生物等效性实验生物样品处理注意事项严

生物利用度和生物等效性试验生物样品的处理和保存要求2004年5月 美国FDA发布2009年6月 药审中心组织翻译萌蒂制药有限公司翻译北核协会审核药审中心最终核准目录I. 引言 (1)II. 背景 (1)III. 抽样方法 (2)IV. 对多个研究和多次运送的保存 (3)V. 保留样品数量 (4)VI. 各种研究设置下的职责 (4)A 在CRO、大学、医院或医生诊所进行的研究 (4)B SMO参与的研究 (5)C 由SMO中参与的盲态药效学或临床终点研究 (7)D 研究申办者和/或药品生产商进行的企业内部研究 (8)E 体外BE研究 (9)VII. 吸入剂产品的例外情况 (10)词汇表 (11)生物利用度和生物等效性试验生物样品的处理和保存要求 I. 引言本指导原则旨在向研究申办者和/或药品生产商、合同研究组织（CRO）、中心管理组织（SMO）、临床研究者和独立的第三方机构提供以下方面的建议：按照21 CFR 320.38和320.63的要求，对相关生物利用度（BA）和生物等效性（BE）研究保留样品进行处理的方法。

本指导原则将强调以下内容：（1）将用于BA和BE研究的试验物质与参比标准品运送至研究机构的方法；（2）研究机构随机选择试验样品进行测试和选择原料作为保留样品材料的方法；（3）对保留样品进行保存的方法。

另外，本指导原则还对§§ 320.38和320.63中的要点进行了说明和强调。

FDA的指导原则文件（包括本指导意见）不属于法律强制性责任，而只是说明本机构，目前对本专题的看法，只能认为是一种建议，除非已经在特殊药政法规或法令要求中进行了说明。

审评机构指导原则中所使用的词汇“应该，should”的意思是建议的或推荐的、并非强制要求的。

II. 背景在19世纪80年代出现非专利药丑闻后，FDA于1990年11月08日联邦文件档中发布了一份关于保存BA和BE试验样品的暂行规定1。

发布日期20070918栏目化药药物评价>>综合评价标题生物等效性试验中几个需要关注的问题探讨作者魏春敏赵建中部门正文内容四部八室魏春敏赵建中生物等效性评价是指同一种药物的不同制剂在相同实验条件下，?予相同的剂量，判断其吸收速度和程度有无显著差异的过程。

通常的生物等效性研究是以药代动力学参数为终点指标，根据预先确定的等效标准和限度进行的比较研究。

如果两制剂含等量的相同活性成分，具有相同的剂型，符合同样的或可比较的质量标准，则只能认为他们是药学等效的，辅料和生产工艺的差异可能导致药物溶出或吸收行为的改变，从而造成治疗不等效，甚至导致安全性问题。

通过测量不同时间点的生物样本中药物浓度，得到的药物浓度-时间曲线可反映药物从制剂中释放吸收到体循环的动态过程，由此计算得到AUC、Cmax、Tmax等参数，反应了药物活性成分进入体循环的程度和速度，因此生物等效性研究是证实两制剂治疗等效性最客观的办法。

由于生物等效性评价是从受试制剂和参比制剂药代动力学参数的样本均数推断总体均数是否等效，同时，生物样本存在取样量少、药物浓度低、干扰物质多及个体差异大等问题，因此，试验设计、生物样本测定方法及统计分析等诸多环节均能影响生物等效性研究结果，2005年3月发布的《化学药物制剂人体利用度和生物等效性研究指导原则》提出了生物等效性研究应遵循的基本原则，但具体试验过程中常会遇到一些难以把握的情况，现就生物等效性研究中的几个需要关注的问题予以分析探讨。

一、试验设计：一般情况下，我国规定人体等效性试验可选择18～24例健康受试者，采用交叉设计的方法，对受试者例数，FDA和EMEA又有不同的要求，从表1可以看出，对于多数药物，18～24例即可满足80%的把握度要求，个体内变异大于30%的高变异药物则需增加样本量，采用重复交叉试验设计，提高把握度；长半衰期药物可采用平行试验设计，以缩短试验周期。

表1 平均生物等效性研究中不同变异度的样本含量估计(两制剂的真实差值Δ=0.05)80% PowersWT sD 2P0.15 0.01 120.10 140.15 160.23 0.01 240.10 260.15 300.30 0.01 400.10 420.15 44注：σWT表示个体内变异；σD表示源于药物制剂和受试者间交互作用的变异；2P为2周期交叉试验；4P为4周期交叉试验；Power指统计检验的把握度。

