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DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.008·综述·Hsp90抑制剂的研究进展张钟元，阎爱侠Hsp90 是最丰富的热休克蛋白，它广泛存在于真核以及原核生物中。
Hsp90 的主要作用是帮助其客户蛋白正确折叠和降解，这些客户蛋白中有许多是在癌症发生中起到重要作用的激酶和转录因子。
还有许多客户蛋白对于其他疾病的发展都是必不可少的，包括阿尔茨海默病和其他神经退行性疾病以及病毒和细菌感染。
Hsp90 抑制剂通过与Hsp90 调节位点结合引起Hsp90 构象改变，并诱导底物蛋白降解，从而发挥抑制作用。
虽然目前还没有Hsp90 抑制剂被批准上市，但是以Hsp90 为靶点进行抑制剂的开发仍然具有重要意义，本文主要对其抑制剂的抗肿瘤活性研究进展进行综述。
1 Hsp90 的结构特点Hsp90 是高度保守的ATP 依赖性热应激蛋白，其表达是由应激相关转录因子热休克因子1（HSF1）诱导的，在应激耐受性和蛋白质折叠中起着非常重要的作用[1]。
它是维持、激活或折叠特定客户蛋白质的必需分子伴侣，这些客户蛋白中有许多是信号通路中重要的蛋白质，包括RAF 激酶蛋白、酪氨酸激酶受体2（ErbB2）、Cdk4 和类固醇激素受体等[2]。
在人源Hsp90 中已经鉴定出 4 种亚型：存在于胞质内的Hsp90α 和Hsp90β，存在于线粒体基质内的肿瘤坏死因子相关蛋白1（TRAP1）以及内质网中的葡萄糖调节蛋白94（Grp94）[3]。
所有亚型都包含一个保守结构，包括N 末端A TP 酶结合域、中间域以及C 末端结合域。
由于4 个亚型在细胞中的位置不同，所以它们各自结合的蛋白也不相同。
Hsp90 在细胞中以同源二聚体形式存在，每个单体由3 个结构域组成：一个N 末端结构域（NTD），一个中间域（MD）和一个 C 末端结构域（CTD）[4]。
NTD 是Hsp90 的主要ATP 酶结构域，与组氨酸激酶和拓扑异构酶具有高度的结构相似性。
HSP90和癌症治疗热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是一种功能强大的分子伴侣。
在抗癌治疗时能被诱导表达保护细胞在致命条件下存活。
现已证实HSPs可通过多种方式保护细胞，包括校正异常折叠的蛋白和抗凋亡等。
HSPs通常在癌细胞中过表达，而这种持续性的表达对于癌细胞的存活是必要的。
因此，HSP-靶象药物可能成为抗癌剂。
本文对癌症治疗中基于抑制HSP90蛋白的不同分子和方法进行综述。
标签：热休克蛋白；HSP90；癌症中图分类号R73 文献标识码 B 文章编号1674-6805(2012)17-0155-02热休克蛋白(HSPs)由一系列高度保守蛋白组成，它们在机体理化环境受到侵扰，包括抗癌治疗时表达，使细胞在致命条件下得以存活。
胁迫诱导的HSPs通过多种不同的作用机制保护细胞。
(1)作为分子伴侣，它们能够防止蛋白错误折叠发生聚集。
(2)HSPs是强有力的抗凋亡蛋白，能够与凋亡过程的关键效应因子发生相互作用，从而干扰不同阶段细胞的死亡。
(3)HSPs能够在胁迫条件下通过稳定或调节特异蛋白通过蛋白酶体的降解帮助细胞存活[1]。
癌细胞需要对其新陈代谢和信号传导途径进行广泛联控，因此它们必须借助于像HSPs这样胁迫诱导的蛋白，而这些蛋白对于正常细胞的存活是可以省略的。
因此，HSP90的表达和/或激活在癌细胞中处于异常的高水平，而且在高烧、氧化应激、酪氨酸激酶抑制、死亡受体Fas/Apo-1/CD95激活、辐射或细胞毒性药物等不同死亡刺激后的水平更高。
此外，HSPs的表达和癌细胞对化疗的抵制之间有很好的相关性。
在啮齿类动物模型中，HSPs的过表达能够促进肿瘤生长，增强其转化和抵制化疗的潜能。
反之，HSPs的消除和抑制通常能够减小肿瘤的大小，甚至是导致肿瘤彻底的退化。
临床研究表明，HSPs的高表达往往与临床治疗效果密不可分[2]。
1HSP90 的结构HSP90是广泛分布于真核细胞的伴侣蛋白。
浙江理工大学学报,第49卷,第5期,2023年9月J o u r n a l o f Z h e j i a n g S c i -T e c h U n i v e r s i t yD O I :10.3969/j.i s s n .1673-3851(n ).2023.05.009收稿日期:2023-01-18 网络出版日期:2023-06-07作者简介:刘文金(1995- ),男,甘肃天水人,硕士研究生,主要从事有机物合成方面的研究㊂通信作者:曹小冬,E -m a i l :s h e l d o n .c a o @e u b u l u s b i o .c o mH S P 90抑制剂前药设计及合成刘文金,曹小冬(浙江理工大学理学院,杭州310018) 摘 要:为解决热休克蛋白90(H e a t s h o c k p r o t e i n 90,H S P 90)抑制剂的周身毒性问题,自主设计并合成了两个H S P 90抑制剂的三肽前药P 1和P 2㊂以4-(2-羟乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯和1-(溴甲基)-4-硝基苯为起始原料,经羟胺缩合㊁硝基还原㊁关环等反应合成H S P 90抑制剂H S P 90i -1和H S P 90i -2;以L -脯氨酸和L -缬氨酸衍生物为原料,经缩合㊁脱保护㊁酰化等反应合成多肽连接子M 1㊂将H S P 90i -1㊁H S P 90i -2分别和M 1缩合,得到两个三肽前药P 1和P 2㊂1H N M R ㊁L C M S ㊁13C N M R 分析表征结果表明两个前药分子被成功合成㊂该研究具有使用的原料廉价易得㊁反应都在常温下进行㊁条件温和可控㊁总产率较高等特点,为多肽前药的设计及合成提供了新的思路和方法㊂关键词:H S P 90抑制剂;前药;缩合;酰化;多肽前药中图分类号:O 622.6文献标志码:A文章编号:1673-3851(2023)09-0604-08引文格式:刘文金,曹小冬.H S P 90抑制剂前药设计及合成[J ].