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转基因抗虫棉花基因类型及原理研究进展孙璇;马燕斌;张树伟;段超;王新胜;李燕娥【摘要】评述了苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因、苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、植物外源凝集素类基因、RNA干扰技术涉及到的一些昆虫来源基因等几类抗虫基因的抗虫机理及其在转基因棉花中的应用,并分析了抗虫转基因棉花研究目前存在的问题和发展趋势.通过回顾总结我国转基因抗虫棉已取得的成果,以了解我国现阶段转基因抗虫棉研究的进展程度,为进一步研究转基因抗虫棉提供方向.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2016(044)001【总页数】4页(P115-118)【关键词】棉花;转基因;抗虫基因【作者】孙璇;马燕斌;张树伟;段超;王新胜;李燕娥【作者单位】山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000;山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000;山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000;山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000;山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000;山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000【正文语种】中文【中图分类】S562棉花（Gossypium hirsutum L.）隶属于锦葵科（Malvaceae）棉属（Gossypium），是世界上最主要的经济作物之一，同时，其也是我国重要的经济作物之一。
随着基因工程技术的快速发展，转基因抗虫棉得到了迅猛的发展。
转基因抗虫棉基因类型主要有：苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）基因；苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白（Vegetative Insectidal Proteins，VIPs）基因；蛋白酶抑制剂（Proteinase Inhibitors，PIS）基因；植物外源凝集素（Lectins）类基因以及RNA干扰技术（RNAi）所涉及到的一些昆虫来源基因等。
转基因抗虫棉的研究进展摘要：综述了转基因抗虫棉的研究进展，包括抗虫基因的研究、载体构建技术的研究、转化技术的研究及存在的问题等，并展望了转基因抗虫棉未来发展前景。
关键词：转基因抗虫棉花研究进展引言棉花生长周期长、虫害多，造成的损失非常严重。
据统计，在转基因抗虫棉商品化之前，全球每年用于防治棉花虫害的费用高达20亿美元，约占所有农作物防虫费用的四分之一。
[1]传统的化学农药防治棉铃虫不仅费用高，且已引发了棉虫的抗药性，同时化学杀虫剂的过量使用也带来了环境污染的问题，而转基因植物所产生的杀虫蛋白主要是通过抑制害虫消化等生理功能而达到抗虫的目的。
与施药防治棉田害虫相比，转基因技术具有较多优势：不会在土壤和地下水中造成残留；不会被雨水冲刷流失；对非靶标生物无毒性；保护作用无盲区；减少农药及用工投入[2]等。
雪花凝集素（Gulanthus nivalis agglutinin gene，GNA）是第一个转入重要作物、并对刺吸式口器害虫有抗性的基因，转GNA的水稻可降低害虫的存活率，阻止害虫的发育[3]。
另外烟草阴离子过氧化物酶[4]、昆虫几丁质酶基因[5]也被用于抗虫基因工程的研究。
迄今为止在棉花抗虫基因工程研究领域，最成功的例子是苏云金芽孢杆菌Bt杀虫基因的应用，其次是蛋白酶抑制剂基因。
另外，凝集素、α-淀粉酶抑制剂、胆固醇氧化酶等转基因抗虫植物的研究也取得了进展，所以利用基因工程技术培育转基因抗虫棉受到了各国的高度重视。
自1996年商品化种植转基因作物开始，全球转基因植物的种植面积已由1996年的170万hm2猛增到2008年的1.25亿hm2，增长了73倍，2008年全球市场价值已达75亿美元，约占全球商业种子市场的22%，其市场价值优势明显，转基因产业得到了蓬勃发展，尤其在发展中国家。
印度Bt棉2002年引入，连年种植面积快速增加，至2008年达760万hm2，产量翻番，曾经是全球棉花产量很低的国家，现已成为棉花出口国。
农业农村部关于修改《农业转基因生物安全评价管理办法》等规章的决定正文：----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------农业农村部令2022年第2号《农业农村部关于修改〈农业转基因生物安全评价管理办法〉等规章的决定》已经2021年12月31日第18次部常务会议审议通过，现予公布，自2022年1月21日起施行。
