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薄层色谱法

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色谱学 第三章 薄层色谱

色谱学 第三章 薄层色谱




在吸附色谱过程中，溶质、溶剂和吸附剂三 者是相互联系而又相互竞争的，如此构成了 整个层析分离过程 。 在薄层吸附色谱过程中，主要为物理吸附， 无选择性。因之吸附剂与多元组分溶液接触 时，一方面任何溶质都可被吸附（当然单位 重量吸附剂所能吸附物质的量，即“吸附量” 会因物质种类而异），另一方面，吸附剂也 可吸附流动相分子。由于物理吸附是可逆的， 故被吸附的分子同时也可被解吸出来。

偶氮染料 偶氮苯 对甲氧基偶氮苯 苏丹黄 苏丹红 对氨基偶氮苯 对羟基偶氮苯
Ⅱ 0.61 0.28 0.18 0.11 0.04 0.01
表3-2 硅胶活度分级法 Rf Ⅲ Ⅳ 0.70 0.83 0.43 0.67 0.30 0.53 0.13 0.40 0.07 0.20 0.01 0.07




除上二种外，还有其他一些吸附剂。吸附剂品种如下： （1）硅胶：薄层色谱用为200~250目粒度，规格很多，一般如有石膏作粘 结剂，称硅胶G；石膏含量为5~20%，一般为10~13%，亦有用淀粉作粘 结剂的，称硅胶S，不加粘结剂者称硅胶H或硅胶N，为了便于观察组分的 斑点，也可在硅胶中加入荧光指示剂。如果又加有粘结剂时，则称为硅胶 GF或硅胶GF254，即吸收254nm紫外光。 （2）氧化铝：根据加有粘结剂情况不同，有H、G、HF、GF等品种。 （3）硅镁吸附剂：即费罗里硅土，使用前要在130℃下活化二小时。 （4）纤维素：长度仅为2~20微米的短纤维，分天然纤维和微晶纤维两种 形式，也可加粘合剂、一般用于亲水性物质的分离，如羟基化物等，但缺 点为不能用浓硫酸等腐蚀性溶剂进行显色。 （5）聚酰胺：这是一种使用广泛的有机吸附剂，多用于分离酚类化合物， 样品容量大，但粘结能力差，可加入纤维素或淀粉作粘结剂。 （6）烧结薄层板：这是一种多次使用的薄层板，是由200~300目石英或玻 璃粉，与200~300目硅胶或氧化铝按1：25重量混合，用乙醇调成浆料，涂 在玻璃板上。0.25~0.3毫米厚，然后在700~780℃高温下烧结，即成烧结板。 烧结板用一次后可用乙醇或其它有机溶剂洗涤，最后用水洗干净后烘干再 继续使用。

薄层色谱法

薄层色谱法

薄层色谱法薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。

1.仪器与材料（1）薄层板市售薄层板市售薄层板分普通薄层板和高效薄层板，如硅胶薄层板、硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄膜等。

自制薄层板在保证色谱质量的前提下，如需对薄层板进行特别处理和化学改性，以适应供试品分离的要求时，也可用实验室自制的薄层板。

最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254、微晶纤维素等，其颗粒大小，一般要求粒径为10～40μm，加水或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.2%~0.5%）适量调成糊状，均匀涂布于玻板上。

使用涂布器涂布应能使固定相在玻板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。

玻板应光滑、平整，洗净后不附水珠。

（2）点样器一般采用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。

（3）展开容器上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或有双槽展开缸，展开时须能密闭，水平展开用专用的水平展开缸。

（4）显色装置喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出，浸渍显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。

（5）检视装置为装有可见光、254nm及365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用，暗箱内光源应有足够的光照度。

（6）薄层色谱扫描仪系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。

2.操作方法(1) 薄层板制备市售薄层板临用前一般应在110℃活化30分钟。

聚酰胺薄膜不需活化。

铝基片薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得有破损。

如在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗，110℃活化，置干燥器中备用。

经典色谱法分析技术—薄层色谱法(分析化学课件)

经典色谱法分析技术—薄层色谱法(分析化学课件)

