四川大学基因工程原理ppt

__T__4____DNA连接酶和__E_·_c_o_l_i _DNA连接酶。 (4)反转录作用的模板是__m__R__N_A_，产物是__c_D_N__A_______。
若要在体外获得大量反转录产物，常采用__P_C__R___技术。
(5)基因工程中除质粒外，动_植___物__病__毒_和噬__菌__体__也可作为运载体。 (6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处 理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_未__处__理__的__大__肠__杆_。菌吸收
基考础点回探顾究
考点一 基因工程的原理及工具 [典例引领]
【典例】 (2012·课标，40)根据基因工程的有关知识，回答下 列问题。 (1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末 端类型有__平__末__端__和_黏__性__末__端_。 (2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下： AATT C……G G……CTTAA
分子杂交
抗原—抗体杂交 个体生物学水平
基考础点回探顾究
深度思考 基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便 于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是— G↓GATCC—；限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。
请据图分析： 切割目的基因时宜选择限制酶Ⅰ还是限制酶Ⅱ切割质粒呢？ 请说明理由。
基考础点回探顾究
解析 (1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的 基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细 胞、目的基因的检测与鉴定。(2)基因表达载体构建过程中， 需要用同种限制酶切割目的基因和载体，使它们产生相同的 黏性末端，再用DNA连接酶把这两个DNA片段连接起来。 (3)农杆菌转化法导入目的基因时，首先必须用Ca2＋处理土壤 农杆菌，使土壤农杆菌转变为感受态；然后将重组质粒和感 受态细胞在缓冲液中混合培养完成转化过程。

或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’ 端分别加上几个C或G，成为粘性末端。
接上人工接头
粘性末端
末端转移酶 CCC
CCC
基因工程的主要技术原理课件
基因工程%的mRNA时 所需要的克隆数目。
ln (1-p) N= ln (1- 1n)
蛋白B 转录激活domain
DNA binding domain 蛋白A
上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因
基因工程的主要技术原理课件
不能转录
（2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合
GAL4的DB domain与AD Domain也能 靠近，所以能启动效应基因的转录。
蛋白A
蛋白B
DNA binding domain 转录激活domain 激活转录
基因工程的主要技术原理课件
（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。
① 粘性末端直接连接 载体与外源DNA大片段的两个末端 都有相同的粘性末端。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端。
②人工接头法（adapter） 人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。
基因工程的主要技术原理课件
第二章 基因工程的主要技术原理
基因工程的主要技术原理课件
五 .分子杂交技术
1、Southern blot
原理和方法:
双链DNA
限制性内切酶 消化
电泳分离
放射自显影
检测
洗膜
杂交 转膜
NaOH变性
NaOH或高温变性
标记的探针
基因工程的主要技术原理课件
应用: ➢ 基因拷贝数检测; ➢基因筛选, 获取目的基因; ➢遗传疾病诊断; ➢转基因样品检测, 等…
（3）cDNA的合成

思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序列, 又可以怎样操作？
思考:能否根据氨基酸得序列获得人胰岛 素基因得碱基序列？
化 学 合 成 法
一、基因工程得基本操作步骤(技术物 材料
提取
DNA
限制酶
DNA 片段
DNA分子
导入
受体菌 构建 基因组群体单链 RNA (mRNA)
杂交 双链
单链 D
继续保持安静
一、基因工程得基本操作步骤(技术提取
DNA
限制酶
DNA 片段
形成重组 DNA分子
导入
录
因随受 体细胞 得繁殖
而复制
如果就是导入动物细胞
显微注射仪
用口径为1μm得DNA注射器,将大 量得目得基因片段注入到受精卵得 核内,然后把经过注射得受精卵移植 到另一只雌性动物得子宫内,使受精
。 卵发育为转基因动物
思考: 培育转基因动物时,受体 细胞能否采用动物体细 胞？试说明理由。一般 可以采用动物得什么细 胞？
思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序 列,又可以怎样操作？
思考4:如果我们知道目得基因两端得部分 碱基序列,还可以怎样操作？
u 聚合酶链式反应(PCR技术)
Ø变性:双链DNA解链成 为单链DNA
Ø复性(退火):部分引物 与模板得单链DNA得 特定互补部位相配 对与结合
Ø延伸:以目得基因为 模板,合成互补得新 DNA链
农杆菌得Ti质粒T-DNA:(可转移得DNA)
可转移(也可以将目得基因转移)至受体细胞 中,并且整合到受体细胞染色体得DNA上。
农杆菌转化法
3、 转基因植物
农杆菌转化法
重组 DNA 分子
农杆菌 侵染 植物体细胞 (整合到细胞