部长唐仁健2022年1月21日农业农村部关于修改《农业转基因生物安全评价管理办法》等规章的决定为有序推进生物育种产业化应用，发展现代种业，保障粮食安全，农业农村部决定对《农业转基因生物安全评价管理办法》《主要农作物品种审定办法》《农作物种子生产经营许可管理办法》《农业植物品种命名规定》4部规章的部分条款予以修改。
一、对《农业转基因生物安全评价管理办法》（2002年1月5日农业部令第8号公布，2004年7月1日农业部令第38号、2016年7月25日农业部令2016年第7号、2017年11月30日农业部令2017年第8号修订）作出修改（一）第十八条增加一款，作为第二款：“鼓励从事农业转基因生物试验的单位建立或共享专用的试验基地。
”（二）对附录Ⅰ作如下修改1.将“二、转基因植物试验方案”中的“品种、品系”修改为“转化体”。
2.将“三、转基因植物各阶段申报要求”3.2修改为:“试验转基因植物材料数量：一份申报书只能申请1个转化体，其名称应与前期试验阶段的名称或编号相对应。
”3.将“三、转基因植物各阶段申报要求”3.3中的“应在批准过环境释放的省（市、自治区）进行”修改为“应在试验植物的适宜生态区进行”。
4.删除“三、转基因植物各阶段申报要求”3.5.10。
5.将“三、转基因植物各阶段申报要求”4.1修改为：“项目名称：应包含目的基因名称、转基因植物名称等几个部分，如转cry1Ac基因抗虫棉花XY12的安全证书。
2013年10月15日为止发布的转基因检测标准详细清单:转基因作物检测大体分为两种：一是检测是否含有外源蛋白，即外源基因表达产物，主要采用酶联免疫吸附法和试纸条法；二是检测是否含有外源基因(DNA)，主要有Southern杂交技术、基因芯片法和PCR检测法。
一、农业部发布的转基因标准清单 (94项)（2013年10月15日更新）1转基因植物及其产品检测通用要求NY/T672－20032转基因植物及其产品检测抽样NY/T673－20033转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化NY/T674－20034转基因植物及其产品检测大豆定性PCR方法NY/T675－20035转基因大豆环境安全检测技术规范第1部分：生存竞争能力检测NY/T719.1-20036转基因大豆环境安全检测技术规范第2部分：外源基因流散的生态风险检测NY/T719.2-20037转基因大豆环境安全检测技术规范第3部分：对生物多样性影响的检测NY/T719.3-2003 8转基因玉米环境安全检测技术规范第1部分：生存竞争能力检测NY/T720.1-20039转基因玉米环境安全检测技术规范第2部分：外源基因流散的生态风险检测NY/T720.2-200310转基因玉米环境安全检测技术规范第3部分：对生物多样性影响的检测NY/T720.3-2003 11转基因油菜环境安全检测技术规范第1部分：生存竞争能力检测NY/T721.1-200312转基因油菜环境安全检测技术规范第2部分：外源基因流散的生态风险检测NY/T721.2-200313转基因油菜环境安全检测技术规范第3部分：对生物多样性影响的检测NY/T721.3-2003 14转基因植物及其产品食用安全性评价导则NY/T 1101-200615转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素植酸、棉酚和芥酸的测定NY/T 1103.1-2006 16转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素胰蛋白酶抑制剂的测定NY/T 1103.2-2006 17转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素硫代葡萄糖苷的测定NY/T 1103.3-2006 18转基因植物及其产品食用安全检测大鼠90天喂养试验NY/T 1102-200619农业转基因生物标签的标识农业部869号公告－1－200720转基因生物及其产品食用安全检测模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性试验方法农业部869号公告－2－200721转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Bt11及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－3－200722转基因植物及其产品成分检测抗除草剂杂交油菜Ms1、Rf1及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－4－200723转基因植物及其产品成分检测抗除草剂杂交油菜Ms8、Rf3及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－5－200724转基因植物及其产品成分检测抗除草剂杂交油菜Ms1、Rf2及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－6－200725转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米TC1507及