浙江理工大学学报(自然科学),2023,49(5):604-611.R e f e r e n c e F o r m a t :L I U W e n j i n ,C A O X i a o d o n g .D e s i g n a n d s y n t h e s i s o f H S P 90i n h i b i t o r p r o d r u gs [J ].J o u r n a l o f Z h e j i a n g S c i -T e c h U n i v e r s i t y,2023,49(5):604-611.D e s i g n a n d s y n t h e s i s o f H S P 90i n h i b i t o r p r o d r u gs L I U W e n j i n ,C A O X i a o d o n g(S c h o o l o f S c i e n c e ,Z h e j i a n g S c i -T e c h U n i v e r s i t y ,H a n gz h o u 310018,C h i n a ) A b s t r a c t :T o s o l v e t h e p e r i p h e r a l t o x i c i t y pr o b l e m o f h e a t s h o c k p r o t e i n 90(H S P 90)i n h i b i t o r s ,w e d e s i g n e d a n d s y n t h e s i z e d t w o H S P 90i n h i b i t o r s ,P 1a n d P 2,a s t r i p e p t i d e p r o d r u gs .T h e H S P 90i n h i b i t o r s H S P 90i -1a n d H S P 90i -2w e r e s y n t h e s i z e d f r o m t e r t -B u t y l 4-(2-h y d r o x y e t h y l )p i p e r i d i n e -1-c a r b o x yl a t e a n d 1-B r o m o -4-n i t r o b e n z e n e b y t h e r e a c t i o n s o f h y d r o x y l a m i n e c o n d e n s a t i o n ,n i t r o r e d u c t i o n ,r i n gc l o s u r e ,e t c .T h e p e p t ide l i n k e r M 1w a s s y n t h e s i z e df r o m L -p r o l i n e a n d L -v a l i n e d e r i v a t i v e s b y th e r e a c t i o n s o f c o n d e n s a t i o n ,d e p r o t e c t i o n ,a c yl a t i o n ,e t c .H S P 90i -1a n d H S P 90i -2w e r e c o n d e n s e d w i t h M 1t o o b t a i n t h e t w o t r i p e p t i d e p r o d r u g s o f P 1a n d P 2.1H N M R ,L C M S ,13C N M R a n a l ys i s a n d c h a r a c t e r i z a t i o n r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e t w o p r o d r u g s w e r e s u c c e s s f u l l y s y n t h e s i z e d .T h e s t u d y i s c h a r a c t e r i z e d b y th e a v a i l a b i l i t y o f i n e x pe n s i v e r a w m a t e r i a l s ,t h e m i l d a n d c o n t r o l l e d c o n d i t i o n s of t h e r e a c t i o n s a t r o o m t e m p e r a t u r e ,a n d t h e h igh o v e r a l l yi e l d s ,w h i c h p r o v i d e s n e w i d e a s a n d m e t h o d s f o r t h e d e s i gn a n d s y n t h e s i s o f p o l y p e p t i d e p r o d r u gs .K e y wo r d s :H S P 90i n h i b i t o r ;p r o d r u g ;c o n d e n s a t i o n ;a c y l a t i o n ;p o l y p e p t i d e p r o d r u g 0 引 言热休克蛋白90(H e a t s h o c k p r o t e i n 90,H S P 90)是一种癌症治疗靶点,近年来备受关注㊂H S P 90通过与客户蛋白和辅助分子伴侣的相互作用调节细胞内的信号通路㊁蛋白质稳态和细胞凋亡过程㊂通常,H S P 90可用于保持400多个蛋白的构象稳定,同时也是癌细胞生长和转移的关键调节因子,能促进瘤细胞运动㊁侵袭和转移[1]㊂H S P90治疗靶点发现至今已有三十多年时间,尽管有三十多个H S P90抑制剂进入了临床研究,但都因安全性问题宣告失败[2-3]㊂S y n t a公司研发的G a n e t e s p i b,在前期研究中对非小细胞肺癌表现出良好的治疗效果,却在临床三期试验中因毒性而终止后续研究[4]㊂前药策略是将母药分子进行化学结构修饰,使活性母药与某些功能基团以共价键相连,在体内经由某些生物酶的作用释放出母药,从而达到较好的药效㊂前药策略在药物开发过程中被广泛应用,如用于提高口服药物的生物利用度㊁增强药物的血脑屏障渗透性㊁增强药物化学代谢以及母药的靶向递送等[5-8]㊂将前药策略用于母药的靶向递送,在抗肿瘤药物开发领域极具前景,能够极大地提高药物的安全性㊂H S P90抑制剂的毒性主要来源于两个方面:一方面是由于药物进入体内循环后,在各个器官广泛分布,对正常组织的H S P90蛋白功能产生抑制作用,从而诱发周身毒性;另外,进入临床的H S P90抑制剂的选择性过大,尤其对H S P90蛋白家族的其他亚型也都有较强的抑制作用,不可避免地产生脱靶毒性㊂因此,H