2018年淋巴细胞分离

淋巴细胞分离的原理
淋巴细胞分离的原理主要是利用淋巴细胞在密度梯度离心中的沉降速率差异进行分离。

淋巴细胞是一种低密度细胞，其密度约为1.06 g/ml，而其他血液细胞如红细胞、粒细胞等的密度
均大于1.06 g/ml，因此可以通过离心来分离淋巴细胞。

具体操作步骤如下：
1. 采集血液样品，一般可采用外周血样品，例如静脉采血。

2. 转移血液样品至离心管中，离心管中需要加入离心介质，常用的有Ficoll或Percoll等。

3. 轻轻混合血液与离心介质，以确保均匀混合。

4. 放入离心机，进行离心。

离心过程中，血液样品会在离心介质形成的密度梯度中逐渐分层。

5. 离心结束后，离心管中会分为不同层次的组分。

上层为清澈的血浆层，中间为若干个白色或黄色的细胞层，其中最上面一个细胞层即为淋巴细胞层。

6. 使用移液器将淋巴细胞层吸取出来，转移至另一个离心管中。

7. 加入适当的洗涤缓冲液，如PBS，进行洗涤。

洗涤缓冲液
的作用是去除离心介质残留和其他杂质。

8. 离心再次沉淀淋巴细胞，并倒掉上清液。

9. 加入适量的培养液，使淋巴细胞得到适当的营养和环境，以维持其存活和生长。

通过以上步骤，可以将淋巴细胞从血液中分离出来，并得到较为纯净的淋巴细胞样本，便于后续实验和研究的进行。

淋巴细胞的分离技术（一）材料与试剂1．淋巴细胞分层液有两种：（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名Ficoll，分子量400 000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。

应用时，用蒸馏水配制9％溶液。

泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici)，商品名Vrografin，结构式为3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。

含量为60％或75％，每安瓶为20ml装，常用于人的脏器造影。

应用时，取60％泛影葡胺原液20ml，加双蒸馏水15.38ml，即为33.9％泛影葡胺。

1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制：9％聚蔗糖液 24份33.9％泛影葡胺液 10份混合即可。

必要时，可测比重。

需要备用，可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min，4℃保存。

一般可保存3个月。

如要配制不同比例的分层液，可按下列公式计算：式中dm为分层液的比重，d1和d2分别为9％聚蔗糖和33.9％泛影葡胺的比重，V1和V2分别为它们的体积。

如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分层液，则9％的聚蔗糖和33.9％的泛影葡胺的比例应为100︰46.3。

（2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液34％泛影葡胺液 10份60％右旋糖酐液 12.5份混合，即为比重1.07～1.09的分层液。

