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高效液相色谱法测定人工虫草中腺苷和腺嘌呤的含量摘要：目的：建立HPLC法测定虫草中的腺苷和腺嘌呤的方法。
方法:采用高效液相法，Kromasil C18色谱柱(4.6 x 150mm,5µm)，流动相为1%乙酸甲醇-乙腈(V/V)，流速0.9ml.min-1,检测波长为2600nm。
结果:腺嘌呤在0.59-1.18 mg/mL（r=0.9998）范围内峰面积与浓度呈良好线性关系，平均加样回收率为97.5%，RSD=2.32%（n=6），腺苷在1.47-2.94mg/mL（r=0.9998）范围内峰面积与浓度呈良好线性关系, 平均加样回收率为96.5%，RSD=1.37%（n=6）,结论:该方法操作简便、灵敏度高、重现性好、专属性强，适用于人工虫草腺苷及腺嘌呤含量的测定。
为人工虫草在临床医学应用及新药开发提供了基础研究数据。
关键词: 高效液相色谱法；虫草；腺苷；腺嘌呤；含量[中图分类号] R-33 [文献标识码] A 文章编号：冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌 Cordyceps sinensis (Berk) Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体[1],为我国传统名贵中药材,主产于西藏、青海的高寒草甸。
近年来,由于对野生冬虫夏草的过度采挖,导致虫草资源逐渐枯竭,人工虫草的培育研究应运而生。
人工北虫草又称北冬虫夏草、蛹虫草(Cordyceps militaris),是从天然北虫草分离得到的菌种拟青霉(Paecilomyces militaris)经人工培养所获得的子实体,与冬虫夏草同属异种。
据报道人工发酵的菌丝体产物，其化学成分与天然虫草基本相似[2]。
中国药典2005年版把腺苷作为冬虫夏草的定量指标[3].已有一些文献报道使用HPLC方法测定虫草中核苷类成分[4-6]。
为了考察人工虫草菌粉的质量，本实验应用HPLC，在相同色谱条件下测定人工虫草菌粉中腺苷和腺嘌呤的含量。
虫草素及虫草酸提取及含量测定实验方案一，实验目的虫草素、腺苷是蛹虫草的重要活性成分，虫草酸也是虫草的重要组成成分。
对大米培养基培养出的虫草子实体，和活体蚕蛹培养出的虫草子实体在加热干燥和冷冻干燥两种条件下，进行虫草素、虫草酸及腺苷的提取及含量测定。
分析大米培养基是否与活体蚕蛹在培养虫草方面有差异，检验干燥的方式是否对虫草素、腺苷、虫草酸的提取有影响。
二，实验材料两种虫草子实体（大米培养基，蚕蛹）三，实验3.1仪器与药品甲醇色谱纯、乙氰色谱纯、虫草酸标准品、腺苷标准品、虫草酸标准品；HPLC相关仪器。
水为超纯水。
3.2提取方法虫草素、腺苷、虫草酸均采用水超声提取法3.2 提取过程精确称取干燥至恒重的两种虫草子实体（粉碎过0.25mm 筛）各0.2g，加水20ml超声提取50min，过滤，滤液经冷冻干燥后定容至5ml，最后过0.22μm滤膜，保存备用。
3.3标准工作液配制精密称取虫草素、腺苷、虫草酸对照品适量,加超纯水,超声波震荡溶解,最后定容分别配制成0.1、0.2g/L，虫草酸1.0 g/L的标准储备液备用．3.4 测定方法采用高效液相色谱法（HPLC法）测定3.5 色谱条件虫草素、腺苷：流动相为甲醇（A）与水（B），采用梯度洗脱，洗脱程序：O-5min ，2%A；5-10min，2-12%A；1O-12min，12-15%A； 12-30min，15%A。
色谱柱为汉邦C18柱(4.6mm×250mm，5μm), 检测波长为260nm,柱温为30℃，流速1mL/min，进样量20μL。
虫草酸：色谱柱为汉邦C18柱(4.6mm×250mm, 5μm) , 柱温30℃。
流动相: 乙腈∶水(体积比80∶20) , 等度洗脱, 流速0.8mL/min, 柱温30 ℃。
检测器为waters2414示差折光检测器(RID) , 进样量20μL。
四，实验结果4.1 虫草素、虫草酸、腺苷等的标准曲线精密量取虫草素标准品1,2,5,10,20，40μL进样分析；量取腺苷标准品0.5,1，2.5,5,10,30μL；量取虫草酸标准品12,18,24,30,36,40μL通过计算获得虫草素、腺苷、虫草酸标样的进样量与峰面积的线性回归方程。
图4 不同倍体中华芦荟形态特征比较1.四倍体2.二倍体3 讨论3.1 芦荟繁殖一般用侧芽插条进行,但是生根时间长,出侧芽系数小,不能满足大面积栽培和推广。
如用组织培养快速繁殖法,1年内可培育出数以万计的植株。
3.2 利用快繁技术,不仅可缩短育种年限,而且可使新品种在短时期内得以推广应用。
3.3 中华芦荟、库拉索芦荟及其4倍体都可在MS +2.0mg・L-162BA+0.2mg・L-1NAA的培养基中分化成苗,并快速增殖。