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－7－200726转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Bt176及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－8－200727转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米MON810及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－9－200728转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米MON863及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－10－200729转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜GT73及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－11－200730转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米GA21及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－12－200731转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米NK603及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－13－200732转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米T25及其衍生品种定性PCR方法农业部869号公告－14－200733转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米Bt10及其衍生品种定性PCR方法农业部953号公告-1-200734转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米CBH351及其衍生品种定性PCR方法农业部953号公告-2-200735转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜T45及其衍生品种定性PCR方法农业部953号公告-3-200736转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜Oxy-235及其衍生品种定性PCR方法农业部953号公告-4-200737转基因动物及其产品成分检测促生长转ScGH基因鲤鱼性PCR方法农业部953号公告-5-200738转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt基因水稻定性PCR方法农业部953号公告-6-200739转基因植物及其产品环境安全检测育性改变油菜农业部953号公告-7-200740转基因植物及其产品环境安全检测抗虫水稻第1部分：抗虫性农业部953号公告-8.1-200741转基因植物及其产品环境安全检测抗虫水稻第2部分：生存竞争能力农业部953号公告-8.2-200742转基因植物及其产品环境安全检测抗虫水稻第3部分：外源基因漂移农业部953号公告-8.3-200743转基因植物及其产品环境安全检测抗虫水稻第4部分：生物多样性影响农业部953号公告-8.4-200744转基因植物及其产品环境安全检测抗病水稻第1部分：对靶标病害的抗性农业部953号公告-9.1-200745转基因植物及其产品环境安全检测抗病水稻第2部分：生存竞争能力农业部953号公告-9.2-200746转基因植物及其产品环境安全检测抗病水稻第3部分：外源基因漂移农业部953号公告-9.3-200747转基因植物及其产品环境安全检测抗病水稻第4部分：生物多样性影响农业部953号公告-9.4-200748转基因植物及其产品环境安全检测抗虫玉米第1部分：抗虫性农业部953号公告-10.1-200749转基因植物及其产品环境安全检测抗虫玉米第2部分：生存竞争能力农业部953号公告-10.2-200750转基因植物及其产品环境安全检测抗虫玉米第3部分：外源基因漂移农业部953号公告-10.3-200751转基因植物及其产品环境安全检测抗虫玉米第4部分：生物多样性影响农业部953号公告-10.4-200752转基因植物及其产品环境安全检测抗除草剂玉米第1部分：除草剂耐受性农业部953号公告-11.1-200753转基因植物及其产品环境安全检测抗除草剂玉米第2部分：生存竞争能力农业部953号公告-11.2-200754转基因植物及其产品环境安全检测抗除草剂玉米第3部分：外源基因漂移农业部953号公告-11.3-200755转基因植物及其产品环境安全检测抗除草剂玉米第4部分：生物多样性影响农业部953号公告-11.4-200756转基因植物及其产品环境安全检测抗虫棉花第1部分：对靶标害虫的抗虫性农业部953号公告-