基因工程菌的发酵

实验十甘露聚糖酶基因工程菌发酵调控原理：β-甘露聚糖酶能从底物LBG（Gum，Locus Bean洋槐豆粉）中水解产生还原糖，还原糖的产生量与酶活性成正比，用DNS显色法测定还原糖的含量，从而计算出酶活力。

酶活力单位（U）的定义：在40℃.pH5.0的酶活力测定条件下，1min催化5mg/mlLBG底物溶液生成1ug 还原糖（以甘露糖表示）所需的酶量定义为一个酶活力单位（U），其中样品的酶活力以U/g（固体酶）或U/ml（液体酶）表示。

一、菌株及培养基1、菌株毕赤酵母基因工程菌株man。

2一级种子培养基：2%葡萄糖，1%酵母粉，2%蛋白胨，pH自然。

3、二级种子培养基：2%葡萄糖，1%酵母粉，2%蛋白胨，pH自然。

4、发酵罐培养基：2%葡萄糖，2.7%玉米浆干粉。

5、补料培养基：50%葡萄糖。

培养基灭菌：葡萄糖与其它培养基分开灭菌，玉米浆干粉121℃灭菌20min，葡萄糖121℃灭菌15min。

发酵过程调节pH：浓氨水二、仪器设备及试剂1、仪器设备电子天枰，高压灭菌锅，5L发酵罐，100L发酵罐，移液枪及枪头（100µL量程和1mL量程），1.5mLEP 管，小型离心机，水浴锅，电热炉，10mL比色管，立式摇床。

2、所需试剂及配制① 1/15 mol/L pH5.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液称取二水磷酸氢二钠11.876g，加入蒸馏水溶解，定容至1000mL，混匀。

称取磷酸二氢钾9.078g，加入蒸馏水溶解，定容至1000mL，混匀。

用以上两种溶液按适当比例混匀得pH5.0的PBS缓冲液。

②氢氧化钠溶液（200g/L）称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL。

③ DNS试剂称取3.15 g 3,5- 二硝基水杨酸加到500mL单蒸水中，在40℃下水浴。

然后称20g氢氧化钠，溶于100mL 单蒸水中，缓慢将氢氧化钠溶液加到DNS溶液中，一边加入，一边搅拌，直至3,5- 二硝基水杨酸全部溶解。

基因工程菌发酵培养的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!基因工程菌发酵培养流程。

1. 菌种复苏和激活，从菌种库中取出保藏的菌种，在无菌条件下培养，激活其生理活性。

廛题科夔毕赤酵母基因工程菌发酵植酸酶的条件优化研究刘林刘明河(临沂师范学院生命科学学院，山东临沂276005)喃要】Pi chi apas t or i s能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工，并能对许多蛋白质产物进行分泌，使产物易于提纯，是一种极具潜力的酵母表达系统。

以毕赤酵母基因工程茵为实验菌种，探索其在不同条件下的产植酸酶睛况，优化发酵条件，找出高密度生长及高效产酶的最佳条件，从而降低生产成本。

睽键词]Pi chi apas t or i s；酵母表达系统；植酸酶；发酵条件植酸酶能将植酸降解成肌醇或磷酸肌醇和磷酸，是一种优良的食品和饲料添加剂，可消除单胃动物因不能分解植酸而引起的抗营养作用，提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率，具有良好的饲喂效果，同时，刚氐了磷对环境的污染。

植酸酶真正具有开发价值的仅限于微生物经发酵生产植酸酶。

国外对植酸酶的研究已有30多年的历史，但由于天然来源的植酸酶或者提取困难，或者分泌量太低，或者成本太高，难以满足生产的需要，由此构建基因工程菌，获得能高效表达植酸酶的菌株，成为解决这一问题的途径。

巴斯德毕赤酵母(Pi c hi a pa st or i s)是一种极具潜力的酵母表达系统，它能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工，并能对许多蛋白质产物进行分泌，使产物易于提纯：同时，自20世纪70年代起建立的以巴斯德毕赤酵母作为单细胞蛋白生产菌的高密度发酵方法已经成熟，以毕赤酵母基因工程菌为实验菌种，探索其在不同条件下的产酶隋况，就能找出高密度生长及高效产酶的最佳条件，从而刚氐生产成本。

1酵母细胞培养时C源的选择由于一些重组蛋白对细胞有毒害作用，通常在大容量、高密度的酵母培养过程中，需要在细胞扩增阶段用极高密度的抑制物来阻遏其他表达系统，诱导前又需将之去除。

而对于P．pa st or i s在生物量扩增阶段，只需少量的抑制物(通常为甘油)，既可以满足细胞生长，又能有效地抑制外源基因的表达；在表达阶段，让细胞耗尽剩余的甘油，再加入甲醇诱导产酶。