分装于棕色瓶中，4℃冰箱保存备用。

2． 3％的明胶液称取明胶3g，溶于0.9％的灭菌生理盐水，终体积100ml，114.3℃高压灭菌10min，冷却后4℃冰箱保存，临用时37℃预热10min。

3．Hank’s液。

（二）操作方法1．取抗凝血，自然沉降，如是马属动物的血液，可直接直立试管架上，让其自然沉降1h，取上层血浆。

如是牛、羊血液，由于其血沉速度非常慢，可加等量3％明胶液，混匀后让其自然沉降，1h后取上层血浆。

2．2 000r/min离心10min，弃上清。

淋巴细胞分离方法
淋巴细胞是咱们身体免疫系统里超级重要的小战士呢。

那怎么把它们从其他细胞里分离出来呢？这可有不少有趣的办法哦。

有一种方法叫密度梯度离心法。

想象一下，就像把不同重量的东西放在一个超级特别的旋转机器里。

咱们把血液或者含有淋巴细胞的组织液放在一种有特殊密度的溶液里，然后让这个混合液高速旋转起来。

淋巴细胞就像是一群小机灵鬼，它们会根据自己的密度，跑到溶液里特定的位置。

其他细胞呢，就被分离开啦。

就好像是在一场超级有趣的细胞大派对里，淋巴细胞们被安排到了专属的小角落。

还有一种叫免疫磁珠分离法。

这个方法可酷啦。

咱们给淋巴细胞贴上一种特殊的小标签，这个小标签就像是一个小磁铁。

然后把这个带有标签的细胞混合液放在一个有磁场的地方。

那些贴了标签的淋巴细胞就会被磁场吸引住，就像小铁屑被磁铁吸住一样。

这样就能轻松地把淋巴细胞和其他细胞分开啦。

这就像是给淋巴细胞们发了个特别的通行证，只有它们能被磁场这个小保安给挑出来。

另外，贴壁黏附法也很有意思哦。

淋巴细胞不太喜欢黏附在容器壁上，但是有些细胞就特别爱黏附。

咱们把细胞混合液放在一个容器里，过一会儿，那些爱黏附的细胞就像小懒虫一样趴在容器壁上了，而淋巴细胞还在溶液里自由自在地游着。

这时候把溶液取出来，就得到比较纯的淋巴细胞啦。

就好像是在一个细胞宿舍里，那些黏附细胞是赖床的，淋巴细胞是早起活动的，咱们把早起活动的给挑出来就好啦。

肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术肝脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取肝脏。

2．将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨，转至15ml离心管中。

3．650rpm×1min离心，将上层液体转至15ml离心管中。

4．1500prm×5min离心后弃上清，重复洗两次。

5．6ml 40% Percoll 溶液重悬沉淀，将3ml 70% Percoll溶液加于其底层，2000rpm×20min，升6降2。

6．吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后2000rpm×5min 离心收集细胞。

7．1ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

脾脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死，摘取脾脏。

2．用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．8ml PBS重悬细胞沉淀，在底层加入3ml Ficoll , 2000rpm×20min，升6降2。

4．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。

5．6-8 ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

胸腺淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取胸腺。

2．将胸腺放在200目钢丝网上研磨，将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．6-8ml PBS 重悬细胞沉淀，再次通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

淋巴结淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取淋巴结。

2．用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml 离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

全血淋巴细胞分离的原因你知道吗，血液里的小伙伴可不少，它们不仅帮我们抵抗疾病，还参与很多我们平常根本意识不到的“幕后工作”。

说到血液，大家通常想的都是红细胞、白细胞这些“老朋友”。

但今天，我们不谈这些“常客”，咱们聊聊一个有点神秘的小角色——淋巴细胞。

淋巴细胞就像是血液中的侦探，常常在你不注意的时候默默地守护着身体里的各个角落。

那到底是什么原因让我们去单独分离这些淋巴细胞呢？为什么要“特别照顾”它们呢？好啦，让我们一起揭开这个谜底！你想啊，我们的身体就像是一个巨大的工厂，里面有成千上万的细胞在“加班加点”工作。

白细胞是守卫，红细胞是运输工，淋巴细胞则是这座工厂里的“秘密特工”。

它们不只帮你抵抗外来的病毒和细菌，还要和你身体里的坏细胞进行“较量”。

所以，淋巴细胞其实是身体免疫系统的一个重要组成部分，离了它们，咱们的免疫系统就成了“空壳子”，啥事都干不了。

分离淋巴细胞，听上去有点复杂，其实也就是把血液里的淋巴细胞挑出来，分开，留着后头做一些分析。

哎呀，难怪一些科研工作者老说：“这些小家伙，真是‘宝藏’。

”你可能会问，为什么要分离呢？不就是在血液里能找到它们吗？那不就是“吃力不讨好”吗？说得对，问题就在这里。

淋巴细胞虽然是免疫系统中的“精英部队”，但是它们的数量不是很多，血液中的红细胞和血小板才是“主力军”。

所以，如果咱们要研究这些淋巴细胞，必须得把它们从“人海中”挑出来，才能更好地进行分析。

这种分离方法很有趣，就像是挑选好吃的水果一样。

科研人员通过一些特殊的方法，把血液中的淋巴细胞挑出来，给它们做个“大体检”。

有的科学家会把它们放到显微镜下仔细观察，看它们是不是“身体健康”，有没有受到病毒侵袭。

有的研究还会进一步分析它们的功能，看看它们在抗病毒、抗癌等方面是否表现出色。

这就像是在找“超级英雄”，看看哪个能在危机时刻挺身而出，保护身体免受外界的侵害。

说到这里，你可能会想：“咱们平常能不能自己知道这些淋巴细胞的情况呢？”老实说，这个就像是想知道一个人每天都在做什么工作，我们是无法通过肉眼看得出来的。

1、淋巴细胞的来源：人淋巴细胞的方便来源是外周血分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。

根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。

分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。

2、密度梯度离心法：外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。

3、实验方法：1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2）2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）3、20℃，1500r/min，离心30min从上一次至下稀释的血浆、血小板PBMCFicoll红细胞、粒细胞4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。