12.1-200757转基因植物及其产品环境安全检测抗虫棉花第2部分：生存竞争能力农业部953号公告-12.2-200758转基因植物及其产品环境安全检测抗虫棉花第3部分：基因漂移农业部953号公告-12.3-200759转基因植物及其产品环境安全检测抗虫棉花第4部分：生物多样性影响农业部953号公告-12.4-200760转基因植物及其产品成分检测抗虫水稻TT51-1及其衍生品种定性PCR方法农业部1193号公告-1-200961转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜Topas19/2及其衍生品种定性PCR方法农业部1193号公告-2-200962转基因植物及其产品成分检测耐贮藏番茄D2及其衍生品种定性PCR方法农业部1193号公告-3-200963转基因植物及其产品成分检测耐除草剂棉花MON1445及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-1-201064转基因微生物及其产品成分检测猪伪狂犬TK-/gE-/gI-毒株（SA215株）及其产品定性PCR1485号公告-2-201065转基因植物及其产品成分检测耐除草剂甜菜H7-1及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-3-201066转基因植物及其产品成分检测 DNA提取和纯化1485号公告-4-201067转基因植物及其产品成分检测抗病水稻M12及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-5-201068转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆MON89788及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-6-201069转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆A2704-12及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-7-201070转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆A5547-127及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-8-201071转基因植物及其产品成分检测抗虫耐除草剂玉米59122及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-9-201072转基因植物及其产品成分检测耐除草剂棉花LLcotton25及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-10-201073转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt基因棉花定性PCR方法1485号公告-11-2010 74转基因植物及其产品成分检测耐除草剂棉花MON88913及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-12-201075转基因植物及其产品成分检测抗虫棉花MON15985及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-13-201076转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt基因棉花外源蛋白表达量检测技术规范1485号公告-14-201077转基因植物及其产品成分检测抗虫耐除草剂玉米MON88017及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-15-201078转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米MIR604及其衍生品种定性PCR方法1485号公告-16-201079转基因生物及其产品食用安全检测外源基因异源表达蛋白质等同性分析导则1485号公告-17-201080转基因生物及其产品食用安全检测外源蛋白质过敏性生物信息学分析方法1485号公告-18-201081转基因植物及其产品成分检测基体标准物质候选物鉴定方法1485号公告-19-201082转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆356043及其衍生品种定性PCR方法农业部1782号公告-1-201283转基因植物及其产品成分检测标记基因NPTII、HPT和PMI定性PCR方法农业部1782号公告-2-201284转基因植物及其产品成分检测调控元件CaMV 35S启动子、FMV 35S启动子、NOS启动子、NOS终止子和CaMV 