3.4 利用秋水仙素作诱导剂,在无菌条件下采用浸泡处理可培育出多倍体。
其中以丛生芽浸入0.5%的秋水仙素溶液24h效果最好,不但诱导率高(50%),且获得的多倍体纯合体与嵌合体比为9∶1。
3.5 由于药用植物多倍体育种对增加产量和化学成分含量,对培育具有利生物学特性的新品种,具有极大的潜力。
而药用芦荟多倍体育种至今还属空白。
因此,我们希望对中华芦荟和库拉索芦荟进行多倍体诱导,获得多倍体植株,经过进一步的研究,选育优质、高产量的芦荟新品种。
[参考文献][1] 肖志艳.芦荟属植物的化学成分.国外医药・物药分册,1991,16(5):292.[2] 张镜清.芦荟.生物学通报,1999,34(11):44.[3] 谢启昆.药用植物组织培养.上海:上海科学出版社,1985.125.[4] 袁阿兴,康书华,覃 凌.斑纹芦荟中芦荟苦素的分离鉴定.中国中药杂志,1991,16(5):292.[责任编辑 王康正]不同产地冬虫夏草腺苷含量的测定夏文娟1,曾晓英2,袁海龙3,尹定华1,杨大坚1,秦松云1,肖小河3(1.重庆市中药研究院,重庆 400065;2.广东太阳神集团公司,广东广州 510620;3.中国人民解放军第302医院药学部,北京 100039)[摘要] 目的:评价不同产地冬虫夏草的药材内在质量。
方法:以腺苷含量作为评价冬虫夏草内在质量的主要指标,以高效液相法测定来源于13个产地的优质冬虫夏草的腺苷含量。
山东蚕业2009年第2期高效液相色谱法测定虫草中虫草素和腺苷含量的研究*施新琴 顾寅钰 张亚平 刘志斐 李化秀(山东省蚕业研究所)虫草历来为传统名贵中药,其中最著名的有冬虫夏草C.sinensis(Ber kely)Sacc和蛹虫草Cordyceps m ilitaris(L.exFr.)L i n k2种,虫草中所特有的虫草素、虫草腺苷和虫草多糖等活性物质一直是专家学者争相研究的热点。
虫草素因其能干扰细胞RNA和DNA的合成,抑制不正常细胞(癌细胞)的分裂并能作为区别细胞中不同的RNA聚合酶的工具,具有抗肿瘤、抗病毒等方面的作用,由此引起医学界的高度重视。
虫草腺苷则在抗病毒,抗菌,预防治疗脑血栓、脑溢血,抑制血小板积聚,防止血栓形成,消除面斑和抗衰防皱等方面效果较佳。
虫草中虫草素和虫草腺苷含量均偏低,提纯其活性成分可以更好的开发利用虫草,因此快速、准确的检测虫草素和虫草腺苷含量至关重要。
陈千良、孙诗清、汪宇和张莉等人分别作了相关的研究,但普遍存在分离效果不佳、可靠性不够理想以及目标峰保留时间太长等缺点,故在应用普及方面受到了较大限制。
为此,我们在借鉴夏敏等方法的基础上进一步优化色谱条件,建立了新的反相高效液相色谱法测定虫草素和虫草腺苷,并用该方法测定了北虫草的虫草素和虫草腺苷的含量,取得了较为理想的效果。
1 材料与方法1.1 材料及主要试剂和仪器材料:本研究室培育的蚕虫草样品,经80 烘干,粉碎,过80目筛后,-20 冷冻保存待测。
试剂:虫草素标样(SI GMA),虫草腺苷(常州大康);四氢呋喃(色谱纯),甲醇(色谱纯); KH2PO4,K2H P O4、乙醇均为分析纯,试验用水为自制双蒸水。
仪器:高效液相色谱仪(大连依利特), WATERS NOVPAK-C18色谱柱(5 m 40c m);超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司生产);格兰仕微波炉;0.2 m滤膜,25 L 微量进样器。
1.2 方法1.2.1 虫草素和虫草腺苷的提取:准确称取虫草样品0.1g,加入双蒸水1mL,涡流1m i n,微波中高火提取1m i n,静置得虫草素、虫草腺8*资助项目:山东省农业科学院青年基金项目(编号2007YQN023)2009年第2期山东蚕业苷提取液,过0.2 m 滤膜得待测液。
十八．虫草素和腺苷的测定(高效液相色谱测定方法)本方法适合食品中虫草素和腺苷的含量的测定本方法检测限：食品中虫草素和腺苷为6.0mg/kg。
（一）方法提要试样中的虫草素和腺苷经提取后在ODS色谱柱上分离，根据保留时间定性，用二极管阵列检测器来测定虫草素和腺苷的含量。
（二）仪器1. 高效液相色谱仪带二极管阵列检测器。
2. 超声清洗仪。
3. 天平（精确到0.001g和0.0001g）。
4. 微孔滤膜（PVDF 0.45 μm）。
（三）试剂1. 色谱用水（Millipore纯水器制备）。
2. 甲醇（色谱纯）。
3. 提取液：蒸馏水+甲醇=50+50(V+V）。
4. 虫草素和腺苷对照品，Sigma公司(纯度≥99%)。
5. 虫草素标准溶液和腺苷混合标准溶液（25.0µg/mL）：精确称取25mg虫草素和25mg腺苷,用提取液定容至100.00mL，即得虫草素和腺苷标准储备溶液。
稀释10倍后得虫草素标准溶液和腺苷混合标准溶液。
（四）测定步骤1. 样品处理：①固体样品：称取0.2g(精确到0.1mg)于50mL容量瓶中，加入40 mL提取液，超声30min，取出，冷却后用提取液定容到50 mL，摇匀经0.45µm滤膜过滤，清液待分析。
