载体构建的基本步骤

载体构建SOP流程:GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒I.获取目的基因/序列片段一.获取序列信息通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。

PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成二级结构。

③引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%之间。

⑤碱基要随机分布。

-⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧引物5′端可以修饰。

⑨引物3′端不可修饰。

⑩避免在引物的3’端使用碱基A。

在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。

过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。

过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。

要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。

二.制备模板1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。

高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。

RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。

现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。

Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。

载体构建
一、原理
依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

二、操作步骤
5、载体与目的基因连接
如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。

置于温箱，12-16℃，保温8-16h
6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）
依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，
12-16h。

7、单克隆检测
（1）挑单克隆
先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的
AMP，用枪头混匀；取1.5mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种。

载体构建基本步骤
载体构建基本步骤
1.选定目的基因，设计特异性引物，利用高保真酶进行PCR扩增
2.对扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测（1%）,若检测结果正确，测
序结果之后进行胶回收目的片段
3.通过平末端连接将目的基因连接到克隆载体（PMD-18T）
4.转化DH5α，根据载体抗性涂板37度过夜培养
5.挑取阳性克隆进行PCR验证，PCR验证后挑取阳性克隆进行大摇并
提取质粒、双酶切，同时取500微升菌液送测序
6.测序结果正确后对提取的质粒进行双酶切回收目的片段
7.对表达载体用同样的限制性内切酶双酶切之后回收大片段
8.将目的片段与表达载体的大片段用T4DNA连接酶连接后转化DH5
α，涂板37度过夜
9.挑取阳性克隆大摇酶切验证，若结果正确，则载体构建完毕。

本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！== 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ ==构建载体步骤篇一：载体构建的基本步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1H2O 7将加好的EP管置于37℃保温1-2h。

（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。

回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。

切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。

5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。

置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃， 12-16h。

7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的 AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。

载体构建技术基本流程
载体构建的基本流程：
1.载体质粒的选择；
2.引物设计；
3.PCR扩增；
4.载体和⽬标⽚段的限制性酶切；
5.连接转化；
6.挑取克隆提质粒验证。

重要的是，我们要为⼤家提供了⼀个载体构建流程模板，构建载体时希望⼤家可以创建⼀个word⽂档，按照我们提供的模板，将载体构建过程记录下来，便于后续优化。

后续⽂章中我们将举例告诉⼤家如何使⽤这个模板。

P.S. 构建表达载体时可以先连接T载体，可把步骤（12）酶切⽚段换成连接T载体后再对T载体进⾏酶切。

连接T载体会多花⼀天时间，但是可以使载体构建流程更顺利。

连接T载体与连接⽬的载体⽅法⼗分类似，本次举例不再涉及。

如果想要通过连接T载体过渡，可以⽹上搜索T载体相关产品说明书，了解T载体和连接T载体的⽅法。

引物设计的内容我们将放在接下来的⼀篇推送⾥，正在构建载体的⼤家，先尝试使⽤我们的载体构建流程模板吧。

载体构建载体构建分为以下步骤：1.载体的选择和引物设计以扩增⽬标基因2.⽬标⽚段的PCR扩增3.载体和⽬标⽚段的限制性酶切4.连接转化5.挑取克隆提质粒6.单克隆的验证及送样测序。

载体的选择实验室常⽤的载体有pUC19（扩繁⽬标⽚段），pet28a（原核表达载体Kna+），pGEX-4T-1(原核表达载体Amp+)，pCI-NEO(真核表达载体Amp+)，pCDNA3.1(真核表达载体Amp+)，pLKO.1(shRNA构建Amp+)。

