制药等领域，能够快速地对基因组进行编辑，从而改变生物的基因表达及特性。

现如今，基因编辑已经成为研究生命科学、探求生命本质的一项重要技术手段。

4 蛋白结晶技术蛋白结晶技术是一项关键提取遗传工程、药物研发和生物晶体学所需的蛋白质结晶技术，是在分子生物学中应用广泛的一种实验技术。

它可用于发现新药物、解决蛋白质功能、交互和酶学机制等多方面的问题，从而促进分子生物学、药学、生物技术、医药化学等领域的发展。

蛋白结晶技术的发展，对于建立高清晰度的蛋白质立体结构图库至关重要，对于发现生命科学的秘密有重要的作用。

5 特异性溶解曲线PCR技术特异性溶解曲线PCR技术是一种在PCR扩增反应中，通过检测DNA 的特征溶解温度来区分目标DNA和异质DNA的技术。

该技术结合了不需要胶回的扩增、高诊断准确性和高速度等优点，极大地提高了实验效率。

特异性溶解曲线PCR技术的应用使DNA的扩增和监测更加精确、简单和操作高效，可以广泛地应用于生命科学研究、临床试验等领域。