35S终止子定性PCR方法农业部1782号公告-3-201285转基因植物及其产品成分检测高油酸大豆305423及其衍生品种定性PCR方法农业部1782号公告-4-201286转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆CV127及其衍生品种定性PCR方法农业部1782号公告-5-201287转基因植物及其产品成分检测bar或pat基因定性PCR方法农业部1782号公告-6-2012 88转基因植物及其产品成分检测CpTI基因定性PCR方法农业部1782号公告-7-201289转基因植物及其产品成分检测基体标准物质制备技术规范农业部1782号公告-8-2012 90转基因植物及其产品成分检测标准物质试用评价技术规范农业部1782号公告-9-2012 91转基因植物及其产品成分检测转植酸酶基因玉米BVLA430101构建特异性定性PCR方法农业部1782号公告-10-201292转基因植物及其产品成分检测转植酸酶基因玉米BVLA430101及其衍生品种定性PCR方法农业部1782号公告-11-201293转基因生物及其产品食用安全检测蛋白质氨基酸序列飞行时间质谱分析方法农业部1782号公告-12-201294转基因生物及其产品食用安全检测挪威棕色大鼠致敏性试验方法农业部1782号公告-13-2012二、国家质检总局发布的标准（30项）（2013年10月15日更新）1转基因产品检测通用要求和定义GB/T 19495.1-20042转基因产品检测实验室技术要求GB/T 19495.2-20043转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T 19495.3-20044转基因产品检测核酸定性PCR检测方法GB/T 19495.4-20045转基因产品检测核酸定量PCR检测方法GB/T 19495.5-20046转基因产品检测基因芯片检测方法GB/T 19495.6-20047转基因产品检测抽样和制样方法GB/T 19495.7-20048转基因产品检测蛋白质检测方法GB/T 19495.8-20049基因检验实验室技术要求SN/T1193-200310植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法SN/T1194-200311大豆中转基因成分的定性PCR检测方法SN/T1195-200312玉米中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1196-200313油菜籽中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1197-200314马铃薯中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1198-200315棉花中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1199-200316烟草中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1200-200317植物性饲料中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1201-200318食品中转基因植物成份定性PCR检测方法SN/T1202-200319食用油脂中转基因植物成份定性PCR检测方法SN/T1203-200320植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法SN/T1204-200321番茄中转基因成分定性PCR检测方法SN/T1816-200622小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR定性检测方法SN/T 1943-200723主要食用菌中转基因成分定性PCR检测方法SN/T 2074-200824 蜂蜜中转基因成分检测方法普通PCR方法和实时荧光PCR方法SN/T 2135-200825 青椒中转基因成分定性PCR检测方法SN/T 2271-200926水稻及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法 SN/T 2584-201027转基因成分检测玉米检测方法（2013年7月1日起实施）SN/T 1196-201228转基因成分检测大豆PCR-DHPLC检测方法（2013年9月16日起实施） SN/T 3576-2013 29牛及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法（2013年9月16日起实施）SN/T 3495-201330转基因成分检测番茄检测方法SN/T 1816-2013。
医用卡那霉素在转基因抗虫棉鉴定中的应用摘要利用医用硫酸卡那霉素对不同品种的棉花叶片进行处理，研究不同浓度医用硫酸卡那霉素溶液、不同棉花品种叶片对卡那霉素处理的外观变化。
结果表明：不同棉花品种叶片对卡那霉素处理呈相同的变化趋势。
当卡那霉素浓度达到5 000 mg/L时，检测准确度最好。
关键词转基因；棉花；医用卡那霉素；浓度由于转基因抗虫棉花品种在农业生产上大面积应用和各地引种工作的日益频繁，在人们受益于转基因抗虫棉这项高新技术的同时，也存在着已知的或潜在的生态安全风险。