小
极性
大
薄层色谱固定相和流动相选择
2. 流动相展开剂的选择要求
薄层色谱分离中一般要求各斑点的Rf值在0.2～0.8之间，Rf值之 间应相差0.05以上.
3. 流动相展开剂的选择方法
如果单一展开剂分离效果不好，可用两种或两种以上的单一溶剂按 照一定比例混合而成的溶剂展开,可以达到较好的分离效果.
薄层色谱固定相和流动相选择 被测组分、吸附剂和展开剂的选择原则
常用溶剂的极性顺序为：
常用吸附剂的极性顺序为：
增
增
大
大
薄层色谱固定相和流动相选择
多糖、蛋白质等大分子、生物碱盐
极 性
苷类（皂苷、黄酮苷、蒽醌苷）
渐 黄酮、蒽醌等苷元、有机酸
小
香豆素、萜类、挥发油等亲脂性成分
烷烃＜烯烃
＜二甲胺＜酯类＜酮
＜醚＜硝基化合物
类＜醛类＜硫醇＜胺 类
＜酰胺类＜醇 类＜酚类＜羧 酸类
分离原理
吸附薄层色谱分离原理
展开（分离）
分离过程：
制板→点样→展开→显色→定性定量分析
固定相--吸附剂
薄层色谱的固定相所用的吸附剂
流动相---展开剂
薄板的底端浸入到适当的流动相溶剂
吸附薄层色谱分离原理
薄 层 色 谱
点样
展开剂
吸附薄层色谱分离原理
分离原理：
展开剂在毛细管的 浸润作用下，带着 各组分沿着薄板向
薄层色谱固定相和流动相的选择
薄层色谱固定相和流动相选择
一、固定相（吸附剂）的选择
1. 选择原则 根据被分离组分的极性选择吸附剂：
被分离组分的极性强——弱极性吸附剂； 被分离组分的极性弱——强极性吸附剂；
薄层色谱固定相和流动相选择

薄层色谱法

薄层色谱法
薄层色谱法
课程：分析制样技术
薄层色谱法
一、薄层色谱法概念及原理
• 薄层色谱法（常用TLC表示）又称薄层层析，属于固－
液吸附色谱。 • 样品在薄层板上的吸附剂（固定相）和溶剂（移动相）之
间进行分离。由于吸附剂对不同组分的吸附能力的不同， 使它们在薄层上的移动速度也有差别，从而得以分离，显 然试样中吸附能力最弱的组分在薄层中移动距离最大，而 试样中吸附能力最强的组分在薄层中移动距离最小。
四、注意事项
1）展开时，层析缸中的有机溶剂蒸气必须达到饱和，否则，Rf值将不能重现。
2）在薄层用的吸附剂中，硅胶适用于酸性和中性组分的分离，碱性组分与硅胶有相互 作用，不易展开，或发生拖尾现象，不好分离；氧化铝适用于碱性好中性组分的分离 ，但不适用于酸性组分的分离。
3）如果单一展开剂效果不好，可以用混合溶剂，通过改变溶剂组分和比例来调整展开 剂的极性，从而达到分离效果的目的。
二、吸附剂与展开剂的选择
（2）展开剂：
选择展开剂时，主要考虑极性，其洗脱能力与极性成正比 。分离极性大的化合物赢选用极性展开剂，而分离极性小 或非极性的化合物应选用极性小的展开剂。 单一溶剂极性大小顺序如下： 酸>吡啶>甲醇>乙醇>正丙醇>丙酮>乙酸乙酯>乙醚>氯 仿>二氯甲烷>甲苯>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>石 油醚
① 蒸气显色法：利用样品组分与单质碘、液溴、浓氨水等物质的蒸气作用
而显色。将上述易挥发物质放于密闭容器中，再将展开剂已完全挥发的薄层板 放入则显色。
② 显色剂显色法：将一定浓度的显色剂溶液均匀喷洒在薄层上，是样品组
分显色。
③ 紫外显色法：某些化合物在紫外光照射下回发出荧光，可将展开剂挥发