根据所要构建的质粒⽬的的差异以及载体和⽬标⽚段的酶切位点分析结果来选择载体。

举例如下：实验⽬的是将MYC基因插⼊到载体中，转染进细胞中表达。

应选⽤真核表达载体pCI-NEO 或pCDNA3.1。

引物设计引物设计的⽬的是将⽬标⽚段扩增出来以便与载体连接，所以在引物的两端应⼈为加上酶切位点，酶切位点前加上保护碱基。

在选择酶切位点是应注意，选择的应该是⽬的基因⽚段中没有⽽载体上有的限制性内切酶，防⽌⽬标⽚段被切不完整，也便于和载体连接。

载体构建之后我们的⽬的是要表达，所以应该加⼊标签以便western blot检测蛋⽩是否表达。

常⽤的标签有Flag标签、6XHis 标签、HA标签和Myc标签。

Flag标签：D Y K D D D D KGAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG6XHis标签：H H H H H HCAC CAC CAC CAC CAC CACHA标签：Y P Y D V P D Y ATAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCTMyc标签：E Q K L I S E E D L这些标签被表达成氨基酸后，特定的氨基酸序列会与相应抗体结合，在western blot时可被检测。

因此，在设计引物时，这些核酸序列应位于起始密码⼦ATG之后。

翻译是从mRNA的5‘端开始，⽽蛋⽩质合成是从N端到C端，所以若要把标签加在N端，标签所对应的核苷酸序列应位于ATG 之后，若是加在C端，则应该将标签所对应的核苷酸序列置于终⽌密码⼦TAA之前。

载体构建的基本步骤载体构建是分子生物学研究中不可或缺的过程，它涉及到将目标基因或蛋白质序列移植到不同的载体中，以便扩大其表达量、纯化和研究。

本文将介绍载体构建的基本步骤，包括质粒的选择、PCR扩增、连接和转化等过程。

质粒的选择质粒是最常用的载体类型之一，具有很多优点，如易于扩增、转化和操纵等。

在选择质粒时，需要考虑以下几个方面：1. 质粒大小和拷贝数质粒的大小和拷贝数会影响其扩增和表达，选择适当大小和拷贝数的质粒可以提高表达效率。

2. 基因水平选择标记质粒中常含有基因水平选择标记，如抗生素耐药基因等。

在构建载体时需要选择合适的标记，以便快速筛选到表达了目标基因的细胞。

3. 表达宿主质粒可以在不同的宿主中表达，选择合适的表达宿主可以提高表达效率和纯度。

常见的表达宿主包括大肠杆菌、酵母等。

PCR扩增PCR扩增是将目标序列扩增为质粒中适当长度的过程。

在进行PCR扩增之前，需要准备以下试剂和设备：•Taq DNA聚合酶•原始模板DNA•引物•正向引物和反向引物•dNTP混合物•PCR缓冲溶液在PCR扩增中，需要设置合适的反应体系和程序。

常见的PCR反应条件为：•94℃，5 min：初始变性•94℃，30 s：变性•50-60℃，30 s：退火•72℃，1 min/kb：延伸•72℃，7 min：最终延伸连接连接是将PCR扩增产物与质粒DNA连接的过程。