②液体样品：取均匀试样10mL(精确到0.1 mL)置于50 ml容量瓶中，加入甲醇10 mL，混匀，超声30min，取出，冷却后用提取液定容到50 mL摇匀经0.45µm滤膜过滤，清液待分析。
2. 标准工作曲线制作。
精密吸取虫草素和腺苷混合标准溶液（25.0µg/mL）1.0 mL，10.0 mL分别置于100mL容量瓶中，用提取液定容到100mL，摇匀，得到0.25µg/mL，2.50µg/mL虫草素和腺苷混合标准溶液。
分别取10μL0.25µg/mL，2.50µg/mL，25.0µg/mL 标准工作系列溶液进样分析，以测得的虫草素和腺苷的峰面积，分别对虫草素和腺苷的浓度绘制标准曲线。
HPLC法测定冬虫夏草发酵菌丝粉中腺苷的含量范志华1，汤卫华2，林霖1（1.天津农学院食品科学系，天津 300384）（2.天津现代职业技术学院，天津 300222） 摘要：研究高效液相色谱法测定虫草发酵菌丝粉中腺苷含量的方法，对检测波长、流动相比例、图谱的特性、回收率及样品的超声波前处理等进行了讨论。
实验表明：在反相键合的ODS Hypersil（5 µm，125×4 mm）色谱柱上，以0.06 mol/L磷酸二氢钾-甲醇-四氢呋喃（150:10:1.5, v/v/v）为流动相，检测波长UV260 nm，平均回收率为99.11 %。
该方法灵敏度高、选择性好，样品前处理方法简单快速，回收率符合试验要求。
关键词：腺苷；HPLC法；冬虫夏草发酵菌丝粉中图分类号：R282；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2007)07-0094-04Determination of Adenosine Content in Zymolytic Powder of Aweto byHPLCFAN Zhi-hua1, TANG Wei-hua2, LIN Lin1（1.Department of Food Science , Tianjin Agricultural College ,Tianjin 300384, China）（2.Tianjin Modern V ocational Technology College, Tianjin 300222, China）Abstract: The method for determination of adenosine in zymolytic powder of aweto was studied. The detecting wavelengt h, proportion of mobile phas e, chromatography mapping characte r, adenosine recovery ratio and the ultrasonic pretreatment were discussed. Reslutes showed that, using a reverse-phase bonded ODS Hypersil column（5 µm,125×4 mm）, the most suitable mobile phase and detecting wavelength were 0.06 mol/L KH2PO4- methanol-tetrahydrofuran（150:10:1.5）and 260 nm, respectively, under which the average recovery was 99.11 %. The method was very sensitiv e and selective and the pretreatment method was simple and fast.Key words: adenosine; HPLC; zymolytic powder of aweto冬虫夏草（Cordyceps sinensis）为中国特有的虫生真菌，因其具有调节免疫、抑制肿瘤、降血压血脂、平喘祛痰、治疗高血糖症、肝脏疾病及改善肾功能等多种作用而作为传统名贵药材[1]。
摘要目的：建立用HPLC 法测定冬虫夏草及含片中腺苷的含量。
方法：C18(4.6mm× 250mm,5um)色谱柱，0.05mol L·-1磷酸二氢钾+甲醇(90+10)为流动相，流速为 1.0ml·min-1 检测波长260nm，柱温为35℃。
结果：腺苷含量在0.005～0.2ug(r=0.9998)范围内呈良好的线性关系。
平均回收率为99.49%，RSD=1.47%。
结论：方法准确可靠、、结果稳定、重现性好，分析速度快，可有效控制制剂的质量。