生物利用度和生物等效性试验用药品的处理和保存要求技术指导原则（初稿）药品审评中心2012年10月目录一、引言.............................................................................................................. 错误!未定义书签。

二、背景.............................................................................................................. 错误!未定义书签。

三、抽样方法 (1)四、多个研究和多次提供情况下的样品留存 (2)五、留存样品的数量 (3)六、研究承担机构的职责....................................................................... 错误!未定义书签。

（一）在试验机构进行的临床研究 (4)（二）SMO参与的研究 (4)（三）在SMO中进行的盲法药效学或临床终点研究 (5)七、吸入制剂的例外情况 (6)生物利用度和生物等效性试验用药品的处理和保存要求技术指导原则一、引言本指导原则旨在向药品注册申请人、合同研究组织（CRO）、研究机构管理组织（SMO）、临床试验机构和独立的第三方机构提供生物利用度（BA）和生物等效性（BE）试验用药品处理和保存方法的建议。

本指导原则重点讨论以下内容：（1）用于BA和BE研究的试验用药品（包括受试制剂和参比制剂，下同）提供至药品临床试验机构（以下简称试验机构）的方法；（2）试验机构随机抽取用于临床研究的试验用药品和用于留存的试验用药品的方法；（3）留存试验用药品的保存方法。

二、背景在以前的BA和BE试验中，存在的常见问题是实施研究的试验机构未对试验用药品进行留样保存，在多数情况下，试验机构将试验剩余样品全部返回给注册申请人。

生物等效性试验生物等效性定义如下：在相似的试验条件下单次或多次给予相同剂量的试验药物后，受试制剂中药物的吸收速度和吸收程度与参比制剂的差异在可接受范围内。

以药动学参数为终点评价指标的生物等效性研究通常采用Cmax 和AUC进行评价。

生物等效的接受标准：一般情况下，Cmax和AUC 几何均值比值的90%置信区间数值应落在80.00%-125.00%范围内，对于窄治疗窗药物，应根据药物的特性适当缩小90%置信区间范围。

一个完整的生物等效性研究包括研究设计、生物样本分析、统计分析、结果评价四个方面内容。

生物等效性研究方法按照研究方法评价效力，其优先顺序为药代动力学研究、药效动力学研究、临床研究(以临床疗效为终点)和体外研究。

研究设计1、两制剂、单次给药、交叉试验设计；2、两制剂、单次给药、平行试验设计：适用于半衰期较长的药物；3、重复试验设计：适用于部分高变异药物（个体内变异≥30%）。

受试者选择1、年龄在18周岁或以上，同一批受试者年龄相差不宜超过10岁；2、如果研究药物拟用于两种性别的人群，一般情况下，研究入选的受试者应有适当的性别比例；3、为避免其他药物干扰，试验前两周内及试验期间禁服任何其他药物，试验期间禁烟、酒及含咖啡因的饮料；4、如果研究药物主要拟用于老年人群，应尽可能多地入选60岁以上的受试者；5、当入选健康受试者参与试验可能面临安全性方面的风险时，则建议入选试验药物拟适用的患者人群，并且在试验期间应保证患者病情稳定。

参比制剂的选择：1、尽可能选择原研产品；2、国际公认的同种药品，指在欧盟、美国上市并获得参比制剂地位。

给药方案：1、推荐采用单次给药药代动力学研究方法评价生物等效性；2、若出于安全性考虑，需入选正在进行药物治疗，且治疗不可间断的患者时，可选择多次给药；3、给药剂量一般应与临床单次用药剂量一致，不得超过临床推荐的单次最大剂量或已经证明的安全剂量。

食物影响1、通常需进行空腹和餐后生物等效性研究；2、如果参比制剂说明书中明确说明该药物仅可空腹服用（饭前1小时或饭后2小时服用）时，则可不进行餐后生物等效性研究；3、仅能与食物同服的口服常释制剂，除了空腹服用可能有严重安全性方面风险的情况外，均建议进行空腹和餐后两种条件下的生物等效性研究；4、如有资料充分说明空腹服药可能有严重安全性风险，则仅需进行餐后生物等效性研究；5、对于口服调释制剂，建议进行空腹和餐后生物等效性研究。

您现在的位置：电子刊物 >> 电子刊物列表 >> 电子刊物详细发布日期20110727栏目化药药物评价>>综合评价标题生物利用度及生物等效性研究中试验样品的提供与管理作者张玉琥部门化药药学二部正文内容生物利用度（BA）及生物等效性(BE)研究中的试验样品包括试验制剂和参比制剂。