连接反应需要用到T4 DNA连接酶和DNA PCR产品凝胶提取试剂盒等试剂，具体操作步骤如下：1.将PCR扩增产物切割至合适长度。

2.提取PCR产物，并使用DNA PCR产品凝胶提取试剂盒纯化。

3.连接酶在37℃下反应数小时。

4.连接反应后，在大肠杆菌中进行转化。

转化转化是将连接成功的PCR产物转化为大肠杆菌的过程。

转化需要用到大肠杆菌、新鲜的LB培养基和适当的抗生素等试剂。

常见的转化条件为：80-90秒高温热冲击，加入细胞后在37℃，250rpm振荡培养1小时后添加适宜浓度的抗生素进行筛选。

构建克隆载体步骤构建克隆载体主要有以下步骤：一、基本动作要领1. 目的基因的获取- 首先，如果是从基因组DNA中获取目的基因，咱们就得先提取基因组DNA。

就像摘果子得先找到果树一样，这里提取基因组DNA的方法有很多，像酚- 氯仿抽提法就比较经典。

提取的时候，一定要保证样本的新鲜度。

我之前就做错过，用了放置很久的样本，结果提取出来的DNA 质量特别差。

如果是从mRNA经反转录得到cDNA再获取目的基因的话，就要注意mRNA的质量了。

要使用质量好的逆转录酶，这就好比建房子得用好的砖头，mRNA就是建基因这座“房子”的砖头。

2. 载体的选择- 载体就像是一辆“车”，用来搭载我们的目的基因。

常见的载体有质粒、噬菌体、病毒等。

如果是简单的在细菌里克隆，一般就选质粒载体。

要根据自己的实验需求来选，比如要有合适的筛选标记，像抗药性基因之类的，这样才能方便后续筛选出带有重组载体的细胞。

3. 目的基因和载体的酶切- 这是很关键的一步，要选择合适的限制性内切酶。

就像开锁得用对钥匙一样，酶切位点必须是载体和目的基因上都有的，而且要在合适的反应体系里进行。

酶切反应的缓冲液、温度、反应时间都得严格控制。

我试过好多次，温度稍微不对，酶切就不完全。

反应体系里的底物浓度也要合适，别加太多或者太少的DNA，就像做菜加盐一样，得适量。

- 给大家简单画个示意图来理解一下。

就好比长条形的目的基因和环状的载体，用内切酶在特定的位置“咔嚓”一刀，这样就产生了可以连接的黏性末端或者平末端。

二、个人小技巧1. 在酶切之前，可以先做个小的预实验。

就像试水温一样，看看用什么浓度的酶、多长的反应时间是最合适的。

对了这里可以把目的基因和载体分别做预酶切，这样如果有问题就可以很快定位是哪一个的问题。

2. 在选择内切酶的时候，尽量选择产生不同黏性末端的酶，这样在连接的时候特异性会更好。

这就好比把两个不同形状的拼图碎片拼在一起，不容易拼错。

三、容易忽视的细节1. 酶切完后一定要进行凝胶电泳来检验酶切产物是否正确。

原核表达载体构建步骤一、前期准备1. 首先呢，咱们得把要用的材料都找齐喽。

像目的基因啦，原核表达载体还有各种酶，比如说限制性内切酶之类的。

这一步看起来简单，可千万别小瞧它哦！要是少了啥，后面就麻烦了。

我就有次忘记检查有没有足够的载体，结果做到一半才发现，那叫一个懊恼啊！2. 对了，关于目的基因，你得确定它的序列是正确的。

这一点真的很重要，真的！我通常会再检查一次，毕竟如果基因序列错了，后面做的可能都是白搭。

你是不是也担心这个问题呢？二、载体和目的基因的处理1. 接下来就要处理原核表达载体和目的基因了。

先用限制性内切酶去切割载体和目的基因。

这个过程得小心点儿哦！酶切的条件要设置好，像温度呀、反应时间啥的。

我一般会按照说明书上的推荐值来设置，不过有时候也会根据实际情况微调一下。

这一步其实还蛮关键的，如果酶切不完全，后面连接的时候就容易出岔子。

2. 酶切完之后呢，要对产物进行纯化。

这个纯化的步骤你可以根据自己实验室现有的设备和试剂来选择合适的方法。

我觉得只要能把想要的东西纯出来就行啦，不用太纠结具体用哪种方法。

三、连接反应2. 在这个连接反应进行的时候，要注意反应的环境。

温度要保持稳定，最好放在专门的恒温设备里。

不然的话，连接反应可能就不能很好地进行啦。

这一点大家一定要注意哦！四、转化1. 连接产物弄好之后，就可以进行转化了。

把连接产物导入到感受态细胞里面。

这个感受态细胞的制备也是个重要的事儿。

不过如果你不想自己制备的话，也可以买现成的。

导入的时候呢，要按照操作规程来，可不能马虎。

我记得我刚开始做的时候，就因为没严格按照步骤来，转化效率特别低，那个时候真是欲哭无泪啊。

2. 转化完了之后，要把细胞放到合适的培养基里面培养。

这个培养基的选择也要看你的细胞类型和实验需求哦。

在培养的过程中，要注意观察细胞的生长状态。

如果发现有什么异常，就得想想是不是前面哪个步骤出问题了。

五、筛选阳性克隆1. 等细胞长起来之后，就要开始筛选阳性克隆了。