S P90亚型选择性抑制剂的开发已经成为一个重要的研究方向㊂然而,H S P90的蛋白结构高度保守,这使得开发选择性抑制剂异常困难[9-14]㊂本文以4-(2-羟乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯和1-(溴甲基)-4-硝基苯为起始原料,经缩合㊁还原㊁关环等多步反应得到两个H S P90抑制剂H S P90i-1和H S P90i-2;以L-脯氨酸和L-缬氨酸衍生物为原料,经过缩合㊁脱保护㊁酰化反应得到三肽连接子M1㊂将M1分别与H S P90i-1和H S P90i-2缩合,得到三肽前药分子P1和P2㊂利用1H N M R㊁L C M S㊁13C N M R等分析中间体及目标分子的结构㊂本文的研究可为三肽类前药提供新的设计思路和合成方法㊂1实验部分1.1实验材料及仪器实验材料:N,N-二甲基甲酰胺(D M F)㊁二氯甲烷(D C M)㊁四氢呋喃(T H F)㊁甲醇(M e O H)㊁乙醇(E t O H),三氟乙酸(T F A)均为分析纯,购于上海安耐吉化学有限公司;4-二甲氨基吡啶(D M A P)㊁盐酸二恶烷(H C l)㊁1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(H O A T)㊁2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(H A T U)㊁2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(E E D Q)㊁对氨基苄醇(P A B)㊁N-乙基二异丙胺(D I E A)㊁三乙胺(T E A)㊁对硝基氯甲酸苯酯㊁对甲苯磺酰氯(T s C l)㊁氢化钠(N a H)㊁钯碳(P d/C)㊁碳酸钠(N a2C O3)㊁羰基二咪唑(C D I)㊁水合肼(N H2-N H2㊃H2O),均为分析纯,购于上海毕得医药㊂实验仪器:B r u k e r A v a n c e A V(400MH z)核磁共振波谱仪,B i o t a g e L C Q-F l e e t质谱仪,w a t e r s B i o t a g e I s o l e r a P r i m e快速制备液相色谱,岛津U V-2600紫外分光光度仪㊂1.2抑制剂H S P90i-1合成目标分子的合成路线见图1㊂4-(2-羟乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯经T s C l活化羟基㊁羟胺缩合㊁硝基还原㊁关环和脱保护[15]等步骤合成4-(5-羟基-4-(1-(2-(哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-5-基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)-6-异丙基苯-1,3-二醇(H S P90i-1)㊂1H N M R(400MH z,D M S O)δ11.90(s,1H), 9.07(d,J=8.7H z,1H),8.88(d,J=9.4H z, 1H),7.50~7.45(m,2H),7.43(d,J=1.9H z, 1H),6.93(d d,J=8.7,1.9H z,1H),6.69(s, 1H),6.43(d,J=3.0H z,1H),6.32(s,1H), 4.21(t,J=7.1H z,2H),3.22~3.16(m,2H), 2.89(m,1H),2.75(q,J=11.7H z,2H),1.83 (d,J=12.6H z,2H),1.68(q,J=13.5, 6.7H z,2H),1.49~1.32(m,3H),0.81(d, J=6.9H z,6H)㊂L C M S[M+H]+=462.3㊂1.3抑制剂H S P90i-2的合成目标分子的合成路线见图2㊂将1-(溴甲基)-4-硝基苯经取代㊁还原㊁缩合㊁关环和脱保护等步骤合成4-(5-羟基-4-(4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)-4H-1,2, 4-三唑-3-基)-6-异丙基苯-1,3-二醇(H S P90i-2)㊂1H N M R(401M H z,D M S O)δ11.92(s,1H),9.51 (d,J=82.9H z,2H),7.73~5.65(m,6H),3.46 (s,2H),3.29(s,4H),3.06~2.87(m,1H), 2.62~2.18(m,43H),1.38(s,9H),0.94(d,J= 6.9H z,6H)㊂L C M S[M+H]+=410.1㊂1.4三肽连接子M1合成目标分子的合成需经历5步反应,具体合成路线见图3㊂1.4.1 M1b合成将L-缬氨酸衍生物(M1a,0.9g,2.95m m o l)溶于D M F(20m L),加入脯氨酸(0.3g, 2.95m m o l)和碳酸钠(0.5g,4.43m m o l),室温反应16h㊂加水(10m L),用乙酸乙酯(50m Lˑ4)萃取,无水硫酸钠干燥有机层,减压浓缩,得白色固体(672.0m g,收率:75%)㊂L C M S[M+H]+= 259.1㊂506第5期刘文金等:H S P90抑制剂前药设计及合成图1 H S P 90i -1合成路线图2 抑制剂H S P 90i -2合成路线图3 三肽连接子M 1合成路线1.4.2 M 1c 合成将M 1b (0.5g ,1.59m m o l )和P A B (0.2g,1.75m m o l )加入二氯甲烷(20m L ),加入E E D Q(0.8g ,3.18m m o l),室温反应3h ㊂减压浓缩,硅胶色谱法纯化(P E 与E t O A c 比值为7ʒ3)得白色固体(513.0m g,收率:77%)㊂L C M S [M+H ]+=420.2㊂1.4.3 M 1d 合成将M 1c (0.6g ,1.43m m o l)加入二氯甲烷(20m L ),加入三氟乙酸(0.4m L ,4.30m m o l),室温反应3h ㊂减压浓缩,硅胶色谱法纯化(P E 与E t O A c 比值为4ʒ1)得白色固体(379.0m g,收率:80%)㊂L C M S [M+H ]+=320.2㊂606浙江理工大学学报(自然科学)2023年 第49卷1.4.4 M 1e 合成将M 1d (0.1g ,1.30m m o l )溶于二氯甲烷(10m L ),加入M 1a (0.2g ,1.40m m o l )和三乙胺(0.3m L ,1.95m m o l),室温反应3h ㊂加水(5m L ),用乙酸乙酯(20m L ˑ4)萃取,无水硫酸钠干燥有机层,减压浓缩,得白色固体(110m g,收率:69%)㊂1H N M R (401MH z ,D M S O )δ10.15~9.67(m ,1H ),7.77(d ,J =8.3H z ,1H ),7.66~7.41(m ,2H ),7.23(d ,J =8.5H z ,2H ),6.84(d d ,J =23.6,9.2H z ,1H ),5.76(s ,2H ),5.09(t ,J =5.6H z ,1H ),4.42(d ,J =5.2H z,4H ),3.92~3.71(m ,2H ),3.63(d ,J =6.7H z ,1H ),2.12(d ,J =8.5H z ,1H ),2.06~1.79(m ,5H ),1.38(s ,11H ),0.97~0.69(m ,13H )㊂L C M S [M+H ]+=519.3㊂1.4.5 M 1合成将M 1e (0.4g ,1.30m m o l)溶于二氯甲烷(10m L ),加入对硝基氯甲酸苯酯(39.0m g,0.19m m o l ),加入三乙胺(1.0m L ,0.38m m o l ),室温反应2h ㊂加水(5m L ),用乙酸乙酯(20m Lˑ4)萃取,无水硫酸钠干燥有机层,减压浓缩,得白色固体(441.9m g,收率:84%)㊂L C M S [M +H ]+=628.3㊂1.5 三肽前药P 1的合成目标分子的合成路线见图4㊂将H S P 90i -1(80.0m g,0.17m m o l )溶于D M F (10m L ),加入M 1(118.0m g ,0.17m m o l )和H O A T (34.7m g,0.23m m o l ),加入D I E A (41.0m g,0.34m m o l ),在30ħ反应4h ㊂减压浓缩,硅胶色谱法纯化(P E与E t O A c 比值为7ʒ3)得白色固体(123.8m g,收率:71%)㊂1H N M R (401MH z ,D M S O )δ11.87(s ,1H ),10.06(s ,1H ),9.52(d ,J =16.2H z,2H ),7.77(d ,J =8.8H z ,1H ),7.47(d d d ,J =23.6,14.1,5.2H z ,5H ),7.28(d ,J =8.6H z,2H ),6.93(d d ,J =8.6,2.0H z ,1H ),6.81(d,J =9.5H z ,1H ),6.68(s ,1H ),6.42(d ,J =3.0H z ,1H ),6.23(s ,1H ),4.98(s ,2H ),4.38(d d ,J =15.9,7.2H z ,2H ),4.20(s ,2H ),3.95(d ,J =11.1H z ,2H ),3.82(s ,2H ),3.63(s,1H ),2.95~2.77(m ,1H ),2.10~1.79(m ,6H ),1.67(d ,J =6.5H z ,4H ),1.38(s ,11H ),1.17~0.99(m ,3H ),0.98~0.85(m ,7H ),0.80(d d ,J =12.7,6.9H z ,12H )㊂L C M S [M+H ]+=963.5㊂图4 三肽前药P 1的合成路线1.6 三肽前药P 2的合成目标分子的合成路线见图5㊂将H S P 90i -2(100.0m g,0.24m m o l )溶于D M F (10m L ),加入M 1(167.0m g ,0.24m m o l )和H O A T (49.0m g,0.36m m o l ),加入D I E A (57.9m g,0.48m m o l ),在30ħ反应4h ㊂减压浓缩,硅胶色谱法纯化(P E 与E t O A c 比值为7ʒ3)得白色固体(158.5m g,收率:68%)㊂1H N M R (401MH z ,D M S O )δ11.91(s ,1H ),10.10(d ,J =23.2H z ,1H ),9.58(s,1H ),9.38(s ,1H ),7.77(d ,J =8.9H z ,1H ),7.56(d ,J =8.5H z ,2H ),7.29(d d ,J =8.4,4.6H z ,4H ),7.13(d ,J =8.3H z ,2H ),6.89~6.66(m ,2H ),6.25(s ,1H ),4.99(s ,2H ),4.39(d t ,J =17.0,8.3H z ,2H ),3.82(s ,2H ),3.64(s ,1H ),3.46(s ,3H ),3.07~2.85(m ,1H ),2.76~2.59(m ,2H ),2.38-2.23(m ,7H ),2.20~1.74(m ,6H ),1.38(s ,9H ),1.03~0.69(m ,18H )㊂L C M S [M+H ]+=954.2㊂2 结果与讨论2.1 M 1的合成过程分析对M 1进行质谱分析测试,结果如图6所示㊂在三肽连接子M 1的合成过程中,M 1a 和脯氨酸在D M F 和N a 2C O 3条件下进行缩合,得到M 1b ㊂该氨基酸缩合反应条件温和,特异性高[16],收率为75%㊂图6(a )展示了M 1b 在液相质谱E S I 正模式706第5期刘文金等:H S P 90抑制剂前药设计及合成下测试所得的谱图;由图6(a)可知其中:横坐标为化合物的摩尔质量,单位为(g/m o l),表示化合物的分子质量;纵坐标为荧光强度,用a.u.表示,表示化合物吸收强度㊂测得离子峰[M+H]+=259.1,因结构中包含B o c,由此推断所测样品中化合物分子量为259.1+56,与目标产物M1b的理论分子质量314.1一致㊂图5三肽前药P2的合成路线图6 M1合成过程中产物的液相质谱806浙江理工大学学报(自然科学)2023年第49卷由于无保护的二肽很容易发生自身缩合,形成稳定的哌嗪二酮结构[17],故在引入第三个氨基酸之前,先与M 1b 的羧基反应,即M 1b 和对氨基苄醇反应得到二肽的苯酰胺衍生物M 1c ,纯化后产物收率为77%㊂图6(b )展示了M 1c 在液相质谱E S I 正模式下测试所得的谱图;由图6(b)可知,测得离子峰[M+H ]+=420.3,与目标产物M 1c 的理论分子质量419.3一致㊂M 1c 在D C M 中用T F A 脱去氨基保护基B o c,得到N 端未保护的二肽M 1d ,收率80%㊂图6(c)展示了M 1d 在液相质谱E S I 正模式下测试所得的谱图;由图6(c )可知,测得离子峰[M+H ]+=320.2,与目标产物M 1d 的理论分子质量319.2一致㊂M 1d 中的氨基与M 