稻瘟病菌SSR 反应体系的优化

Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： ＳＳＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｉｎ Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｇｒｉｓｅａ． Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ＳＳＲ－ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ， ｔｈｅ ｍａｉｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌ９ （３４） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ ：ｔｈｅ ２０ μ ｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ＴａｑＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．０Ｕ， Ｍｇ２ ＋ １．０ ｍｍｏｌ／Ｌ， ｄＮＴＰ １００ μｍｏｌ／Ｌ ａｎｄ Ｐｒｉｍｅｒ ０．４ μｍｏｌ／Ｌ． Ｕｓｉｎｇ ｔｈｉｓ ｓｙｓｔｅｍ， ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｃｌｅａｒ， ｓｔａｎｄａｒｄ ａｎｄ ｎｏｎ－ ｅｓｐｅｃｉａｌ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｓｈｏｒｔｅｒ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｇｒｉｓｅａ， ＳＳＲ， Ｓｙｓｔｅｍ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
第 一 作 者 简 介 ： 臧威， 女， １９７５ 年出生， 讲师， 在读博士， 主要从事植物病理学方面的科研与教学工作。通信地址： １６１００６ 齐齐哈尔市文化大街 ４２ 号齐齐
哈尔大学生命科学与工程学院 ， Ｅ－ｍａｉｌ： ｚａｎｇｗｅｉ４６７０＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。
通 讯 作 者 ： 李柱刚， 男， １９７３ 年出生， 研究员， 博士， 主要从事分子生物学方面的研究工作。通信地址： １５００８６ 黑龙江省哈尔滨市学府路 ３６８ 号省农科院生
１，３
（１Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００４０；
２ ３
Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ， Ｈａｒｂｉｎ １５００８６；
Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｑｉｑｉｈａｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｑｉｑｉｈａｒ １６１００６）
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开发相对较晚， 有关 ＳＳＲ 应用的报道也较少。另外， ＳＳＲ 标记应用于不同病菌时会出现较大的差异， 其反 应条件易受各种因素的干扰，如 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、 Ｍｇ２＋、 ｄＮＴＰ、 引物及模板的浓度等， 任何一个因子设 置不当， 都会影响整个反应， 改变带型甚至没有扩增 产物。因此， 有必要对稻瘟病菌 ＳＳＲ 反应体系中各个 成分的浓度及用量进行筛选实验， 系统地研究其最佳 反应条件， 优化反应体系， 为后续的稻瘟病菌分子标 记及基因定位奠定基础。 １ 材料与方法
３
１，３
， 严善春
１
２ （１ 东北林业大学林学院， 哈尔滨 １５００４０； 黑龙江省农业科学院， 哈尔滨 １５００８６；
齐齐哈尔大学生命科学与工程学院， 齐齐哈尔 １６１００６）
摘 要 ： 稻瘟病菌 ＳＳＲ 检测是分子标记辅助育种的一项重要技术。为优化 ＳＳＲ 反应体系 ， 以稻瘟病菌 菌 株 ５０４ 为 供 试 材 料 ， 采 用 单 因 素 筛 选 法 及 Ｌ９（３４） 正 交 试 验 设 计 ， 研 究 了 稻 瘟 病 菌 ＳＳＲ 分 析 中 ＰＣＲ 反应体系的主要成分对扩增结果的影响。 结果表明 ： 在总体积为 ２０μｌ 的 ＰＣＲ 反应中 ， Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合 酶 的 最 适 用 量 为 １．０Ｕ ； Ｍｇ２＋、 ｄＮＴＰ 和 引 物 的 最 适 终 浓 度 分 别 为 １．０ｍｍｏｌ／Ｌ、 １００ μ ｍｏｌ／Ｌ 和 稳定、 非特异性带少。 ０．４μｍｏｌ／Ｌ。利用该体系进行扩增 ， 所得谱带清晰、 关键词 ： 稻瘟病菌 ； ＳＳＲ ； 体系优化 文献标识码 ： Ａ 中图分类号 ： Ｓ４３２．１