试验样品的真实可靠是对试验研究结果进行评价的前提。

在药品注册涉及的BA及BE研究中，国内常见情况是注册申请人提供给试验机构（临床药理基地）的样品（包括试验制剂及参比制剂）仅可满足试验研究用量，即使使用后有剩余量，也常常由试验机构退还申请人。

对试验样品的这种提供和管理模式，使得试验样品的真实性及其监管核查无从保障。

为切实保证BA及BE研究结果的准确可靠、可追溯，有必要强化对相关试验样品提供和管理的要求。

对于BA及BE研究中试验药品如何提供和管理的问题，我国2005年颁布的《化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则》【1】中未专门讨论。

美国FDA于2004年5月颁布了关于BA及BE研究中试验样品处理及保存要求的技术指导原则《Guidance for industry-handling and retention of BA andBE testing samples》【2】，该指导原则中对试验样品的提供和管理有明确的要求。

在我国相关指导原则出台之前，建议注册申请人参照FDA指导原则的要求向试验机构提供样品，试验机构对样品的抽样和保留样品的保存也建议参照FDA的上述指导原则进行。

FDA指导原则中对试验样品的提供和管理要求主要有以下几点：1、样品提供量：申办人提供给试验机构的样品量除应满足试验研究需要外，尚应提供可满足全检需要量5倍的量用于留存作为保留样品， 监管机构可在必要时对保留样品进行核查和检验。

试验制剂及参比制剂的提供量均应满足留存保留样品的需求。

例如对于口服片剂或胶囊，试验制剂和参比制剂可各提供300片/粒。

生物等效性实验生物样品处理注意事项(严)生物等效性实验生物样品处理注意事项一、样品采集后的的处理和贮存鉴于生物样本的特点，为了避免样品中被测药物发生分解或产生其他化学变化，取样后最好立即进行分析测定，但实际工作中几乎无法做到，常需将收集到的样品冷藏、冰冻，临用前再融化并放至室温后使用。

在样本冷冻贮藏前，需及时进行处理。

1.1血液样本处理注意事项1.1.1. 在肌肉注射或静脉输含有葡萄糖或电解质(含钾、钠、氯离子)的液体时，建议3小时以后采集静脉血样本进行这些项目的检验，以防止上述检验项目因输液引起的假性升高。

1.1.2保定非麻醉状态的动物时应尽量避免用力挤压动物头颈和胸腹，以免引起血液淤滞，局部组织缺氧，造成血液某些成分的改变，特别是测定乳酸，血液含氧量等指标时。

1.1.3血液中红细胞内外成分有很大差异，溶血可造成红细胞内的物质向细胞外转移，如K+、Mg2＋和某些酶类(LD、AST、ALT、ACP)；另外，溶血还可干扰某些化学项目(TBil、DBil、TC等)的测定，严重影响结果的准确性，血样本应防止溶血。

引起溶血的原因有：注射器采血时抽吸力太大；血液与抗凝剂比例失调；混匀样本时过度振荡；注射器或采血容器带水或容器污染；全血放置时间长或突然受冷或受热；注射器中的血沫注入采血容器；真空采血时如未采满至相应刻度，残存负压造成红细胞破裂；不拔针头直接注入采血容器；样本离心时离心力过大等。

为避免溶血，取血时应注意：①、抽拉注射器时应尽量避免注射器内产生大量真空；②、添加抗凝剂后的容器在除必要干燥流程后应及时密封；③、混匀样本时避免用力过度，切勿产生泡沫；④、避免重复使用注射器、针头、采血管、毛细玻璃管等一次性用品，手术刀片和剪刀等器材取材时尽量洗去残留血液；⑤、采血时的室温应控制在22℃至25℃，采取的血液容器在需要放入冰盒时，切勿紧贴冰袋，冰水；⑥、当注射器内因吸入空气产生血沫时，注意弃掉血沫，在将血液注入采血容器时勿将血沫一并注入；⑦、使用真空采血管需抽取负压时切勿过量；⑧、将血液注入采血容器时要除去针头，轻柔推入；⑨、离心带有血细胞的血样时，按照规格设定离心参数；1.1.4. 正确选择采集管。