薄层色谱法的原理及应用

薄层色谱法的原理及应用

薄层色谱法的原理及应用
1. 薄层色谱法的概述
•什么是薄层色谱法？
•薄层色谱法的特点
•薄层色谱法的分类
•薄层色谱法的基本步骤
2. 薄层色谱法的原理
•色谱基质的选择
•色谱分离机理
•薄层层析板的制备与选择
•纯化和检测方法
3. 薄层色谱法的应用
•生物学领域的应用
•化学分析中的应用
•药物研发与质量控制中的应用
•食品行业的应用
•环境监测中的应用
•其他相关领域的应用
4. 薄层色谱法的优缺点
•优点：高效、快速、灵敏度高、易操作、耗费样品少等
•缺点：分析物种类受限、分离能力较弱、仪器设备复杂等
5. 薄层色谱法的发展趋势
•技术改进与创新
•自动化与智能化发展
•应用领域的拓展
结语
通过本文，我们了解了薄层色谱法的原理和应用，它是一种重要的分析方法，
被广泛应用于各个领域，如生物学、化学、药物研发、食品行业和环境监测等。

虽然薄层色谱法具有一些局限性，但随着技术的改进和发展，它的优势将进一步发挥，应用领域也会不断拓展。

薄层色谱法的发展趋势将朝着更加高效、智能化和自动化的方向前进。

薄层色谱法

薄层色谱法


薄层色谱法具有分离分析双重功能，在中 药的定性鉴别中得到广泛的应用，成为中 药鉴别的重要方法和鲜明特色。 中国药典大多数品种最常采用的是以硅胶 板为固定相的正相色谱，少数使用聚酰胺 薄层色谱法和氧化铝色谱法。
薄层色谱与高效液相色谱的区别


1、固定相和流动相 薄层色谱（TLC）流动相流动靠毛细作用力， 流动相选择较小受限制。HPLC是在封闭的 系统内，流动相流量靠泵输送，溶剂选择 受检测器的限制。 2、色谱分离 TLC可同时分离多个样品，并可采用相同或 不同溶剂进行同向或双相多次展开。
对照品与对照药材
ห้องสมุดไป่ตู้

1、对照品对照 用已知中药某一种有效成分或特征性成分对照品制 成对照品溶液，与样品在同一条件下层析，比较相 同位置有无同一颜色（或荧光）的斑点，来检测是 否含有某原料药材。可设置一种或者多种对照品。 2、对照药材对照 一般在缺乏对照品的情况下使用 3、对照品和对照药材同时对照（“双对照”） 为了准确检验中药材的真实性，有时仅用对照品无 法鉴别出来，这时可增加对照药材作为对照。


3、对污染物抗受力强 TLC——颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸 附物质均无影响。 HPLC——颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆 吸附物质均有大的影响。

TLC常用于定性分析，HPLC常用于 定量分析。即，TLC用于鉴别药材， HPLC用于含量测定。
薄层色谱法定性的基础

基于相同物质在同一色谱条件下，表现出 相同的色谱行为这一基本规律，在同一块 薄层板上点加供试品和对照品（或对照药 材），在相同条件下展开，显示检出色谱 斑点后，将所得供试品与对照品（对照药 材）的色谱图进行对比分析，从而对药材 进行定性鉴别。

薄层色谱法概述


展开方式
多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以75 为最佳。展开距离一般为10-15cm。
多次展开——一次展开未达满意分离时，可将薄层板干燥后再次用同一种溶剂展开，可重复多次，直到混合物分离为止。
分步展开——混合物性质差别较大时，一种流动相不能有效分离时，可采用不同溶剂依次展开不同距离。
02
01
薄层板涂铺要求：均匀、平整、无气泡引起的凹坑和龟裂。例： 硅胶板（粒度10 ～40um） 硅胶G——将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨均匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水(一般为1份固定相与3份水)，迅速研磨均匀，立即涂铺。 硅胶或硅胶G ——以CMC为黏合剂。配制0.2% ～ 0.7%CMC水溶液,放置过夜,使悬浮的纤维沉降,取上层用来配制吸附剂匀浆。
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点样
01
添加标题
要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。
添加标题
手工点样工具：定容玻璃毛细管（1 –5ul），微量注射器。
04
添加标题
采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。
02
03
添加标题
点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差，以最小检测量的几倍～几十倍为宜。
薄层色谱参数
原点
Lr
L。
W
参比
样品
前沿
保留参数（Rf值） 用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，通常称作比移值，用Rf表示。 Rf=Ls/L。， S R 原点
同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。 在同样溶剂的重复n次的多次展开后的比移值(Rf)n=1-(1-Rf)n 。
注意：
Rf测量中一个重要的误差来源是难以确定溶剂前沿的位置，因此，引入相对比移值（Rx）。