因此，必须采取有效措施控制和预防这种风险。
利用实验室技术进行转基因抗虫棉花品种检测较繁琐，操作不便[1-3]。
而田间用医用卡那霉素直接对棉花叶片进行抗性鉴定是一项方便、有效的技术[4]。
但农作物对卡那霉素的敏感度存在差异，而棉花叶片对卡那霉素存在抗性反应。
因此，研究棉花叶片对卡那霉素处理的反应，进而发展、推广应用该技术，以提高转基因抗虫棉检测、鉴定的准确性。
1 材料与方法1.1 试验材料参试棉花品种：非转基因品种新陆早36号、自育品系Y153-2和35-2；转基因抗虫对照品种为抗虫5号、抗虫10号。
硫酸卡那霉素为徐州莱恩药业有限公司生产的2 mL：0.5 g（50万U）医用注射液。
一次性医用注射器、医用脱脂棉、蒸馏水（或纯净水）。
1.2 试验方法试验前将医用卡那霉素注射液用蒸馏水分别配制成1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 mg/L 5个不同浓度的处理。
试验时，用医用注射器吸取不同浓度的卡那霉素溶液，拔除针头，塞上医用脱脂棉，在棉花生长的四叶期，涂抹棉花新展开倒1叶上的相同部位，直径1～2 cm，以湿润为准。
每个参试品种，利用不同浓度的卡那霉素溶液各处理60株，并在田间做好相应的标记。
5 d后观察各处理涂抹部位的叶色反应，并做好相应数据的记载和后期处理、分析工作。
应选择在清晨或傍晚涂抹，避开高温、蒸发剧烈和大风或降雨等异常天气。
转基因抗虫棉流程图
平时观察发现某些植物有抗虫的属性，研究这种植物，筛选出控制这个属性的基因：苏云金芽孢杆菌的Bt基因。
①：提取.获取目的基因是实施基因工程的第一步，从苏云金芽孢杆菌中获取Bt基因。
②：基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。
将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。
把Bt蛋白基因组合到四环素抗性基因中。
③：.将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。
目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增，用人工方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，主要
是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
④：检测与鉴定.目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。
因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。
检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。
重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。
转基因作物安全评价及检测技术自从1983年首例抗病毒转基因作物(GMC)问世以来，转基因作物的开发就成为了科学界研究的热点。
1986年，转基因作物首次被批准在田间试验，1993年底，美国的第一批延迟成熟期番茄获得上市批准。
其后，转基因作物的发展更为迅速。
截止1997年10月，全世界转基因作物的田间试验已达25000多例，开发了具有抗除草剂、抗虫、抗病毒、延长成熟期等不同性状的转基因油菜、玉米、棉花、水稻、番茄、南瓜等新品种。
近年来，各国在原有的转基因作物研究基础上取得了大量成果，除了上述的抗虫、抗除草剂以及抗病毒作物外，还出现了氮、磷肥高效利用，耐旱、耐盐碱、耐铝毒等转基因作物，蒸煮和食味品质明显改善的水稻及富含昏胡萝卜素的…金米”稻等。
2007年，张启发院士提出开展“绿色超级稻”培育的构想。
重点围绕水稻抗病虫、抗旱、营养高效利用、优质、高产等五大重要性状进行改良，使水稻生产实现“少打农药、少施化肥、节水抗旱、优质高产”。
基于转基因作物优良的特性，越来越多的国家批准转基因作物的商业化种植。
据国际农业生物技术应用服务组织f ISAAA）统计，2009年全球共有25个国家种植转基因作物，种植面积达到1.34亿hm2。
是1996年的80倍，全球市场价值达到105亿美元。
目前商业化种植的主要转基因作物是大豆、玉米、棉花和油菜等，其中转基因大豆和玉米的种植面积占全球转基因作物种植面积的80%以上。
我国目前主要种植的是转基因棉花、杨树、番茄和甜椒等，种植面积从2002年的200万hm 2增加到2009年的370万hm2，年均增长15%。
2009年我国抗虫转基因棉花种植面积约占总种植面积的90%，转基因棉花的广泛种植有效的降低了棉花种植成本，给我国带来了巨大的经济效益。
2009年12月，我国又为转植酸酶基因玉米和两个转基因抗虫水稻品系“华恢1号”和“Bt汕优63”颁发了生物安全证书，使转基因玉米和水稻的商业化进程向前迈进了一大步。
转基因抗虫棉花检测技术规范——定性PCR 筛查方法〔试行〕编制说明为进一步加强对转基因抗虫棉花的安全监管，爱护研发者、经营者和生产者的合法权益，保证人类健康和生态环境安全，依照«农业转基因生物安全治理条例»及其配套治理方法的规定和«关于加强转基因抗虫棉安全治理与监督检查的通知»(农办科[2005] 15号)的要求，满足开展技术检测工作的需要，特制定本技术规范。