1a 的活性酯部分高效缩合得到三肽苯酰胺衍生物M 1e ,收率为69%㊂图6(d)展示了M 1e 在液相质谱E S I 正模式下测试所得的谱图;由图6(d )可知,测得离子峰[M+H ]+=519.3,与目标产物M 1e 的理论分子质量518.3一致㊂M 1e 与对硝基氯甲酸苯酯发生酰化反应,得到稳定的三肽苯酰胺活性酯衍生物M 1,收率84%,该路线总产率为27%㊂图6(e )展示了M 1在液相质谱E S I 正模式下测试所得的谱图;由图6(e)可知,测得离子峰[M+H ]+=628.3,因结构中包含B o c ,由此推断所测样品中化合物分子量为628.3+56,与目标产物M 1的理论分子质量683.3一致,确定为目标化合物㊂2.2 P 1和P 2合成过程分析 将含有二级胺官能团的H S P 90抑制剂分别与含有活性酯的三肽连接子缩合,得到两个三肽前药P 1和P 2㊂反应路线简短,条件温和,产品收率较高,为三肽类药物的合成提供了新的方法㊂2.2.1 P 1液相质谱分析采用液相质谱(L C M S )对P 1进行质谱分析,分析结果如图7(a )所示,测得离子峰[M+H ]+=963.5,因结构中包含B o c,由此推断所测样品中化合物分子量为963.5+43,与所设计目标产物P 1的相对分子质量1005.5相吻合,确定为目标化合物㊂2.2.2 P 1核磁氢谱分析采用核磁氢谱(1H N M R )对P 1进行氢谱分析见图7(b ),P 1分子式为C 54H 71N 9O 10,图中氢的个数为71,1㊁2㊁3位置的3个氢为3个羟基峰,4㊁5位置的6个氢为异丙基的两个甲基的氢,6㊁7㊁8㊁9位置的12个氢为另外4个甲基的氢,因此可以确定为目标化合物图7 P 1的液相质谱和核磁氢谱2.2.3 P 2液相质谱分析采用液相质谱(L C M S )对P 2进行质谱分析,分析结果如图8(a )所示㊂测得离子峰[M+H ]+=954.5,与所设计的目标产物P 2的相对分子质量953.5相吻合,确定为目标化合物㊂2.2.4 P 2核磁氢谱分析采用核磁氢谱(1H N M R )对P 2进行氢谱分析,结果见图8(b )㊂P 2分子式为C 50H 67N 9O 10,图中氢的个数为50,1㊁2㊁3位置的3个氢为3个羟基峰,4㊁5㊁6㊁7㊁8㊁9位置的18个氢为6个甲基的氢,由此可以确定为目标化合物㊂2.2.5 P 1和P 2核磁碳谱分析核磁碳谱(13C N M R )对P 1和P 2进行碳谱分析见图9,根据碳的位置和数量可以确定为目标化合物㊂906第5期刘文金等:H S P 90抑制剂前药设计及合成图8 P 2的液相质谱和核磁氢谱图9 P 1和P 2的核磁碳谱3 结 论本文先通过多步反应得到H S P 90i -1和H S P 90i -2两种H S P 90抑制剂,随后分别与三肽连接子M 1进行缩合反应,得到三肽前药分子P 1和P 2㊂合成三肽连接子M 1的总产率为27%,通过1H N M R ㊁L C M S ㊁13C N M R 证明成功合成了目标化合物㊂本文提出的整个合成路线所使用的原料廉价易得,反应都在常温下进行,条件温和可控,总产率较高㊂本研究对H S P 90抑制剂的毒性问题进行分析,利用前药方法优化化合物的结构,从而达到降低药物毒性,提高药物安全窗的目的,对抗肿瘤药物的发展有着重要的实践意义㊂参考文献:[1]L i Y Y ,Z h a n g T ,Sc h w a r t z S J ,e t a l .N e wde v e l o p m e n t s i n H s p90i n h i b i t o r s a s a n t i -c a n c e r t h e r a p e u t i c s :M e c h a n i s m s ,c l 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植物HSP90在环境压力下的功能和调控机制研究随着全球气候变化和人类活动对环境的影响，植物越来越面临各种压力，如高温、干旱、盐胁迫等。
为了适应这些压力，植物必须调整其生理和分子机制以增强其抵御能力和适应性。
其中一个重要的分子机制是热休克蛋白90（HSP90）的功能和调控机制，这被认为是一种非常重要的植物应对环境压力的策略。
植物HSP90基本特征HSP90是一类高度保守的分子伴侣蛋白，它在真核生物中广泛存在，并参与多种蛋白的转运和折叠等生命活动。
植物HSP90蛋白一般为单倍体分子，分子质量约为83 ~ 93 kDa，并具有ATP酶活性。
植物 HSP90的基本肽序列和三维结构与哺乳动物、酵母等生物的对应蛋白高度保守。
与其他HSP家族成员不同，植物HSP90主要定位于细胞质中，并与其他分子伴侣蛋白一起调节非常重要的植物生理过程，如光合作用、抗逆、病原体感染等等。
HSP90对环境压力的响应和适应HSP90能够参与多种环境压力的应答，如高温、低温、干旱、盐胁迫等。
尤其是在高温胁迫下，由于许多蛋白质的折叠和组装容易受到影响，HSP90的作用显得尤为重要。
同时，HSP90还能够调节许多与植物关键成熟性状相关的转录因子和信号分子，来确保植物的正常发育和生长。
HSP90与植物互作蛋白HSP90作为分子伴侣蛋白，参与多种与植物生命活动相关的蛋白质复合物的形成。
例如，HSP90可以与TAIR10中多达180个植物质膜转运蛋白以及植物内源性激素受体和众多蛋白激酶相互作用，并调节它们的活性和稳定性。
在这些过程中，如上调花生蛋白、花青素合成酶、酚酸合酶等的表达，HSP90与转录因子和转录共激活因子的互作也是至关重要。
HSP90调控机制HSP90的ATP酶活性是调控其在细胞质中活性和稳定性的关键。
ATP酶活性和HSP90蛋白与客体蛋白的结合紧密相关，T-DNA插入或基因敲除、p23、Sgt1等HSP90典型结构域的缺失都可能导致HSP90的ATP酶活性和作用失调，从而会导致植物发育和适应受到影响。
热休克蛋白90抑制剂研究进展热休克蛋白90(Hsp90)抑制剂能够抑制Hsp90,促使在肿瘤生长信号通路中起重要作用的Hsp90效应蛋白通过泛素化降解,从而阻断肿瘤增殖生长信号通路的多个靶点,有效阻止肿瘤的生长。
现综述近年来有关Hsp90抑制剂在肿瘤治疗方面的研究进展。
标签：热休克蛋白90;肿瘤;治疗近年来,随着对肿瘤在分子水平上认识的不断深入,阻碍肿瘤发生发展信号通路的药物逐渐成为抗肿瘤药物研究的热点领域,但临床疗效仍不甚理想。
1999年Kaelin首先提出了多点攻击(multi-hit modality)理论[1]。
该理论的核心是利用某一靶位实现对信号通路网络的多点阻断,从而彻底摧毁肿瘤赖以生存的整个信号通路网络。