薄层色谱法


选择：分离亲脂性化合物，选择氧化铝，硅 胶，乙酰化纤维素以及聚酰胺 分离亲水性化合物，选择纤维素和离 子交换纤维素及硅藻土。 一般，被分离组的极性强，选择吸附 能力弱的吸附剂；反之，选吸附能力较强 者。
种类： • 硅胶—为使用最广泛的薄层材料 • 氧化铝—有碱性、中性、酸性 • 硅藻土—为化学中性吸附剂 • 纤维素—天然多糖类 • 聚酰胺—为特殊类型有机薄层材料，对能形 成氢键的物质有特别的选择性
什么是TLC？
薄层色谱法（thin layer chromatography,TLC） 是将适宜的固定相喷涂（或喷雾）于玻璃板， 塑料或铝基片上，成一均匀薄层。干燥后 进行点样，展开，斑点定位；或与适宜的 对照物随行对照比较，或用薄层扫描仪扫 描，用于药物或其他化合物的分离，鉴别， 检查或含量测定等。
– 通过板上光谱图定性
• 直接测定薄层板上斑点的紫外或可见吸收光 谱图，与平行点加的标准斑点的图谱对照。 • 可建立标准条件下的化合物的光谱图库，用 计算机检索定性。
– 与其他技术连用
• TLC-付里叶变换IR联用 • TLC-MS联用
• 定量方法
– 间接定量——将薄层分离后物质斑点定量地洗 脱下来，再对洗脱液定量。 • 分光光度法、HPLC法、GC法、质谱法
• TLC是一种简单、快速的色谱技术。TLC法特 别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变 化的物质的分离。 • 薄层色谱不需要特殊设备，操作简单，试样 和展开剂用量少，展开速度快。 • TLC经常被用于探索柱色谱分离条件和监测 柱色谱过程 。 • 在进行化学反应时，可利用薄层色谱观察原 料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。
• 选择：“相似相溶”原则 同吸附柱色谱 极性强的溶剂洗脱能力强 常用溶剂的极性强弱顺序： 水＞酸＞吡啶＞甲醇＞乙醇＞正丙醇 ＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞二氯甲 烷＞甲苯＞苯＞三氯乙烷＞四氯化碳>环己 烷>石油醚。

薄层色谱法


3
薄层色谱法
（thin layer chromatography; TLC) （一）概述 1.背景
1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一 种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色 谱法”一书，推动了这一技术的发展。 因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高， 结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。 70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后 发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪 器化，并实现了计算机化。
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展开时的注意事项

产生原因：展开槽未被展开剂饱和。尤其是 使用混合溶剂时，极性较弱和沸点较低的溶 剂，在薄层边缘容易挥发，使边缘部分的展 开剂中极性溶剂的比例增大，Rf相对增大。 同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf 值比边缘的Rf值小，即边缘效应。
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展开时的注意事项
消除办法：若在展开前先将展开槽与薄层
43
六味地黄丸中牡丹皮的薄层图谱
1.丹皮酚； 2～5.六味地黄丸
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薄层色谱法（TLC)应用实例
二、醋酸可的松中其他甾体的检查
取本品，加氯仿-甲醇(9︰1) 制成每1ml 中含10mg的溶 液，作为供试品溶液；精密量取适量醋酸可的松，加氯仿甲醇(9︰1) 稀释成每1ml 中含0.10mg的溶液，作为对照溶液。 照薄层色谱法（附录Ⅴ B）试验，吸取上述两种溶液各5μl， 分别点于同一硅胶Ｇ薄层板上，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水 (385︰60︰15︰2) 为展开剂，展开后，晾干，在105 ℃干燥 10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视。供试品 溶液如显杂质斑点，不得多于3 个，其颜色与对照溶液的主 斑点比较，不得更深。
⑵点样
将试样用最少量展开剂溶解，用毛细 管蘸取试样溶液，在薄层板上点样。在样 点上轻轻画出一条平行于玻璃板底边的细 线。薄层色谱板载样量有限，勿使点样量 过多。