1、编制原那么本技术规范的编制遵循以下原那么：(1)法治性：本技术规范的编制，严格执行国家法律法规和强制性标准的规定，以保证国家和研发者、经营者、生产者的权益。
(2)可靠性：本技术规范的编制，力求反应相关领域研究成果的先进性、成熟性和代表性，以保证检测结果的精确性和重复性。
(3)有用性：本技术规范的编制，力求把经济有用和技术有用结合起来，以保证检测的操作简便和费用低廉。
(4)规范性：本技术规范的编制，力求做到技术内容表达正确无误、文字表达简明易明白，以保证检测人员准确把握。
(5)操作性：本技术规范的编制，力求将操作过程中的要点进行细化和量化，以保证检测人员操作方便。
(6)兼容性：本技术规范的编制，参考和借鉴了国外同类标准或规范内容，以保证既符合国情又尽可能与国际接轨。
2、编制依据本技术规范编制的法律依据要紧有：(1)«农业转基因生物安全治理条例»——中华人民共和国国务院令第304号；(2)«农业转基因生物安全评判治理方法»——中华人民共和国农业部令第8号；(3)«农业转基因生物进口安全治理方法»——中华人民共和国农业部令第9号；(4)«农业转基因生物标识治理方法»——中华人民共和国农业部令第10号。
3、适用范畴转基因抗虫棉花可从以下三个方面进行检测：(1)筛查检测：利用通用序列分别设计引物对棉花Sad1内标准基因、CaMV35S启动子、NOS终止子以及cry1Ac基因或者cry1Ab基因或者cry1Ac和cry1Ab的融合基因进行PCR扩增，筛查确定样品是否含有转基因成分，以判定送〔抽〕检样品是否为转基因抗虫棉花。
(2)特异性检测：利用外源基因特异序列设计特异性引物对转基因抗虫棉花品种进行PCR扩增，检测确定样品所含外源基因类型，以判定送〔抽〕检样品是否为国家批准种植或在国家批准区域内种植的转基因抗虫棉花。
(3)品种〔组合〕鉴定：结合转基因抗虫棉花品种〔组合〕的特点、特性检测与鉴定，进一步检测或鉴定转基因抗虫棉花的品种〔组合〕名称，以判定该品种〔组合〕是否为国家批准种植或在国家批准区域内种植的转基因抗虫棉花。
具体检测技术路线流程如以下图所示，可依照检测工作的实际需要，选择相应的检测技术路线。
转基因抗虫棉花检测技术路线流程图本技术规范规定了转基因棉花定性PCR筛查方法，适用于转基因棉花中转基因成分的定性PCR筛查。
特异性检测和品种〔组合〕鉴定的技术规范，将依照实际情形适时予以公布。
4、检测方法本技术规范包括棉花的Sad1基因和转基因抗虫棉花中的CaMV35S启动子、NOS终止子、cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ac 与cry1Ab融合基因的定性PCR筛查方法。
5、检测条件本技术规范实施的检测机构应具备以下条件：(1)具备PCR检测所需的仪器设备和技术人员；(2)具备相对独立的分子生物学检测实验室及其配套设施；(3)客观、公平和中立，不从事转基因棉花的研发工作；(4)承担检测的法律义务和责任，按规定对检测结果保密；(5)严格执行农业部质量检验监督中心的治理规定和检测程序。
本技术规范受农业部农业转基因生物安全治理办公室托付，由农业部科技进展中心、中国农业科学院、南京农业大学、中国科学院、山东省农业科学院、吉林省农业科学院编制。
编制人员：魏启文、刘信、宋贵文、沈平、汪其怀、张永军、金芜军、崔洪志、周宝良、田颖川、吴家和、路兴波、张明等。
二oo五年三月转基因抗虫棉花检测技术规范——定性PCR筛查方法〔试行〕1 范畴本技术规范规定了转基因抗虫棉花定性PCR筛查方法。
本技术规范适用于转基因抗虫棉花中转基因成分的定性PCR筛查2 规范性引用文件以下文件中的条款通过本技术规范的引用而成为本技术规范的条款。
凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单〔不包括勘误的内容〕或修订版均不适用于本技术规范，然而，鼓舞依照本技术规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本技术规范。
NY/T672 转基因植物及其产品检测通用要求NY/T673 转基因植物及其产品检测抽样3 术语和定义以下术语和定义适用于本部分。
3.1Sad1基因Sad1〔s tearoyl-a cyl carrier protein d esaturase；Genbank No. AJ132636〕基因来源于陆地棉品种，该基因序列与其他植物〔海岛棉、小麦、玉米、大麦、烟草、西红柿、油菜、水稻、向日葵等〕类似基因的序列同源性专门低。
Sad1基因在陆地棉基因组内含有两个拷贝。
具体序列见附录A。
3.2cry1Ac基因人工合成苏云金芽孢杆菌晶体蛋白1Ac基因。
cry1Ab基因人工合成苏云金芽孢杆菌晶体蛋白1Ab基因。
cry1Ac与cry1Ab融合基因3.3转基因抗虫棉花本技术规范中转基因抗虫棉花指含有cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac 与cry1Ab融合基因,具有对靶标昆虫具有毒杀功能的棉花。