5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min ，弃上清。

6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清。

7.适量的培养基重悬细胞，计数。

分离单个核细胞纯度为95%淋巴细胞约占90%～95%4、淋巴细胞高纯度化(一)红细胞的去除一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。

(二)血小板的去除将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。

在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。

（三）单核细胞和粒细胞的去除1．粘附去除法原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。

采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。

这是鄂征的《组织培养技术及其在医学研究中的应用》中关于分裂淋巴细胞的方法，可供参考。

1.概述：枸橼酸处理的全血，或加葡聚糖加速沉积去除红细胞的血浆，在Percoll-Paque分层液上分出致密层。

离心后，大多数淋巴细胞会积聚在Ficoll/Metrizoate(Ficoll/甲泛葡胺）和血浆之间。

2.方法：（1）枸橼酸或肝素抗凝血携入操作室或HOOD台面（2）用PBSA按1：1稀释，用9ml加入6mlPercoll-Paque分层液中进行分层，注入容量较大的、而且透明不带盖的离心管中，平衡（3）400×g离心15分钟（4）在不干扰交界面情况下，小心去除血浆/PBSA（5）用注射器或吸管吸出交界面液体（吸时最好用钝圆针头或吸管，而不要用尖的头吸（6）用20ml不含血清培养液稀释（7）从交界面来的稀释细胞悬浮，70g离心10分钟（8）去掉上清，重悬沉积物于2ml不含血清培养液中；如果需要去掉血清中因子，可用20ml无血清培养基反复漂洗、离心2～3次后，最后把沉积悬于2ml 不含血清培养基中（9）取少许细胞样品，台盼蓝染色，细胞计数器检测含有核的细胞数（10）接种入无血清或加血清培养基中培养注解：在第（3）步骤沉降中，淋巴细胞集中在杂有一些血小板和单核细胞的交界面上，可能也有一些粒性白细胞。

如欲获纯淋巴细胞，由于单核和粒性白血病喜欢贴壁，可采用贴壁法进行排除，如向悬液中置入无菌载物玻璃片，过一定时间，这些细胞便可附着其上，抽出玻璃片弃掉；或把悬液注入培养瓶或皿中，在镜下观察，过一定时间（10～30分钟），这些细胞如先贴附，而淋巴细胞尚处在悬浮状态下，把悬液倒入另瓶中即可。

当然也可应用更加复杂的方法如流式细胞仪等分离亦可所有的细胞培养都应该坚守无菌操作原则2.分层后的确有3层，准确说来是4层，最下面是红细胞，上面的一层不应该是稍微混浊的白色，应该也比较透明，这一层上面就是我们需要的薄细胞层，最上面是血清3.细节：a.淋巴细胞分离液要避光保存b.就您的试验看来，淋巴细胞分离液的问题可能是最主要的c.首先再离心管中加入淋巴细胞分离液，然后把标本缓慢加在淋巴细胞分离液表面上，一定要缓慢小心操作，切不可混匀d.所有操作都应在无菌环境进行e.把离心管放入离心机是也应小心，不要太大幅度的摇幌离心管，当然离心后拿出来也要小心就这么多了吧，这个操作是不是很难的，比较基本祝您好运了！补充两点:1.淋巴细胞分离液在使用前需从4度冷藏取出室温平衡30min.没有此步操作易导致分离失败.2.全血的抗凝一定要充分,不然就会很难出现漂亮的白膜层.即你的(紧接着是一层稍微混浊的白色大概有2CM)3.离心转数一般为2000转,25min.尝试改进下,应该很容易分离的.。