关键字：HPLC；冬虫夏草菌粉；含片；腺苷；DADAbstractObjective: to determine the content of adenosine Cordyceps powder andtablets by HPLC method. Methods: kromasil--C18 ( 4.6mm × 250mm ,5um) column, using methanol two hydrogen 0.5mol ? L-1 phosphoric acid (90:10) as mobile phase, thef low rate was 1.0ml ? min-1, the detection wavelength was 260nm, the column temperature was 35℃. Results: adenosine in 0.005 ~ 0.2ug (r=09998) showed a good linear relationship in the range of. The average recovery was 101.16%, RSD=1.47%. Conclusion: the method isConclusion: the method is accurate and reliable, strong specificity, results stability, good reproducibility, which can effectively control the quality of the preparation. Keywords: Cordyceps sinensis powder; tablet; adenosine; HPLC目录摘要 (I)Abstract ................................................................. I.I. ..1. 前言 (2)1.1仪器与试药..............................................2...2. 实验条件 (2)2.1供试品提取溶剂的选择.................................... 2...2.2检测波长的选择.......................................... 2...2.3流动相的选择............................................3...3. 试验方法与结果.............................................. 3...3.1分析溶液 (3)3.1.1 ..................................................................................................... 对照品溶液制备 ............................................ 3...3.1.2 ..................................................................................................... 供试品溶液制备 ............................................ 3...3.2色谱条件 (3)3.3分析方法学考察.......................................... 3...3.3.1 ..................................................................................................... 系统适应性试验 ............................................ 3...3.3.2 ..................................................................................................... 标准曲线绘制及线型范围考察 ................................. 4..3.3.3 ..................................................................................................... 精密度试验 ................................................ 4...3.3.4 ..................................................................................................... 