4 原理针对现有转基因抗虫棉花普遍含有的棉花Sad1内标准基因、CaMV 35S启动子、nos终止子以及cry1Ac基因或者cry1Ab基因或者cry1Ac与cry1Ab融合基因，设计这些序列的特异性引物进行PCR扩增，以筛查棉花中是否含有转基因成分。
5 试剂、材料及溶液配制除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。
5.110 mol/L NaOH溶液：称取氢氧化钠80 g，先用160 mL水溶解后，再加水定容到200 mL。
5.2 1 mol/L Tris-HCl称取121.1g Tris碱溶解于800 mL水中，用浓盐酸调pH至8.0，用水定容至1000 mL。
在103.4kPa, 温度为121℃,灭菌20 min后贮备使用。
5.3500 mmol/L 乙二铵四乙酸二钠〔EDTA〕溶液：称取乙二铵四乙酸二钠18.6 g，加入70 mL水中，再加入10 mol/L NaOH 溶液，加热溶解后，冷却至室温，再用10 mol/L NaOH溶液调pH至8.0，用水定容到100 mL。
在103.4kPa，温度为121℃，灭菌20 min。
5.4抽提液〔1000 ml〕药品终浓度称量样品葡萄糖0.35 M 69.3g1M Tris-HCl〔pH7.5〕0.1 M 100 ml0.5M EDTA〔pH8.0〕0.005 M 10 ml聚乙烯吡咯烷酮(K30)〔PVP〕2% (w/v) 20 gDIECA〔diethyldithiocarbamic acid〕0.1%(w/v) 1 gβ-巯基乙醇0.2%〔用时现加〕 2 ml重蒸馏水定容至1000ml 5.5裂解液药品终浓度称量样品氯化钠〔NaCl〕 1.4 M 81.7g0.5M EDTA〔pH8.0〕0.02 M 4ml1M Tris-HCl〔pH7.5〕0.1 M 100ml十六烷基三甲基溴化铵〔CTAB〕2%〔w/v〕20 gPVP (K30) 2% (w/v) 20 gDIECA 0.1% (w/v) 1 gβ-巯基乙醇0.2% (用时现加) 2ml重蒸馏水定容至1000ml 5.625苯酚:24氯仿:1异戊醇〔v/v〕5.724氯仿:1异戊醇〔v/v〕5.810 mg/ml RNase A将胰RNA酶〔RNase A〕溶于10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15 mmol/L NaCl 中，配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份储存于-20℃。
5.9异丙醇5.103 M乙酸钠〔pH 5.6〕O溶于800ml水中，用冰乙酸调pH至5.6，然后用水将408.1g乙酸钠·H2定容至1L，高压灭菌后备用。
5.1170%乙醇5.12TE缓冲液〔pH 8.0〕：1 mol/L Tris-HCl〔pH 8.0〕10 mL和500 mmol/L EDTA〔pH8.0〕溶液2 mL，用水定容至1000 mL。
在103.4kPa, 温度为121℃，灭菌20 min。
5.13琼脂糖5.14溴化乙锭〔EB〕溶液：10 mg/mL。
注意：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应该戴一次性手套操作。
5.15四种脱氧核糖核苷酸〔dNTPs〕各2.5 mmol/L的混合溶液。
5.1650×TAE缓冲液：称取 Tris 242.2 g，先用300 mL水加热搅拌溶解后，加100 mL( 500 mmol/L) EDTA的水溶液〔pH 8.0〕，用冰乙酸调pH至8.0，然后用水定容到1000 mL。
5.17Taq DNA聚合酶〔5单位/μL〕及PCR反应缓冲液。
5.18DNA分子量标准。
5.19加样缓冲液：称取溴酚蓝250 mg，加水10 mL，在室温下过夜溶解；再称取二甲基苯腈蓝250 mg，用10 mL水溶解；称取蔗糖50 g，用30 mL水溶解，混合三种溶液，用水定容至100 mL，在4℃下储存。
5.20引物。
5.20.1 Sad1基因。
s-F: CCAAAGGAGGTGCCTGTTCAs-R: TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC预期扩增片段大小为108 bp。
5.20.2 nos终止子序列。
nos-F：5'GAATCCTGTTGCCGGTCTTG3’；nos-R：5'TTATCCTAGTTTGCGCGCTA3’；预期扩增片段大小为180 bp。
5.20.3 CaMV35S启动子序列。
35S-F：5'GCTCCTACAAATGCCATCATTGC3'；35S-R：5'GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC3'；预期扩增片段大小为195 bp。
5.20.4 cry1Ac基因、cry1Ab基因、以及cry1Ac与cry1Ab融合基因序列通用引物cry1A-F：5’ GAAGG T TTGAGCAATCTCTAC 3’；cry1A-R：5’ C G ATCAGCCTAGTAAGGTCGT 3’；预期扩增片段大小为340 bp。
5.21引物溶液。
用TE缓冲液〔pH8.0〕分别将上述引物稀释到10 µmol/L。