淋巴细胞的分离
1. 收集10ml全血,加入不含防腐剂的肝素(0.2ml肝素/10ml全血),无菌操作.
2. 肝素化血置于15ml离心管,加入1ml 6%葡聚糖,室温放置20~30min,沉降红细胞.沉降时间不宜过长,否则单核细胞将不再保留于富含白细胞的血浆中.
3. 从葡聚糖处理的血中小心收集红细胞上层富含白细胞的血浆.
4. 富含白细胞的血浆在室温下3000r/min离心8min,沉淀细胞.
5. 弃上清,细胞轻悬于1ml PBS中.
6. 室温下用无菌巴斯德吸管小心地将细胞悬液加在 5 ml
Ficoll-Hypaque上.此步操作技术熟练,才能保持血浆层和层之间界面清晰.
7. 低温下(4度)400g离心30min,离心后轻轻取出离心管,切记不要破坏管中得分层.
8. 淋巴细胞在血浆层和Ficoll-Hypaque层之间的白色混浊条带中,小心取出并贮存.
9. 5ml PBS洗1次细胞,室温下250 g 离心5 min,沉降细胞悬于3~5 ml 生长培养液中.
10. 全部细胞悬液转移至T-25组织培养瓶中,加促细胞分裂剂.母液由
不含血清的RPMI1640培养配制.。

分离淋巴细胞的方法一、淋巴细胞的重要性1.1 淋巴细胞就像咱们身体里的小卫士。

在免疫系统这个大部队里，淋巴细胞可是起着至关重要的作用呢。

它们能识别外来的病菌、病毒这些“坏蛋”，然后发动攻击，保卫咱们的健康。

要是没有淋巴细胞，咱们的身体就像一座没有士兵守卫的城池，各种疾病就会轻易地入侵。

1.2 淋巴细胞有不同的类型，像T淋巴细胞、B淋巴细胞等，每个类型都有自己独特的本事，就像一个团队里不同专长的成员，大家齐心协力，共同守护身体的安宁。

二、密度梯度离心法2.1 这密度梯度离心法啊，就像是给淋巴细胞安排了一场特殊的“分层旅行”。

咱们得先准备好一种特殊的溶液，这个溶液有不同的密度层次，就像不同楼层的房子一样。

2.2 把含有淋巴细胞的血液样本小心地放到这个溶液上面，然后让离心机转起来。

这一转啊，就像给它们施加了魔法一样。

不同的细胞因为密度不一样，就会在这个溶液里分层。

淋巴细胞就会聚集到特定的一层，咱们就可以把这一层取出来，这样就初步把淋巴细胞分离出来了。

这方法就像是从一堆混合的珠子里，通过特殊的筛子把特定的珠子挑出来一样。

三、磁珠分选法3.1 磁珠分选法有点像用“磁石”吸引淋巴细胞。

首先呢，咱们得给淋巴细胞贴上特殊的“标签”，这个“标签”是能和磁珠结合的物质。

就好比给淋巴细胞穿上了一件能被磁珠识别的特殊衣服。

3.2 然后把这些带有“标签”的细胞放到有磁珠的环境里。

那些和磁珠结合的淋巴细胞就像被磁石吸引的小铁块一样，被吸附到一起。

咱们就能把这些吸附着淋巴细胞的磁珠分离出来，再把淋巴细胞从磁珠上弄下来，这样淋巴细胞就被成功分离了。

这就像是从一群小伙伴里，通过一个特殊的信号把特定的小伙伴召集到一起。

四、流式细胞术4.1 流式细胞术可是个比较“高大上”的方法。

想象一下，淋巴细胞就像一群在河流里游动的小鱼。

咱们有一个特殊的通道，就像一个检测站。

4.2 当淋巴细胞一个一个通过这个通道的时候，仪器就像一个超级侦探一样，能检测到每个淋巴细胞的各种特征，比如大小啊、表面的标志物啊等等。

淋巴细胞及其亚群的分离为研究免疫细胞的功能，常需高纯度的淋巴细胞或其亚群，分离方法介绍如下。

一、纯淋巴细胞群的采集通常利用单核细胞在37℃和Ca2+存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单个核细胞悬液中去除单核细胞的方法，藉以获得高纯度的淋巴细胞群。

（一）粘附贴壁法将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置1h左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。