C、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
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⒉种类与命名：
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000 种限制性内切酶(限制酶)。
粘质沙雷氏杆菌 SmaⅠ（Serratia marcesens）
大肠杆菌 EcoRⅠ （Escherichia coli R）
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T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 起来，但效率较低
T4DNA连接酶
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③类型：
类型
来源
相同点
功能 差别
E·coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复 只能连接黏性末端
磷酸
T4DNA连接酶
T4噬菌体 二酯键
能连接黏性末端和 平末端(效率较低)
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寻根问底
• DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
科技探索之路
早 期 基 础 理 论
摩尔根证明基因在染色体上，并提出基
因的连锁互换定律。
11
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从
一种生物个体转移到另一种生物个体。
12
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。13
科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
A. 同种限制酶 B. 两种限制酶 C. 同种连接酶 D. 两种连接酶
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课堂练习
2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
（ D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
D、它是环状DNA
47C）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列

是
。
⑸由于转基因表达产物存在于山羊的乳汁中，检测其体内是
否出现进药行用抗蛋原白—，抗在体分杂子交水如平果上出的现检杂测交方带法，及表结明果奶是牛什中出现了 么? 抗原蛋白；不出现杂交带，表明奶牛中未出现抗原蛋白
。 ⑹要确定目的让的害基虫因吞（食抗棉虫花基叶因，）观导察入害棉虫花是细否胞具后有，抗是虫否性能状
一、 目的基因的获得
1、目的基因：
在基因操作中使用的外源基因。它是编 码蛋白质的结构基因，如胰岛素基因、 干扰素基因。
2、获得目的基因的方法：
（1）直接分离法—— a.鸟枪法
（2）人工合成法 b.反转录法 c.化射击法）
①分离程序：用限制性内切酶将完 整的DNA分子切成适当长度的片段， 然后通过检测的方法挑选出所需要 的基因。
B、具有多个限制酶切点，以便于目的基 因的表达
C．具有某些标记基因，以便为目的基因 的表达提供条件
D、能够在宿主细胞中复制并稳定保存， 以便于进行筛选
4、质粒是基因工程最常见的载体，它的 主要特点是( )
①能自主复制 ②不能自主复制 ③结构很小 ④是蛋白质 ⑤是环状RNA ⑥是环状DNA ⑦能“友好”地“借居”
想一想需要哪些工具呢？
普通棉花
抗虫棉
探究1：基因工程的基本工具是什么？
一、 基因手术刀：限制性内切酶 二、基因缝纫针：DNA连接酶 三、基因运输车：载体
一、 基因手术刀：限制性内切酶
1、来源： 主要从原核生物中分离纯化 2、功能：（1）识别特定的脱氧核苷酸序列（回文
序列）；（2）并在特异性位点把双链 DNA分子“切割”开。
第一节 基因工程的原理
乳汁中含有人生长激素的 转基因牛(阿根廷)
基因工程DNA的重组概技术念或基因拼接技术

5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα）
β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性， 装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和 β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性； 只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为 α-互补作用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编 码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个 基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。
3）生化标记基因
其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ,
GUS, CAT
4） 噬菌斑
3. 使用标记基因注意要点
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4）标记基因的结构变化对功能的影响与种类
1. 复制起点的种类
1) 核内复制起点 a. 染色体复制起点—原核生物(环状)和真核生物(线 状)染色体 b. 染色体外复制起点 i. 质粒—DNA,RNA,线状,环状,单链,双链 原核与真核生物 ii. 病毒—同上, 细胞内和病毒颗粒内
第一节
分子克隆载体的特点
一、发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的
利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建
立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列 载体。
2. 标记基因的种类
1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r， Hygr ，Neor