重复性试验 ................................................ 4...3.3.5 ..................................................................................................... 稳定性试验 ................................................ 4...3.3.6 ..................................................................................................... 加样回收率试验 ............................................ 4...3.3.7 ..................................................................................................... 样品测定 .................................................. 5...4. 讨论 (5)4.1 (5)4.2 (5)4.3 (5)参考文献： (6)致谢 (7)1. 前言冬虫夏草，仅仅是我国190 多种虫草中的一种，也是中药传统的滋补药材。
冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，主要活性成分是虫草素，是中国特有的虫生真菌，其有调节免疫力功能、抗肿瘤、抗疲劳等功效。
在药理学现代研究结果中，青海冬虫夏草含有腺苷约7%，糖类28.9%，脂肪约8.4%，蛋白质约25%。
其中冬虫夏草中82.2%为不饱和脂肪酸［1］。
此外冬虫夏草中主要成分为腺苷，在2000 版中国药典［2］和文献报道［3］中均采用高效液相色谱法测定虫草中腺苷的含量。
在实际分析检测中其两种方法检测时，峰形对称性不佳，有一干扰峰且干扰严重，为了改善它对样品提取条件进行改进，取得了较好的效果，对冬虫夏草的质量控制提供了一定的技术依据。
分析实验采用HPLC（高效液相色谱法）［4，5］分离技术，性能未定，能快速、准确测定其含量，样品的预先处理方法简单易行。
1.1仪器与药品的选择（1）Agilent1100 高效液相色谱仪，配置在线脱气机、高压泵及梯度洗脱装置、自动进样器、C18（4.6mm×250mm,5um）色谱柱、光电二极管阵列检测器（DAD ）、Agilent 色谱工作站、JD—500E 超声波清洗器，优普超纯水机。
（2）腺苷标准品（上海永叶生物科技有限公司），水为UP 水，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
（3）冬虫夏草、冬虫夏草含片在青海省格尔木市冬虫夏草雪域专卖店购买。
2.分析测定前的准备2.1试验样品的预处理首先为了试验结果具有代表性，选择青海玉树品质优良的冬虫夏草。
冬虫夏草和含片通过研钵研成粉末，这样有利于30%乙醇提纯。
在样品预处理过程中应该防止引入其他杂质和腺苷含量的损失。
2.2试验提取样品溶剂的选择由于腺苷的含量较低，干扰成分多，曾采用药典方法及文献报道［2,3］的方法，用90%甲醇和15%甲醇提取，均分离不好，拖尾严重，后经多次实验，采用30%乙醇超声提取后，蒸干，进行检测，峰形的对称性比较好，并消除了腺苷峰的拖尾现象及干扰峰，取得了较好的分离效果。
2.3HPLC 检测器波长的选择取腺苷标准品溶液适量，调节波长在200~400nm 区间，在光电二极管阵列检测器中测出吸收光谱图，结果显示在260nm 处有最大吸收，因此选择260nm 为检测波长。
2.4流动相的选择利用药典方法中流动相：磷酸盐缓冲液（PH6.5）［取0.01mol·L-1磷酸二氢钠68.5ml 与0.01mol·L-1磷酸二氢钠31.5ml，搅拌均匀，调PH6.5］甲醇（17：3）及0.05mol ·L -1 磷酸二氢钾—甲醇为流动相，经过这两种流动相的试验，选择0.05mol ·L -1磷酸二氢钾—甲醇为流动相，以不同与比例进行反复试验，确定比例为（90:10）时峰形及出峰时间适宜。
3.测定方法及测定结果3.1 分析溶液3.1.1制备对照品的标准溶液准确称取腺苷标准品0.0160g（经五氧化二磷为干燥剂减压24h），再加入30%的乙醇溶液溶解，加入50ml 容量瓶中稀释至刻度线，摇匀，作为标准品储备液。
3.1.2样品溶液的制备准确称取冬虫夏草含片和菌粉各 2.0000g，分别准确加入30%的乙醇溶液10ml，密塞，称定重量，超声30min，放至室温，再称定质量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤。