薄层色谱法


4.点样过程 确定点样位置
吸取点样溶液
点样。
a.用铅笔在距薄层底边1.5-2.0cm处画一条起始线，在起始线上作 好记号作为点样位置，每个位置之间的距离为1.0-1.5cm； b.用点样设备吸取一定量的溶液； c.于点样位置上的吸附剂轻轻接触，点样设备内的溶液就会自动被 其吸附，形成直径最好为2-4mm的圆点或宽度为5-10mm的条带，完 成一次点样。 注意：若需要在同一个位置多次点样，则每点一次，应带溶剂挥干 后再点下一次，避免斑点扩散；当一块薄层板上需点几个样品时， 点样设备不能混用。
薄层板上的斑点位置确定之后，可对物质进 行定性鉴别、杂质检查和含量测定。
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第三节 在药物分析中的应用
主要用于中药、化学药物、生物制品等的定 性鉴别、杂质检查、含量测定。
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一、在鉴别方面的应用
通常采用对照物比较法进行定性鉴别。在保证 各斑点分离度达到标准的前提下，如果样品的 Rf与对照物的Rf相同，则可认为该组分与对照 物为同一物质。 为了结果的准确可靠，应采用多种不同的展开 系统进行展开，如果所得到的Rf都与对照品一 致，则可认定两者是同一物质。
43
锯齿扫描
(1)单波长扫描：使用一种波长的光线对薄 层进行扫描。 (2)双波长扫描：是采用两种不同波长的光 束先后扫描所要测定的斑点，并记录下此两 波长吸光度之差，可以消除薄层背景吸收的 干扰。
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化合物斑点的吸收光谱
单波长与双波长扫描曲线的比较
6.定量方法
2.仪器：光源、单色器、薄层板台、检测器、色谱工作站 3.测量方法：根据对光测定方式的不同，可分为三种
透射法：测量反射光的强度 反射法：测量透射光的强度
L 光源；MC 单色 器；P 薄层板； S 斑点； PD 光电 检测器
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l点样器:
一般采用微升毛细管（定量点样毛细管： 0.5ul、1.0ul、2.0ul、5.0ul、10ul等）、微升注射
器或半自动、全自动点样器材，手动点样时建议
采用微量毛细管。
l展开缸
应用适合薄层板大 小的薄层色谱专用展开 缸（箱），展开缸有水 平式和直立式两种类型。 日常用的最多的是直立 式展开缸。它又分平底 展开缸或双槽展开缸。 双槽展开缸具有节省溶 剂、便于预平衡、可控 制展开缸内相对湿度等 有点，故此常推荐使用。 水平展开用专用的水平 展开缸。
Ø 限度检查 采用定量配制的对照品对照或对照品稀释 对照。供试品溶液色谱中待检查的斑点应与相应的 对照品溶液或系列对照品溶液的相应斑点比较，颜 色（或荧光）不得更深；或照薄层色谱扫描法操作， 峰面积不得大于对照品的峰面积值。必要时应规定 检查的斑点数和限量值。
Ø含量测定 照薄层色谱扫描法，测定供试品中相应成分 的含量。
高效薄层板（HPTCL）所使用的固定相较普通薄层 板平均粒度小，颗粒分布范围窄，因此在相对短的 展开距离中可以达到更好的分离效果。
传统薄层板与高效薄层板的比较
平均粒度（um） 颗粒分布（um） 点样量（ul） 展距(cm) 分离时间(min) 检测限：可见光（ng）
荧光（ng） 薄层厚度（mm）
TCL 10-40 宽 大 10-15 30-200 100-1000 1-ห้องสมุดไป่ตู้00 0.2-0.3
l 定义：薄层色谱法，或称薄层层析(thin—layer chromatography），系将适宜的固定相涂布于玻 璃板、塑料或铝基片上，成一均匀的薄层；将供 试品与相应的对照物点于薄层板的一端，在展开 容器内用适宜的溶剂（展开剂）展开，使供试品 中所含成分分离，采用适合的显色剂或显色方法 显色，将供试品色谱与对照物色谱比较，或采用 薄层扫描仪扫描，以进行鉴别、检查，或含量测 定的方法。
HPTCL 5-10 窄 小 5-8 3-20 10-100 0.1-10 0.1-0.2
4、按来源分为：
Ø 市售薄层板
青岛海洋化工（玻璃）
天津斯利达（铝箔）
进口薄层板（Merck等） Ø 不同品牌的薄层板，所用的硅胶
粒度、粘合剂不同，薄层行为和薄层