生物利用度和生物等效性试验生物样品的处理和保存要
求
1.生物样品的处理要求：
a.采集：生物样品的采集要在规定的时间、地点和条件下进行，避免外界因素对样品的影响，确保采集到具有代表性的样品。

b.样品预处理：在采集后的短时间内进行样品预处理，如去除杂质、洗涤或离心等操作，以保证样品的纯度和稳定性。

c.样品分装：根据试验需求，将样品分装成合适的容器中，并标明样品的有关信息，如采集时间、地点、编号等，以确保样品的追溯性和可识别性。

d.样品保存：根据试验要求和样品的特性，选择合适的保存方法，如冻存、干燥、固定等，以保证样品的稳定性和保存期限。

2.生物样品的保存要求：
a.温度控制：根据样品的特性和稳定性要求，选择合适的保存温度，如低温冷藏、冷冻、常温等，避免样品的降解和变质。

b.保存容器：选择符合试验要求的保存容器，如玻璃瓶、塑料瓶或离心管等，确保容器的密封性和稳定性。

c.光照控制：对于光敏性物质或试验要求不受光照影响的样品，需进行黑暗保存，避免光照对样品的损害。

d.资料记录：对于每个样品，应建立详细的资料记录，包括样品的有关信息、采集和处理过程的操作记录等，以便对样品进行追踪和溯源。

需要注意的是，不同类型的生物样品可能具有不同的处理和保存要求。

例如，对血液样品的处理和保存可能需要防止血液凝结和氧化；对细胞样
品的处理和保存可能需要注意细胞的冻存和复苏过程等。

综上所述，生物利用度和生物等效性试验生物样品的处理和保存要求
是确保试验结果准确和可靠的关键步骤。

通过遵循适当的处理和保存方法，可以保证样品的稳定性和保存期限，以及样品信息的追溯性和可识别性，
从而为试验结果的准确性提供保证。

生物等效性试验的样本来源多为血样或尿样，所含的药物浓度较低，内源性干扰成分多，目标药物多与蛋白结合或呈缀合状态，在整个试验过程中，样本测定周期长，测试工作量大，因此其分析方法学的要求与一般的药物分析方法相比具有其自身的特点，我们在建立方法学时，应注重以下几个方面：一、样品采集后的的处理和贮存鉴于生物样本的特点，为了避免样品中被测药物发生分解或产生其他化学变化，取样后最好立即进行分析测定，但实际工作中几乎无法做到，常需将收集到的样品冷藏、冰冻，临用前再融化并放至室温后使用。

在样本冷冻贮藏前，需及时进行处理。

血浆和血清都需要在采血后及时分离（24小时内），若不及时分离，血凝后再冰冻保存，则因冰冻时引起细胞溶解，阻碍血浆或血清的分出，同时因溶血而影响药物浓度变化。

尿液主要是水、尿素及盐类，是很好的细菌生长液，因此应在取样后立即测定。

不能立即测定时，应于4℃冷藏，如在室温保存，则应在采样后的尿液中加入少量防腐剂甲苯（1%）或氯仿（饱和）。

生物样品中的一些不稳定的药物（如普鲁卡因、丙酸、红霉素、阿糖胞苷），易受血浆酯酶水解的影响，当采好样品之后应立即加入酯酶抑制剂氟化钠、三氯醋酸等，防制药物分解。

易氧化的药物（如儿茶酚类、阿扑吗啡等）一般直接在-15℃仅能保存4周；若样品中加入维生素C或其他抗氧剂，则可稳定10周。

生物样品在采样、贮存与分析过程中都应注意可能造成样品的损失或污染，以免将污染物作为药物新的代谢物。

二、生物样本贮存期间的稳定性考察由于生物等效性试验样本从采样到检测的周期通常需要几周至几个月，在其贮存期间目标药物的稳定性需经考察验证。

含药样本稳定性是指样品中的药物从采样至测定时性质和含量的稳定程度，它是贮存条件、药物的化学性质、空白生物样品和容器系统的函数，在特定的容器和生物样品中待测物的稳定性不能外推至其他系统。

生物样本稳定性的评价应考察：1、短期室温稳定性：要求高、低浓度样本在4~24 h内稳定。

生物样品的的处理方法1生物样品的种类头发、血液、尿液、水、食品、环境样品等2生物样品的采集、保存与储藏头发：据文献介绍，人发中微量元素的纵向浓度分布是有规律的，从头部不同区域采集的头发其测定结果均不相同。