因此,寻找有效的靶位是这一理论应用于肿瘤治疗的关键。
一、Hsp90的结构和作用机制Hsp90又称为应激蛋白90,在生物进化过程中高度保守,广泛存在于原核和真核生物中,是细胞中存在最丰富的蛋白质之一。
当细胞受到外界刺激时,其表达成倍增加,能够迅速保护细胞对抗内源性进攻,增强细胞修复功能和提高细胞对刺激的耐受力。
Hsp90 除了将新生肽链或非天然态的蛋白质折叠成具有天然态的功能蛋白质外,还参与信号传递分子构象的变化过程,通过对底物蛋白的作用,影响疾病的发生和发展。
Hsp90在肿瘤细胞的组成型表达比正常细胞高2—10倍[2],在肿瘤细胞生长和存活中起重要的调节作用,是许多癌基因通路中的重要组成部分,成为抗肿瘤药物的作用靶点之一。
Hsp90具有三个结构域:C-末端(1×10\+4 )结构域是Hsp90自身二聚化位点,钙调蛋白结合位点和靶蛋白结合位点;中间连接区(3.5×10\+4)是核定位信号和靶蛋白结合位点;N-末端(2.5×10\+4) 结构域是ATP/ADP结合位点[3],ATP/ADP结合部位起着构象转化区的作用,调节Hsp90参与的多分子伴侣复合物的装配。
陕西科技大学学报Vol.39No.2第39卷第2期暋2021年4月暋Journal of Shaanxi University of Science&Technology Apr2021文章编号：2096-398X(2021)02-0050-06HSP90抑制剂AUY922与氟康唑协同抗真菌活性研究贾海瑞，刘珍，韩磊，王苗苗，刘伟(陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安710021)摘要：热休克蛋白90(heat shock protein90,HSP90)属于热应激性蛋白，参与真菌耐药性的产生.氟康唑(fluconazole,FCZ)作为临床侵袭性真菌感染治疗的一线治疗药物之一，因其仅具有抑菌活性，长期反复用药容易产生耐药性.因此，本文以HSP90抑制剂AUY922(AUY)为对象，研究其与FCZ合用时对FCZ敏感和耐药真菌的活性.通过棋盘式微量稀释法、生长实验、时间-杀菌曲线、菌丝生长、抑菌圈等实验综合评价AUY和FCZ合用时的抗真菌活性.结果显示：化合物AUY单用时对热带念珠菌、敏感和耐药白念珠菌、新生隐球菌有中等到弱的抑菌活性(MIC值为16—64毺g/mL)；当AUY与FCZ合用时对耐药白念珠菌和热带念珠菌表现明显的协同抗菌甚至杀菌活性；且两药合用后对真菌菌丝形成的抑制活性亦明显强于单用.因此，HSP90抑制剂AUY与FCZ合用具有协同抗真菌活性，这为抗真菌药物联合应用奠定基础.关键词:HSP90抑制剂AUY；氟康唑；联合用药；真菌感染；抗真菌研究中图分类号：R97&5文献标志码:AStudy on synergistic antifungal activity of HSP90inhibitor AUY922and fluconazoleJIA Hai-rui,LIU Zhen,HAN Lei,WANG Miao-miao,LIU Wei (School of Food and Biological Engineering,Shaanxi University of Science&Technology,Xi'an710021,China)Abstract：Heat shock protein90(HSP90)is a kind of heat stress protein,which is involved in thedevelopmentoffungaldrugresistance.Fluconazole(FCZ)isoneofthefrst-lnedrugs forthetreatmentofinvasivefungalinfections.Becauseofitsantibacterialactivity,tiseasy to produce drug resistance after long-term repeated use.Therefore,AUY,aninhibitorof HSP90,was used as the research object to study the activity of AUY combined with FCZ a-gainstFCZsensitiveandresistantfungi.TheantfungalactivityofAUYcombinedwthFCZ was evaluated by checkerboard microdilution method?growth test,time sterilization curve, mycelialgrowthandinhibitionzone.Theresultsshowedthatcompound AUY had moderate *收稿日期：2020-12-19基金项目：国家自然科学基金项目(81701981)；陕西科技大学博士科研启动基金项目(2016EJ-52)作者简介：贾海瑞(1996—)男，陕西延安人，在读硕士研究生，研究方向：抗微生物药物通讯作者：刘伟(1986—)，女，江西萍乡人，副教授，博士，研究方向:抗微生物药物，liuweisp@第2期贾海瑞等:HSP90抑制剂AUY922与氟康唑协同抗真菌活性研究・51・to weak antibacterialactivity against Candida tropicalis,drug-resistant Candida albicans (MIC value was16—64毺g/mL)；when AUY was combined with FCZ,it showed obvious synergisticantibacterialandevenbactericidalactivityagainstresistantCandidaalbicansand Candida tropicalis；and the inhibitory activity of combination of AUY and FCZ was signiti-cantly stronger than that of single drug.Therefore,HSP90inhibitor AUY combined with FCZhassynergistcantfungalactivty,whichlaysthefoundationforthecombinedapplca-tionofantifungaldrugs.Key words:HSP90inhibitor；fluconazole；combination；fungal infection；antifungal research0引言热休克蛋白（Heat Shock Proteins,HSP）是一类广泛存在于原核和真核生物胞内的高度保守蛋白，在细胞应激（病毒感染、缺氧、紫外线照射等）状态下大量合成，能有效阻止蛋白质发生错误折叠、稳定胞内蛋白构象并介导蛋白质到达目标细胞[] HSP按分子量大小可分为：HSPH（HSP110）、HSPC（HSP90）、HSPA（HSP70）、DNAJ （HSP40）、小分子热休克蛋白HSPB家族（small HSP）和人类分子伴侣家族（HSP60和CCT）⑵.