因B细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。

（二）吸附柱过滤法将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。

此法简单易行，对细胞极少损害。

（三）磁铁吸引法利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加直径为3μm的羰基铁颗粒，置37℃温箱内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。

二、淋巴细胞亚群的分离分离相当纯化的淋巴细胞亚群是细胞免疫检验的基本技术。

其原则是根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。

凡根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法；而选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞是为阴性选择。

常用以下几种方法：（一）E花环沉降法本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液分离细胞。

浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。

（二）尼龙毛分离法本法利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B 细胞分开。

操作原则是取松散而经过处理的尼龙毛（聚酰胺纤维），均匀充填在内径5～6nm的聚乙烯塑料管（饮料管即可）内，经Hanks液浸透保温，将单个核细胞悬液加入柱内，放37温箱静置1～2h。

贵州中公教育1淋巴细胞分离的常用方法及原理检验学中的淋巴细胞分离的常用方法及原理是事业单位考试中重要的考点之一，是需要我们着重掌握的内容。

今天让我们一起来学习相关的知识点吧。

纯淋巴细胞群的采集是利用单核细胞在37℃和Ca2+存在时，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。

主要的方法有：①粘附贴壁法;②吸附柱过滤法;③磁铁吸引法。

一、粘附贴壁法将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置1h 左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非黏附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。

因B 细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B 细胞有所损失。

二、吸附柱过滤法将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中，凡有黏附能力的细胞绝大部分被吸附而黏滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。

此法简单易行，对细胞极少损害。

三、磁铁吸引法1.利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加直径为3µm 的羰基铁颗粒，置37℃温箱内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。

2.淋巴细胞亚群的分离原则：根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。

根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法，而选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞为阴性选择。

常用的方法包括：①E 花环沉降法;②尼龙毛柱分离法;③亲和板结合分离法;④磁性微球分离法及荧光激活细胞分离仪分离法。

关于淋巴细胞分离的常用方法及原理大家都理解了吗?接下来我们来看一道习题，巩固一下!【例题】下列哪一种不是淋巴细胞分离方法A.粘附贴壁法B.吸附柱过滤法C.磁铁吸引法D.凝胶电泳法【答案】D 。

1.试剂PBS，1640细胞培养液，淋巴细胞分离液； IL-2 ；OK T3，胎牛血清耗材已灭菌的枪头（大、中、小），75%酒精棉球，细胞培养瓶，胶头滴管，滴管，离心管，Ep管，封口膜，酒精灯，镊子，剪刀，记号笔，离心管架2外周单核淋巴细胞的分离与培养取健康人外周血（白膜），Ficoll-hapaque密度梯度离心法分离健康供血者PBMC。

具体方法如下：1)取正常人白膜30ml + PBS缓冲液 270ml（生理盐水），按1：10的比例稀释并混匀；2)在50ml 离心管加入15ml溶积的淋巴细胞分离液，将外周血与PBS缓冲液混合液25ml沿管壁轻缓加入离心管中；3)盖上离心管盖，封口膜封口，1800转/min，离心15min ；4)离心后液面分四层，从上至下分别为PBS缓冲液与血清，淋巴细胞，淋巴细胞分离液，红细胞；5)用胶头滴管吸走大部分的血清与缓冲液层的液体，用胶头滴管小心吸取淋巴细胞层，收集的淋巴细胞置于另一个新的50ml 离心管中；6)加入PBS至45ML刻度处，混匀，1200转/min，10min，弃上清；7)加入30ml PBS，混匀，1200转/min，10min，弃上清，再重悬；8)细胞计数，用1640培养基将淋巴细胞数调至107个/ml，待共培养作准备；单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数──────────×10４×n(稀释倍数)4 PBMC与肿瘤细胞共孵育1腺病毒介导特异性TCR Vβ7.1基因转染PBMC转染1）将刚分离得到的PBMC调节浓度为1×107cell/ml在10%血清的1640培养液中。

2）在6孔板各孔中加入100μl（1×106 cell）以上PBMC溶液。

3）以上6孔板中，每孔加入2.0 ML Ad TCR Vβ7.1 病毒液，加入终浓度为600 IU/ml的IL-2，10ng/ ml的 OK-T3。