一般采集枕部近头皮2-3mm处长1cm 左右的人发为待处理样品。

一般取0.5-1克，发样采集简单，无损伤，样品中微量元素含量高，具有易分析、易保存等特点。

为防止保存中细胞等作用影响样品的有效性，对原发样沾污的油垢、水分、尘粉，必须洗干净，干燥后保存。

同一检测中要采用同样的洗涤条件和方法，这样测的结果才有可比性。

所需头发为0.1克。

血液采血具有损伤性，取量有限，能反映微量元素吸收代谢和环境情况。

因此，血液是临床上最常用的样品。

早上空腹时人体生物学因素比较恒定。

血样采集一般在清晨受检者空腹时，用一次性注射器抽取肘部静脉血做血样。

取血液2ml左右放入试管内，置于37℃水浴中保温30分钟后，经3000转/分离心10分钟，分离出血清备检。

若需保存只能在4℃冷藏，只有在-20℃冷冻或-80℃超低温冷冻才能保存较长时间。

冷藏或冷冻的样品必须恢复到室温后才能取样。

尿液尿是代谢的最终产物，尿中微量元素受饮食、药物、运动、气温、环境等影响显著，日内、日间、季节变化很大。

尿样采集方便，无损伤性，样品量大。

在部分尿中，以晨尿为佳，晨尿是受检者夜间代谢产生的，24小时最浓。

3样品的消化待测样品的前处理是进行微量元素测定的前提，如果试样的采取、制备时失去了代表性，分解时造成污染或损失，将会给分析结果带来难以估量的误差。

同时，样品没有适当的前处理，测量工作也无法进行。

前期处理的方法很多，该仪器研制的处理方法比较简单，有的甚至不用前处理。

为方便用户，现将常用的尿液、血液和头发的前处理方法简述如下，供用户参考。

3.1 尿液的消化一次性或者收集24小时的尿量（便于进行计算），准确移取尿液10.0ml于50ml烧杯中，加入混酸(HNO3:HClO4=10:1)2ml,摇匀，加盖，放置5-10分钟后，低温加热至微沸，消化至近干，加两滴浓H2SO4继续升温消化至无色，冷却至室温，滴加少量蒸馏水溶解残留物，将其完全转移至10ml干净试管中,置于消化炉，加热赶去多余的HNO3两次，每次都达近干，取下冷却至室温，最后准确加入蒸馏水1.0ml 溶解残留物，摇匀，待测定。

2021年1月第11卷第2期CHINA MEDICINE AND PHARMACY Vol.11 No.2 January 2021216·工作探讨·生物等效性试验质量管理的思考和实践刘 琳 何　艳▲ 曾　忱 曾　艳 陈　璐 周　岩 熊　芸贵州医科大学附属医院药物临床试验机构办公室，贵州贵阳 550002[摘要] 生物等效性试验是评价制剂质量的重要指标，有效的质量管理策略和措施是生物等效性试验设计和实施的重要考量。

在某三级甲等医院生物等效性（预）试验质量管理中，常见以下问题：受试者不能完全依从方案、试验药物管理记录不完善、生物样本采集与管理违背方案或记录不详细、仪器设备管理不规范或记录不完整、试验数据记录不准确或逻辑不清。

加强研究团队成员的沟通协作、完善制度文件体系建设、充分准备试验物资、细化试验操作程序并详细记录数据，有助于减少质量问题，提高试验实施质量，保证临床试验数据真实、可靠。

[关键词] 生物等效性试验；质量管理；临床研究机构；策略[中图分类号] R969 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2021）02-0216-03Ponderation and practice on the quality management of bioequivalencestudyLIU　Lin HE　Yan ZENG　Chen ZENG　Yan CHEN　Lu ZHOU　Yan XIONG　Yun Office of Drug Clinical Trial Institution, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guizhou, Guiyang 550002, China[Abstract] Bioequivalence study is an important index to evaluate the quality of preparations, and effective strategies and measures of quality management are important considerations in the design and implementation of bioequivalence studies. The problems frequently arising in the quality management of bioequivalence (pre) studies in grade 3A hospital: the subjects cannot fully comply with the protocol ; the test drug management records are incomplete; the collection and management of biological samples violate the protocol or the records are not detailed; the management of instruments and equipment is not standardized or the records are incomplete; the records of test data are inaccurate or unclear. Strengthening the communication and cooperation among the members of the research team, perfecting the system construction of institutional documents, fully preparing test materials, refining test operation procedures and recording data in detail help to reduce quality problems, improve the quality of implementation of bioequivalence studies, and ensure the authenticity and reliability of the data.[Key words] Bioequivalence study ; Quality management; Clinical research institution; Strategy生物等效性试验是为了比较受试制剂与参比制剂的相对生物利用度，根据药代动力学参数与接受范围判定两者是否生物等效的临床试验，用以桥接参比制剂相关的临床前和临床试验，是评价制剂质量的重要指标[1]。