其中HSP90占胞内溶质蛋白的1%—2%[],在癌症、炎症、感染、神经、内分泌等诸多领域的研究正在逐步深入，逐渐成为相关研究领域的热门.根据我国感染监测网的数据分析，医院真菌感染的发生率从20世纪90年代初的13.9%上升到90年代末的24.4%间，即使临床上应用现行的治疗指南，系统性真菌感染导致患者的致死率仍超过50%[].而多数医院真菌感染由念珠菌引起，其中占比最咼的为白念珠菌，其次为光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌[0].白色念珠菌作为占临床分离酵母类微生物80%—90%[11]的致病真菌，引起的血液感染死亡率高达40%.但真菌感染缺少特异性的临床表现，常因贻误治疗而失去最佳治疗时机[2].而唑类药物如氟康唑（Fluconazole,FCZ）.伊曲康唑、伏立康唑等作为临床应用最广泛的抗真菌药物，却因大量使用导致例如白念珠菌等致病真菌耐药性的加重.综上真菌感染的治疗研究迫在眉睫.因此FCZ与耐药增敏剂（如钙依赖磷酸酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂等）联用以增强对耐药真菌疗效，已成为相关领域研究热点⑼.现有研究发现真菌依靠应激反应以对抗药物对细胞膜和细胞壁的损伤，并推测阻断细胞应激反应信号通路可以避免真菌耐药并显著增加抗真菌药物疗效[3].作为细胞应激反应的一个关键点,HSP90功能的实现受到上游通路多种分子调节,例如通过ATP的结合和水解，分子伴侣以及磷酸化、乙酰化等表达后修饰而实现相关调节[14,5],相关研究前景广远.因此将HSP90作为药物靶点的研究方向逐渐成为相应抗真菌药物研发的重心.为推进抗真菌药物研发进展，通过文献调研发现AUY922（AUY）作为第二代HSP90抑制剂，可以竞争性结合于HSP90的ATP结合位点，从而抑制HSP90的生物学活性，导致细胞内很多关键蛋白不能被正常折叠从而失去生物学功能，且其作为肿瘤及癌症治疗药物已通过大量临床实验[620].故本实验选用HSP90抑制剂AUY为受试药物,采用不同实验对AUY进行全面的体外单用和联合FCZ抗真菌活性研究.本实验为抗真菌药物联合应用奠定基础，同时也为拓展现有抗真菌药物应用提供依据.1材料与方法1.1主要材料1.1.1实验菌种耐药白念珠菌103、白念珠菌SC5314、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、新生隐球菌（上海市长海医院检验科）.1.1.2实验药品试剂及培养基配制HSP90抑制剂AUY（上海凯睿生物科技有限公司）；FCZ（默克集团）；二甲基亚砜、碳酸氢钠及氢氧化钠（天津市天力化学试剂有限公司）；蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司）；葡萄糖（天津市科密欧化学试剂有限公司）;3-（N-吗啡咻）丙磺酸/ MOPS（源叶生物）.0.1M磷酸盐缓冲液（PBS）（NaCl8.0g,KCl0.4g,Na2HPO40.133g,KH2PO4 0.35g,NaHCOs0.35g,加三蒸水至1000mL溶解，高压灭菌,4曟保存）.SDA平板（40g葡萄糖、10g蛋白胨加三蒸水至1000mL搅拌溶解，加18g琼脂粉混匀，121曟•52•陕西科技大学学报第39卷高温灭菌20min,倒平皿4曟储存）;YPD培养液（酵母提取物10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g加三蒸水至1000mL,混匀分装，121曟高压灭菌20min, 4曟保存）；RPMI1640液体培养液（RPMI1640 10g、NaHCOs2.0g、MOPS34.5g加三蒸水溶解，用NaOH调pH至7.0,加水至1000mL,除菌,4曟保存）.1.1.3实验设备LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；01-2AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；VORTEX-5型涡旋仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）;SW-CJ-JFD 型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）; YP202N电子天平（上海天美天平仪器有限公司）；BCD-160TMPQ海尔冰箱（青岛海尔股份有限公司）；THZ-98C型恒温振荡箱及GP-9080型隔水式培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）.1.2实验方法1.2.1实验菌悬液制备将实验各菌株接种至液体YPD培养基中培养过夜.离心收集菌体，PBS洗涤，加YPD培养基调整菌浓度至1.0X106cells/ml,混匀待用.1.2.2HSP90抑制剂AUY单用时抗真菌活性的初探究取无菌96孔板，每排1号孔加等量RPMI1640液体培养基作空白对照，12号孔不加药物作阳性对照.采用倍比稀释法［1•对211号孔进行倍比稀释，保证各孔的药物终浓度依次为64“g/mL、32“g/mL、16“g/mL、8“g/mL、4“g/mL、2“g/mL、1“g/mL、0.5“g/mL、0.25“g/mL、0.125“g/mL且孔中DMSO的含量均低于1%.35曟恒温培养，于24h、48h两个时间点进行观察记录,得对应最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration,MIC）.MIC值选用记录方法:当MIC值高于64“g/mL记为“>64“g/mL”；等于或低于最低浓度时均记为“曑0.125“g/mL”上述实验均平行操作两次，当观察所得MIC值能准确重复或只差一个浓度时视为有效结果，并取较高浓度为最终确定值,否则重新实验直到数据符合要求.1.2.3AUY与FCZ联用抗真菌活性的探究（1）棋盘式微量液基稀释法［2取无菌96孔板,每排1号孔加RPMI1640液体培养基作空白对照,12号孔加入对应编号不含药剂的稀释菌液作阳性对照.