HPLC法测定冬虫夏草中核苷类成分的含量
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HPLC法测定冬虫夏草中核苷类成分的含量陈亚丽1，洪妍1，李继平1，师志强1，陈宇1，薛志远1，刘慧彬2，封士兰(1.兰州大学药学院，兰州730000;2.甘 肃原野农庄农牧科技开发有限公司，兰州730000)摘要：目的建立用H P L C法测定不同方法（熏干、新鲜和阴干）处理冬虫夏草样品中核苷类成分（腺苷、尿苷、肌苷、鸟苷和胸苷）含量的方法.方法样品用纯化水超声提取，流动相为曱辱-水，梯度洗脱，柱温：30 °C，流速：1.0m L. min \结果虫草中含有的5种核苷标准曲线的相关系数均在0. 999 0以上，精密度检测R S D值为0. 31%〜1. 95%(n=5)，重复性检测R S D值为 0. 50%〜2. 56 % (n= 5)，回收率在99. 46 %〜100. 11 %之间。
结论该方法灵敏、简便、快速、准确、重复性好，能有效测定虫草中核苷类成分的含量，可为评价虫草的质量提供依据。
关键词：冬虫夏草；腺苷；尿苷；高效液相色谱法；含量测定D O I：10. 3969/j. issn. 1004-2407. 2017. 04. 003中图分类号：R927. 2 文献标志码：A 文章编号：1004-2407(2017)04-0403-04Determination of nucleosides in Cordyceps sinensis by HPLCC H EN Yali1, H O N G Yan1, LI Jiping1 ,S H I Zhiqiang1,C H E N Yu1 ,X U E Zhiyuan1, LIU H uibin2 , FEN G Shilan1* (1. College of Pharm acy, Lanzhou U niversity, Lanzhou 730000,C hina；2. Gansu Yuanye Farm ing and H usbandry Technology Development Limited Com pany, Lanzhou 730000 ,China)A bstract：To determ ine the content of nucleosides (adenosine? uridine? inosine? guanosine and thym idine) in Cordyceps sinensis samples processed using different m ethods (sm oked dry, fresh, dried) by H PLC. The samples were extracted with purified water. The mobile phase was methanol-water, the column temperature was 30 °C and the flow rate was 1. 0 mL*min 1.T he calibration curves for the 5 nucleosides in Cordyceps sinensis displayed a good linear relationship w ith correlation coefficients above 0. 999 0. T he precision relative standard deviations (RSD) and the repeatability RSD of 5 standards were 0. 31%-1. 95 % (n = 5)，0. 50%-2. 56%(n=5)，respectively. T he recovery rate was in the range of 99. 46%-100. 11%. This method is sensitive，sim ple，rapid，accurate and w ith good reproducibility so it can be used for the determ ination of the nucleosides in C ordyceps sinensis and provided an experim ental basis for evaluating different C ordyceps sinensis more comprehensively.Key w ords：C ordyceps sinensis ;adenosine; uridine; H PLC; determ ination冬虫夏草（Corc?；y c e外)简称虫草，系麦 角菌科虫草属真菌冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫 幼虫上的真菌子座及幼虫尸体的复合体[1]。
虫草主 要分布在我国青海、西藏、四川和云南等海拔3 000 m以上地区，是我国特有的珍稀名贵药材，现代药理 学研究表明，虫草具有抗癌、抗氧化、抗糖尿病、抗衰 老、调节免疫和调节肝肾功能等生理活性％7]。
主要 含多种氨基酸、核苷类(腺苷、尿苷、肌苷、鸟苷和胸苷 等）、虫草多糖、虫草留醇、生物碱及微量元素等成分[812]。
其中核苷类成分是虫草的主要活性成分，尤 以腺苷具有明显的药理作用[13]。