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｖｏｌ． ２３ Ｎｏ． ６ ２００７ Ｊｕｎｅ
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农业生物技术科学
稻瘟病菌 ＳＳＲ 反应体系的优化
臧 威
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， 张兰兰 ３， 张国民 ２， 李柱刚 ２， 张淑园 ３， 孙剑秋
简单序列重复 （Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ， ＳＳＲ） 又 称微卫星 （Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）， 是由 １￣５ 个核苷酸为单位 多次串联组成的 ＤＮＡ 序列，其长度大约在 ３００ｂｐ 以 内。 ＳＳＲ 是基于 ＰＣＲ 基础上的一种分子标记， 最早在 人类基因组中发现， 而后发现其广泛存在于真核生物 基因组中。ＳＳＲ 序列的侧翼具有高度保守的 ＤＮＡ 序 列， 由于重复次数差异较大， 扩增出的序列长度变化 也较大， 因而成为检测多态性的一种有效方法， 可以 ［１］ 在 ＤＮＡ 水平上检测物种的遗传多样性 。 ＳＳＲ 具有以下主要特点： ①数量丰富， 覆盖整个基因组； ②多态性高， 等位位点多， 信息含量丰富； ③通常为共显性遗传； ④实验操作简单，对 ＤＮＡ 的数量和质量要求不 高； ⑤重复性、 稳定性较好。 因此， 近年来已经成为植物遗传图谱构建、 基因 定位、 物种进化与分类、 品种遗传多样性、 品种保护、 亲子分析与纯度鉴定、 杂种优势机理及预测、 分子标 ［２￣４］ 记辅助育种等研究领域中重要的分子标记 。目前， 在大麦 ［５］、 水稻 ［６］、 玉米 ［７］、 拟南芥 ［８］等植物中有较多应 用。但是在病原菌中尤其在稻瘟病菌中， ＳＳＲ 引物的
地点 １．１ 试验时间、
⑤加入 ７００μｌ 酚 ／ 氯仿（１／１）， 剧烈摇动 １０ｍｉｎ， 于 １２０００ｒ／ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ。 ⑥取上清液转入另外一个新的离心管中，加入等 体积的氯仿 ／ 异 戊 醇 （２４／１）， 轻 摇 混 匀 ， 离 心 ， 于 １２０００ｒ／ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ。 ⑦取上清液加入 ４μｌ Ｒｎａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ） 混匀， ３７℃ 水浴 １ｈ。 ⑧水浴后加入 ０．６ 倍体积的 －２０℃的异丙醇， 轻摇 混 匀 后 置 于 －２０℃ 冷 冻 ０．５ｈ， 于 １２０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 １０ｍｉｎ。 ⑨倒掉上清液，用预冷的 ７０％ 乙醇洗涤沉淀两 次， 置于超净工作台上吹干， 加入 ５０μｌ ＴＥ 缓冲液溶 解 ＤＮＡ， －２０℃保存备用。 ＤＮＡ 浓度和质量分别由紫外分光光度计和 １％ 的琼脂糖凝胶电泳进行检测， ＤＮＡ 纯度由 ＯＤ２６０／２８０ 值 确定。 １．４．３ ＳＳＲ－ＰＣＲ 扩 增 反 应 体 系 ＰＣＲ 扩增采用 ２０ μ ｌ 的反应体系， 其中含 １×Ｂｕｆｆｅｒ、 ０．１ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ、 １．０Ｕ ＴａｑＤＮＡ 聚合酶、 ０．３ μ ｍｏｌ／Ｌ 引物、 ４０ｎｇ／ μ ｌ 模板， 无 菌超纯水补足体积至２０μｌ， １５μＬ矿物油覆盖。 １．４．４ ＰＣＲ 扩 增 程 序 ＰＣＲ 扩 增 反应 循 环 参 数 参 照 Ｃｌａｕｄｉａ Ｋａｙｅ ［１０］ 的方法，反应程序为： ９５℃预变性 ４ｍｉｎ； ９４℃变性 ３０ｓ； ５０￣６０℃ （ 按特定引物特定温度 ） 退火 ３０ｓ； ７２℃延伸 ３０ｓ；共 循 环 ２５ 次 ； ７２℃ 延 伸 ８ ｍｉｎ； ４℃保存。 １．４．５ ＰＣＲ 产物的电泳检测 取 ７μｌ ＰＣＲ 扩增产物和 ２ μＬ 含 ０．２５％ 溴酚蓝指示剂的上样缓冲液， 混匀， 点 入含有 １．