对211号孔进行倍比稀释，使各孔的药物终浓度依次为64“g/mL、32“g/mL、16“g/mL、8“g/mL、4“g/mL、2“g/mL、1“g/mL、0.5“g/mL、0.25“g/mL、0.125“g/mL且孔中DMSO的含量均低于1%.35曟恒温培养，于24h、48h两个时间点进行观察记录对应MIC值.评价联合用药的两种药物相互作用方式的主要参数是部分抑菌浓度指数FICI,为每个药物联合抑菌时所需要最低抑菌浓度（MIC）和单用时MIC的比值之和.当FICI曑0.5时,相互作用是协同作用5<FICI曑1时为相加作用；1<FICI曑4时为无关作用；FICI>4时,则为拮抗作用［3］.（2）生长实验取等量稀释菌悬液装入灭菌玻璃管，并依次编号18.1号管不加药物作为空白对照.2号管FCZ终浓度8“g/mL,3号管内AUY终浓度16“g/mL,48号管内FCZ+AUY终浓度依次为（8+1“g/mL、（8+2）“g/mL、（8+4）“g/mL、（8+8）“g/mL、（8+16“g/mL.35°C、200rpm恒温振荡培养24h 拍照记录.（3）时间-杀菌曲线实验八组玻璃管依次编号1&号.药品添加后35C、200rpm恒温振荡培养，于0、6h、12h、24h、48h五个时间点分别取样，用PBS稀释不同浓度，涂布于SDA平板,35C恒温培养48h后数克隆数并计算CFU数.（4）琼脂纸片扩散实验吸取500“L菌液平铺于SDA平板，静置3~4h,挥干表面，放置6mm纸片,添加相应药物,35C恒温培养48h后观察拍照.（5）菌丝生长实验挑取菌克隆于YPD中培养过夜.3000rpm,离心5min,去上清.PBS洗3次.用RPMI1640重悬，使菌终浓度为1暳106cells/mL.取无菌6孔板各孔加等量菌悬液，第一排1号孔为空白组,号孔FCZ终浓度8“g/mL,3号孔AUY终浓度16“g/mL,使46号孔FCZ+AUY终浓度依次为（8+2）“g/mL、（8+8）“g/mL、（8+16）“g/mL. 35C恒温培养，在0h、1h、2h、3h时显微拍照记录.2结果与讨论2.1HSP90抑制剂AUY单用时对真菌的作用以AUY化合物为受试药物，FCZ为阳性对照第2期贾海瑞等:HSP90抑制剂AUY922与氟康唑协同抗真菌活性研究・53・药,种真菌为受试菌株进行药敏试验，得到了AUY对七种真菌作用24h、48h的MIC值.由表1可知，AUY对热带念珠菌、敏感白念珠菌SC5314、耐药白念珠菌103及新生隐球菌的MIC值范围为16〜64毺g/mL,具有中等到弱的抑菌活性，对光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌未表现抑菌活性.表1AUY对7种真菌的MIC值（毺g/mL）~-AUY FCZ-24h48h24h48h耐药白念珠菌1036464>64>64白念珠菌SC5314161611光滑念珠菌>64>641616克柔念珠菌>64>646464热带念珠菌64646464新生隐球菌64>6411近平滑念珠菌>64>64222.2AUY与FCZ合用对真菌的协同作用2.2.1AUY与FCZ合用对真菌的MIC值以化合物AUY为受试药物，以FCZ为阳性对照药，六种真菌为受试菌株，进行联合抗真菌药敏实验，其结果如表2所示.分析可知，AUY与FCZ合用48h时，对于耐药白念珠菌103和热带念珠菌的FIC值小于0.5,表现为协同作用；对于光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌和白念珠菌SC5314表现为无关作用.表2化合物AUY与FCZ合用后对各种真菌的MIC值（毺g/mL）单用合用菌株FCZ/(“g/mL)AUY/(“g/mL)FCZ/(“g/mL)AUY/(“g/mL)FIC相互作用热带念珠菌64640.510.0230协同光滑念珠菌16>64322 2.0156无关近平滑念珠菌2>6444 2.0070无关耐药白念珠菌103>6464 210.0315协同克柔念珠菌64>64642 1.0156无关白念珠菌SC531411624 2.2500无关2.2.2AUY与FCZ联用对2种真菌生长的影响由联合抗真菌药敏实验结果，以化合物AUY 为受试药物，选用耐药白念珠菌103、热带念珠菌为受试菌株，进行生长实验•由图1可知，对于耐药白念珠菌103、热带念珠菌，各实验组中菌液澄清度由浊到清（抑菌力由弱到强）依次为对照组、AUY单用组、FCZ单用组、联合用药组.FCZ和AUY联合用药的五个实验组中，当FCZ浓度不变，随着AUY浓度增加，其菌液澄清度愈高，抑菌效果越好.图1化合物AUY与FCZ合用对2种真菌生长的影响2.2.3AUY与FCZ联用对2种真菌的时间-杀菌曲线（1）FCZ和AUY联用对热带念珠菌存活的影响由表3和图2可知,单用时AUYCL6毺g/mL）抑菌能力弱于FCZ（8毺g/mL）；两种药物单用抑菌效果小于联合用药各组；48时联合用药各组的存活菌落数为0；联合用药组在FCZ浓度为8毺g/mL时,随着AUY浓度提高,相同时间下存活菌落数越少,抑菌能力越强.分析表明，不同浓度的AUY与FCZ合用对热带念珠菌表现协同抗菌甚至杀真菌活性，且在48h时，两药合用后表现完全杀菌作用•表3FCZ和AUY联合作用对热带念珠菌不同时间后的存活菌落数(log。
专利名称：作为HSP90抑制剂来治疗癌症的3－(2－羟基－苯基)－1H－吡唑－4－甲酸酰胺衍生物
专利类型：发明专利
发明人：M·C·贝斯威克,P·A·布拉夫,M·J·德赖斯戴尔,B·W·迪莫克
申请号：CN200380109507.0
申请日：20031204
公开号：CN1744894A
公开日：
20060308
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：式(IA)或(IB)化合物或其盐、N－氧化物、水合物或溶剂化物是HSP90抑制剂，可用于治疗例如癌症：式(IA)，式(IB)，其中Ar是经环碳原子连接的芳基或杂芳基，它在2－位碳原子上被羟基取代，且在其它位置是未取代或任选取代的；R是氢或任选取代的C－C烷基；R是氢、任选取代的环烷基、环烯基、C－C烷基、C－C链烯基或C－C炔基；或者羧基、甲酰氨基、羧基酯基团；且R是甲酰氨基。
申请人：剑桥弗纳里斯有限公司,癌症研究技术有限公司,癌症研究所
地址：英国剑桥
国籍：GB
代理机构：北京市中咨律师事务所
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