色谱效果存在差异，因此实验时必须明确品牌。
Ø 自制薄层板
六、显色与检测
色谱斑点本身有颜色者，可直接在日光下观察可见光谱；斑点在 紫外光激发下可以发射荧光者，可直接在365nm紫外灯下观察荧光色 谱；对于可见光下无色，但在紫外光下有吸收的成分可用带有荧光剂 的硅胶板（如硅胶GF254板），在254nm紫外光灯下观察荧光板面上的 荧光猝灭物质形成的色谱。
需要加试剂方能显色或发射荧光者，需要将试剂均匀喷洒于薄层 板面，直接观察或加热显色后观察。
Ø 蒸气熏蒸显色：可用双
槽展开缸或适宜大小的干燥
器代替，如碘蒸汽。
l检视装置
为装有可见光、 254nm（荧光萃灭）及 365nm紫外光光源及相 应的滤光片的暗箱， 可附加摄像设备供拍 摄图像用，暗箱内光 源应有足够的光照度。
l薄层色谱扫描仪
系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点， 或经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将 扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量 的分析仪器。
《中国药典》2015版一部点样要求
TLC
HPTLC
距底mm
10～15
点间距mm
以互不干扰为宜 8
点直径mm
≤4
条带长mm
5 ～10
展开剂与原点间距mm 5
展距cm
8-15
8 ～10
以互不干扰为宜 5
≤2 4～8
5 5-8
以点样方式的不同可分为接触式点样和喷雾点 样两种 Ø接触式点样 将吸有样品溶液的毛细管或针头与 薄层板表面接触，从而使样品在薄层板上形成圆 点状的点。多采用毛细管微量注射器手动点样， 有的仪器也可以进行接触式点样。 Ø喷雾点样 点样针针杆匀速向下推，针头部形成 小液滴被喷头喷出的气流垂落在薄层板上，机械 推动薄层板匀速摆动，则形成均匀的条状原点。 必须采用仪器进行。
用浸渍法，具有板面显色均匀的特点，但有的样品经试剂浸渍后， 斑点容易被浸润而扩散或拖尾。
加热显色需注意加热时间和温度，如含羟甲基纤维素钠的手工自 制薄层板代替预制板，注意加热温度过高或加热时间过长，容易引起 板面焦化，如用硫酸等显色剂更易造成板面的炭化而影响显色效果， 需要特别注意。有的成分加试剂（如挥发油或甾醇类经香草醛硫酸、 硫酸醋酐等）显色后，加热温度高低和时间长短不同或放置时间不同， 斑点的显色可能随时间而有所改变。
l显色装置
薄层色谱法可针对不同的样品采用不同的显色 方法和显色剂进行显色，从而可以专门针对某一 化合物进行检视，或对紫外光和可见光下无吸收 的化合物进行检视。极大的提高了薄层检视的专 属性与灵敏性。这是薄层色谱法灵活性的一个集 中体现。即同一薄层板可生成可见光、紫外光谱、 荧光光谱和荧光淬灭光谱。
Ø 检测灵敏度 用于限量检查时，采用供试品溶液和对照品溶液与 稀释若干倍的对照品溶液在规定的色谱条件下，于同一薄层板 上点样、展开、检视，后者应显清晰的斑点。
Ø 分离度 用于鉴别时，对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑 点，应显示两个清晰分离的斑点。用于限量检查和含量测定时， 要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离度（R）的计 算公式为：R=2（d2-d1）/(W1+W2) 式中：d2为相邻两峰中后一峰与原点的距离； d1为相邻两峰中前一峰与原点的距离； W1及W2为相邻两峰各自的峰宽。 除另有规定外，分离度应大于1.0。
在保证色谱质量的前提下，如需对薄层板进行特别处理 和化学改性，以适应供试品分离的要求时，也可用实验室自制 的薄层板。最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅 胶HF254、微晶纤维素等，其颗粒大小，一般要求粒径为10～ 40μm。
(自制薄层板由于操作粗放，硅胶质量不高和手工操作个体差 异大致使色谱质量不高，分离度、重现性均难以达到满意效果，所 以一般只针对需特别处理和化学改性的薄层板。)
Ø 供试品溶液溶剂残留：若供试品溶液溶剂残留， 会改变展开的选择性，特别是供试品溶液的溶剂 极性与展开的溶剂极性相差较大时更为明显；再 者，亲水溶剂残留在原点吸收大气中的水分（特 别是高湿环境）对色谱质量的影响也不可低估。
四、点样操作