DNA操作技术 基因组计划：人类基因组和其他生物
基因组计划 蛋白质组 生物信息学 下游支撑技术与手段
生物技术的类别
传统生物技术：制酒、制醋、制豆瓣 工业生物发酵技术：抗生素发酵、氨
基酸发酵等 现代生物技术
生物技术的内容
基因工程技术 蛋白质工程技术 细胞（组织）工程技术 酶工程技术 发酵工程技术
细胞（组织）工程概念
利用工程学原理进行细胞生物学的基 础研究和制造使用活细胞的产品，如组 织工程和生物加工工程。前者是利用移 植的细胞、骨架、DNA、蛋白质或蛋白 质片段替代或修复已受伤或损坏的组织 和器官；后者是 利用活细胞生产生物医 药产品。
组织工程——人造器官
干细胞：2019年4月， 美国的科研人员 首次成功地从成年人骨髓的干细胞在体 外培养分化出软骨、脂肪和骨骼细胞。 标志着干细胞的研究取得了重大进展。
生物反应器：利用动植物细胞或组织作为 生物反应器，直接生产有用蛋白质
生物技术的应用领域
轻工与食品
新型食品；营养食品；保健食品；轻工用酶
环境
污染治理；废物利用；污染物生物降解
生物技术产业化
生物技术产业：利用细胞和生物分子进行药品、 农产品生产开发和环境治理的产业，该产业 技术由医药生物技术、农业生物技术和环境 生物技术共同组成
基因工程的概念
利用DNA体外重组或PCR扩增技术从 某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或 是用人工合成的方法获取基因，然后经过 一系列切割，加工修饰，连接反应形成重 组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞， 以期获得基因表达的过程.
基因工程(gene engineering)常和以下名称混用:
遗传工程(genetic engineering); 基因克隆(gene cloning); 分子克隆(molecular cloning); 基因操作(gene manipulation); 重组DNA技术(recombination DNA technique)

β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
LacZ基因的结构与产物
P LacZα LacZβ 转录 翻译
α
β
pUC18
外源DNA
BamHI片段
重组DNA分子 转化E.coli
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr
3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质 分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素 分子进入细菌细胞。
pUC19
LacZ
Apr
(2.68kb)
Ori
Ap r
利 用 菌 落 颜 色 筛 选 重 组 子
1)限制酶切
2)DNA重组 无DNA插入
外源DNA 有DNA插入
Apr
转化
Ap r
Ap r
筛选重组子 白色菌落
Apr
提取DNA 电泳
重组DNA Ap r
1)限制酶切
2)DNA重组 无DNA插入
外源DNA 有DNA插入
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 Apr Tcr为原载体 ApS Tcr为重组子 即为非重组子
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入

（1）将重组DNA导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法
（2）将重组DNA导入动物细胞
显微注射技术
提纯基因表达载体 体外显微注射入受精卵
受精卵移植
（3）如果是导入微生物（如细菌）
目的基因
重组质粒
氨苄青霉素抗性基因
（标记基因）
将细菌用CaCl2处理，使 细胞处于感受态，可促 进细胞吸收DNA分子
大肠杆菌的拟核
用限制酶 切成许多
片断
②利用PCR技术扩增目的基因
聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基 因。
聚合酶链式反应（PCR技术）
变性：双链DNA解链 成为单链DNA
复性（退火）：部 分引物与模板的单 链DNA的特定互补部 位相配对和结合
延伸：以目的基因 为模板，合成互补 的新DNA链
1.第一步：目的CR)技术扩增目的 基因（目的基因的序列已知） ③化学方法合成目的基因基 因的许多DNA片断，导入受 体菌的群体储存，各个受体 菌体
小片段DNA
重组DNA分抗虫蛋 白的菌落
该菌落所携带 形成重组DNA分子（构建基因表达载体)
通常用同一种限制酶切割目的基因和载体(质粒)，形成相同的 粘性末端，再用DNA连接酶将二者连接,形成重组DNA分子 （基因表达载体）。
用荧光分子或放射性 同位素标记
看能否形 成杂合的
双链区
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
检测—
方法: DNA分子杂交
过程:A.首先取出转基因生物的基因组DNA B.用含目的基因的DNA片段( 单链)用放射性同位素等作标 以此做探针 C.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带, 表明目的基因已插入染色体DNA中