测定虫草中腺苷等 核苷类物质含量的方法，主要有薄层色谱法[14]、H P L C法[15-19]、毛细管电泳法[2°]、质谱分析（M S)及 液质联用（LC-M S)等™。
目前，H P L C法在含量测 定和质量检查方面应用很广[^3]，尽管测定虫草中核 苷类物质含量的方法较多，但H P L C法最常用。
在2015年版《中国药典》中，腺苷被作为虫草的 质量控制指标[1]。
目前，对虫草的研究主要集中在不基金项目：甘肃省科技计划项目（编号：1506RJZA316)作者简介：陈亚丽，女，硕士研究生通信作者：封士兰，女，教授，博士生导师同产区及其制剂中所含化学成分种类和含量的差异。
新鲜虫草个大饱满、色黄，阴干的虫草个小、色较 深，而熏干虫草与新鲜虫草的大小、颜色基本一致。
民间普遍认为新鲜虫草较阴干和熏干虫草疗效好，但 关于新鲜虫草的研究报道很少，因此本文研究不同处 理方法得到的虫草样品中所含化学成分的差异，试图 从化学成分的角度阐述其不同。
用H P L C法测定了 虫草样品中核苷类成分的含量，并对不同方法处理虫 草样品中核苷类成分的含量进行对比，为评价虫草质 量及资源合理开发利用提供依据。
1仪器与试药1.1 仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪，W at e r s 2996 型紫外 检测器 ，717 自动进样器，Millennium 32 色谱 管理站（美国 Waters 公司 ）； S a r t o r i u s BS224S型电子分析天平、S a r t o r i u s BP211D型电子 分析天平（德国赛多利斯集团）；K Q-400D B型数控超 声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；D K-98-l型 电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；D H G-9075A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学 仪器有限公司）。
1.2试药腺苷对照品（批号110879-200202)、尿苷 对照品（批号887-200202)、肌苷对照品（批号140669-201305)、鸟苷对照品（批号111977-201501)和胸苷对 照品(批号101215-201401)，均购自中国食品药品检定 研究院；甲醇为色谱纯(山东禹王实业有限公司化工公 司）；高纯水(用M i l i p o r e 2Q超纯水系统制得）。
虫草样品19批：熏干虫草样品（1〜3号甘肃渭 河源生物工程有限公司新鲜虫草样品(4〜10号青 海海南州，11号西藏林芝）；阴干虫草样品(新鲜虫草 室温阴干：12〜18号青海海南州，19号西藏林芝）。
以上虫草经兰州大学药学院吴争荣老师鉴定，均为麦 角菌科虫草属真菌冬虫夏草菌(Berk. )Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的真菌子座和幼虫尸体的干燥复合体。
2方法与结果2.1 溶液的制备2.1. 1供试品溶液的制备取虫草样品，粉碎，精密 称取1.0 g，置于干燥的具塞三角瓶中，加入纯化水10 m L，超声提取（提取功率为40 kHz，时间40 min，温度25 °C)，重复3次后，合并提取液，过滤，55 °C水浴 蒸干得残渣，将残渣用体积分数为50%的甲醇溶解并 移至10 m L量瓶中，加体积分数为50%的甲醇稀释至 刻度，摇匀。
用0.22 微孔滤膜过滤，即得。
2.1.2 混合对照品溶液的制备分别精密称取腺苷、尿苷、肌苷、鸟苷和胸苷对照品，用体积分数为50%的甲醇配制成质量浓度分别为107,500,490, 530和470 • m L1的对照品储备液。
分别精密吸取各溶液适量，加体积分数为50%的甲醇，稀释成腺 苷、尿苷、肌苷、鸟苷和胸苷质量浓度分别为10. 7, 500. 0,49. 0,53. 0和4. 7 pg^mL 1的混合对照品溶 液。
2.2 色谱条件色谱柱：迪马公司Diam onsil (318柱 (250 m m X4. 6m m，5p m);迪马公司 C18保护柱（10 m m X4. 6m m，5p m)。
流动相A为甲醇，B为水溶 液。
流速：1. 〇m L •m in1 ;柱温：30 °C;进样量：10 p L;检测波长：260 n m。
采用梯度洗脱（0〜20 m in，5%A;20 〜26 m in，5%〜10%A;26 〜31 m in，10%〜40 %A)。
2.3 方法学考察2.3.1线性范围精密吸取2. 1.2项下制备的混合 对照品溶液1〇，15,20,30,40和80 ML，分别进样，按 照2. 2项下色谱条件进行测定。
以质量浓度为横坐 标Or)、峰面积为纵坐标(3〇,绘制标准曲线，腺苷、尿 苷、肌苷、鸟苷和胸苷的回归方程依次为1=22 129x一 16 553? y=27695x 一 29 383? y=13978x 一19 383，^=18 533x + 4 244 和 3^=18 408x —86 059;厂值依次为 〇.999 1，0.999 3,0. 999 4,0. 999 2和 0. 999 4。
腺苷、尿苷、肌苷、鸟苷和胸苷的质量浓度分别在1.44〜201. 80,700〜3 300,31〜161，6〜309 和 6.2 〜17.0 pg •m L1的范围内与峰面积呈良好的线性关系。