l 点样前薄层板准备
Ø薄层板表面应均匀、平整、光滑，无麻点、无气 泡、无破损及污染。铝基片薄层板可根据需要剪 裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得 有破损。
Ø临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不 需活化。
Ø如在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用异 丙醇、二氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂（8:2） 在展开缸中上行展开预洗，取出，晾干，110℃活 化，置干燥器中备用。（注意标记方向）
Ø展开前如需溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加入 适量的展开剂，密闭，保持15～30分钟，待溶剂蒸 气平衡后，应迅速放入点有样品的薄层板，立即 密闭，展开。 如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，则 须在展开缸的内侧放置与展开缸内径同样大小的 滤纸，密闭一定时间，使达到饱和再如法展开。
Ø展开用的溶剂需要使用分析纯并要求临用前配制， 不可多次反复使用。展开剂如需分层，则放置分 层后按要求分取上层或下层，备用。
鉴别时可用供试品的主板点与
对照品溶液主板点的比移值进
行比较，或用比移值来说明主
斑点或杂质斑点的位置，除另
有规定外，比移值（Rf）应在 0.2-0.8之间（含量测定时比移 值（Rf）应在0.3-0.7之间）。
九、测定法
Ø鉴别 取适宜浓度的对照溶液与供试品溶液，在同一薄 层板上点样、展开与检视，供试品溶液所显主斑点的 颜色（或荧光）和位置应与对照溶液的斑点一致。
主要的显色方法有：喷雾显色、浸渍显色与蒸 气熏蒸显色。
三氯化铝：黄酮类专属显色剂
碘化铋钾：生物碱专属显色剂
硫酸：许多成分激发荧光的通用试剂
Ø 喷雾显色应：使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾 器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷 出。
Ø 浸渍显色：使用浸渍槽也可用适宜的展开 缸代用，使用时，将展开的薄层板平稳垂直的 放入浸渍槽中一至数秒后取出，擦去薄层扳背 面残存的试剂，显色后的图像供分析用（需要 时可以加热）。
三、仪器和器材
薄层板 点样器 展开缸 显色装置 检视装置 扫描仪
薄层板
1、吸附材料不同分为：硅胶板薄层板、聚酰胺薄层
板
硅胶薄层板是目前应用最广泛的薄层板，最常用的 固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254
2、薄层板涂布的背材不同分为：玻璃板、铝箔板、
聚酰胺薄膜板
3、吸附材料的粒径分为：普通板与高效板
l 特点:高效、快捷、方便、直观、经济。
l 分型： ü 薄层吸附层析（吸附剂） ü 薄层分层层析（纤维素） ü 薄层离子交换层析（离子交换剂） ü 薄层凝胶层析（分子筛凝胶） Ø 一般中药分析中应用较多的是以吸附剂为固定相的
薄层吸附层析
Ø薄层吸附层析法：
它是利用各成分对同一吸附剂吸附能力不 同，使在移动相（展开剂）流过固定相（吸附 剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再 吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离 的目的。
喷雾点样的优点：1、点样过程中，点样器不与薄层板接 触，防止薄层板物理损伤；2样品密集，有利于展开后检视； 3、减少样品扩散，样品斑点窄，展开后分离度提高；4、 自动化程度高，样品溶液不易在针壁上残留。
五、展开
将点样后的薄层板放入加有展开剂的展缸中，密闭， 展开，薄层板浸入展开剂的深度一般要求溶剂的液面距原 点约5mm，密闭展开，展开至规定规定的展距后，立即取 出薄层板，晾干，以备检测。多数品种展距为7～9cm,必 要时可用长度为15或20cm的板，展距可适当延长至12 ～ 14cm。高效薄层板上展开5～8cm。 Ø 薄层板展开方式主要有：上行展开、下行展开、水平展开 和环形展开，必要时也可进行二次展开或双向展开。