０ μ ｇ／ｍｌ 溴化乙锭的 ３％ 琼脂糖凝胶中， 用 １ ×ＴＢＥ 电 极 缓 冲 液 ， 在 恒 定 １２０Ｖ 电 压 下 电 泳 ３０ｍｉｎ， 然后用 ＢＩＯ－ＲＡＤ 公司的紫外凝胶成像系统观 察结果。 １．４．６ ＰＣＲ 反应体系优化的单因素试验 在保持 ＰＣＲ 反应体系中其它因素一致的条件下，变化单一因子， 筛选反应体系中模板 ＤＮＡ、 ｄＮＴＰ、 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、 ２＋ Ｍｇ 及引物等各个影响因素的较好的用量，分别对 各 组 成 成 分 进 行 浓 度 梯 度 试 验 ， 其 中 ｄＮＴＰ 设 ２５μｍｏｌ／Ｌ、 ５０ μ ｍｏｌ／Ｌ、 ７５ μ ｍｏｌ／Ｌ、 １００ μ ｍｏｌ／Ｌ 和 １２５μｍｏｌ／Ｌ 等 ５ 个 浓 度 ； ＳＳＲ 引 物 设 ０．１ μ ｍｏｌ／Ｌ、 ０．２μｍｏｌ／Ｌ、 ０．３ μｍｏｌ／Ｌ、 ０．４ μｍｏｌ／Ｌ 和 ０．５ μｍｏｌ／Ｌ 等 ５ 个 浓 度 ； 模 板 ＤＮＡ 设 １０ｎｇ／ μ ｌ、 ５０ｎｇ／ μ ｌ、 １００ｎｇ／μｌ、 １５０ｎｇ／ μ ｌ 和 ２００ｎｇ／ μ ｌ 等 ５ 个 浓 度 ； Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶设 ０．１Ｕ、 ０．５Ｕ、 １．０Ｕ、和 １．５Ｕ 等 ４ 个浓 ２＋ 度 ； Ｍｇ 设 １．０ｍｍｏｌ／Ｌ、 １．５ｍｍｏｌ／Ｌ、 ２．０ｍｍｏｌ／Ｌ 和 ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、 ３．０ｍｍｏｌ／Ｌ 等 ５ 个浓度。
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＳＲ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｇｒｉｓｅａ Ｚａｎｇ Ｗｅｉ ， Ｚｈａｎｇ Ｌａｎｌａｎ３， Ｚｈａｎｇ Ｇｕｏｍｉｎ２， Ｌｉ Ｚｈｕｇａｎｇ２， Ｚｈａｎｇ Ｓｈｕｙｕａｎ３，Ｓｕｎ Ｊｉａｎｑｉｕ１，３， Ｙａｎ Ｓｈａｎｃｈｕｎ１
物技术中心。Ｔｅｌ： ０４５１－８６６６１８２０， Ｅ－ｍａｉｌ： ｌｉｚｈｕｇａｎｇ＠１６３．ｃｏｍ。
收 稿 日 期 ： ２００７－０３－２８， 修回日期： ２ ６ 期 ２００７ 年 ６ 月 农业生物技术科学
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研究试验于 ２００７ 年在黑龙江省农业科学院进 行。 １．２ 试验材料 试验以黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所提 供的稻瘟病菌菌株 ５０４ 为材料。 １．３ 试剂和仪器 试验所用的 Ｔａｑ 酶、 ｄＮＴＰ、 １０ ×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ 等试 剂均购自哈尔滨宝泰克生物技术有限 公 司—ＭＢＩ， ＳＳＲ 引物由上海生物工程公司合成， ＳＤＳ、 Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ、 Ａｇａｒｏｓｅ 等 试 剂 均 为 进 口 超 纯 试 剂 ， ＰＣＲ 仪 为 美 国 ＡＢＩ 公司生产的 ＦＣ－０４－２ 型梯度 ＰＣＲ 仪， 电泳仪为北 京六一仪器厂的 ＤＹＹ－１２Ｃ 型稳压稳流高压电泳仪， 电泳槽为北京君意仪器厂生产的 ＪＹ－Ｃ ×２Ａ 型电泳 槽。 １．４ 试验方法 １．４．１ 稻 瘟 病 菌 菌 丝 体 的 制 备 将供试的稻瘟病菌单 孢菌株平板培养 １ 周后， 挑取新鲜的菌丝块接种于经 高压灭菌的液体培养基中 （ 含 ０．２％ 酵母粉的 ＰＤＡ 培 养基）， 振荡培养 ４￣５ｄ ，然后用纱布过滤收集菌体， 再 用无菌水洗涤菌丝体两次 ， 尽量压干水份 ， 置于 －７０℃ 备用。 １．４．２ 稻 瘟 病 菌 全 基 因 组 ＤＮＡ 的 提 取 基因组 ＤＮＡ 的提取参照何月秋的 ＳＤＳ 法［９］， 并作适当修改。 ①称取 ０．１ｇ 的干菌丝，用液氮充分研磨至粉末 状。将粉末转入 ５ｍｌ 的离心管中，加入 ５００μｌ ＤＮＡ 提取缓冲液， 充分震荡使粉末与缓冲液混合均匀。 ②加入 ５０μｌ ２０％ 的 ＳＤＳ （ 十二烷基苯磺酸钠 ）， 激烈摇动离心管使混合物充分混匀，置于 ３７℃水浴 １ｈ， 期间缓慢颠倒离心管数次。 ③加入 ７５μｌ ５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ， 轻轻颠倒离心管以混 合均匀， 冰上放置 ３０ｍｉｎ。 ④加入 ６５μｌ１０％ＣＴＡＢ（十六烷基三甲基溴化铵） ＋０．７５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ， 轻摇混匀， ６５℃水浴 ２０ｍｉｎ。