工程菌的知识基因工程大肠杆菌发酵的研究摘要：基因工程菌的发酵工艺研究在生物高技术产业化的发展中具有重要的意义。

研究结果表明，每１０Ｌ发酵液可得１～２ｋｇ湿菌体，发酵时间从一般的２４～３０ｈ缩短到６～８ｈ，５Ｌ、１５Ｌ、１５０Ｌ发酵罐都可得重复性的结果。

这项发酵工艺研究不仅适用于E.coli各种不同类型的表达启动子的工程菌，也适用于野生菌株疫苗等的生产，将对我国基因工程产业化起重要作用。

关键词基因工程菌,高密度发酵,人干扰素α22b ,鲑鱼降钙素,鱼生长激素, K88K99 基因工程疫苗作者：巫爱珍. 孙玉昆.刊名：生物工程学报讨论:含PL 启动子的E. coli 工程菌的表达及温度敏感株活菌疫苗的生产。

要求细菌在较低的温度(30 ℃) 发酵增殖,在一定时间内提高菌体密度,然后迅速提高温度诱导目的产物的表达。

这类菌表达产物的表达量取决于二个因素:一是在30 ℃发酵过程中尽可能提高菌体密度,二是快速升温诱导,要同时解决这二个问题是较困难的,目前不少基因工程研究室或生产厂对于这类菌的发酵均遇到上述同类的问题,即菌体密度不高和表达量低,他们为了得到足量菌体只好采用扩大发酵体积,显然不是良策,因为含PL 启动子的工程菌在发酵过程中发酵体积越大(500～1000L) ,其表达效率愈低,并大大增加了抽提分离表达产物的工作量、设备投资、运转费及污水处理量。

而本文报道的高密度发酵技术能同时解决以上的问题,发酵时间短(约8h) ,菌体密度及表达效率高,生产车间小型化,能节省大量后处理的设备投资、人力、能源、废物废水处理量少,符合发展现代化生产的要求。

对于不需温度诱导表达,在30 ℃发酵的工程菌或野生菌应用我们的工艺技术发酵,当发酵持续6 小时,菌体仍在直线增殖的情况下,如果延长发酵时间,菌体将继续增加。

E. coli 的不同工程菌或野生菌具有不同的特性,在发酵过程中我们随之对发酵条件作了相应的改变,均取得高密度的发酵结果。

基因工程菌的发酵控制近年来，基因工程已开始由实验室走向工业生产，一些珍稀药物如胰岛素、干扰素、人生长激素等已先后面市，但从许多研究中发现，基因重组菌的培养与发酵有其自身的特点。

从培养工程的角度应考虑诸如营养源浓度的控制（碳源、氮源等）、最适生长条件的控制等因素；从生物学上应考虑诸如质粒稳定性的控制、质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等主要因素。

1 、营养源浓度的控制由于大多数基因重组菌不能把所需的基因产物分泌到胞外，而只能靠破碎细胞后提取，因此要获得基因产物，首先必须得到大量菌体。

为此基因重组菌的发酵一般采用高浓度菌体培养的方法，如大肠杆菌培养时最高可达125g 干菌体/L 发酵液，酿酒酵母可达145g 干菌体/L 发酵液。

但要得到高浓度菌体，必须要提供高浓度的营养物质，而营养源浓度过高，渗透压也就高，反过来又会抑制重组菌的生长。

此外，许多基因重组菌常是维生素或氨基酸的营养缺陷型菌株，为维持菌体生长，也必须添加必需量的生长因子营养物。

常采用在调节pH 的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。

使整个培养期间，葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，菌体持续以最高生长速度生长，得到高浓度菌体。

2 、质粒的不稳定性及其控制在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。

带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。

此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。

由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降。

质粒不稳定包括分离性不稳定和结构性不稳定两种类型。

前者是细胞分裂过程中质粒没有分配到子细胞中而导致整个质粒的丢失；后者是由于重组质粒DNA 发生缺失、插入或重排而引起的质粒结构变化。

为了在工业化生产时使质粒的丢失降低到最低程度，除了构建合适的重组菌外，还应对重组菌进行一系列发酵试验，选择最佳的发酵条件。

基因工程菌发酵及相关技术交流~！长期以来，生物、化学、医学、发酵工程等等相关专业出身的技术人员，无论是那一种，在学校所处。

比如规模小，控制更精确，产物易失活等。

工程菌的发酵由于没有一个通用方案，可能全国各家实验室、研究所、高校所用的发酵条件千差万开这个题目的目的就是想让大家在基因工程菌发酵方面有一个平台，说说所犯的一些错误，讲讲实=======================================欢迎大家把自己在基因工程菌构建及发酵过程中所遇到的一些问基因工程菌涉及的东西很多，目前应用比较多的有原核表达系统（大肠杆菌和枯草杆菌）以及真核=======================================个人观点：基因工程药物的发酵生产也许是目前和微生物技术方关于中国基因工程药物一、中国基因工程药物产业化发展历史新中国成立近50年来，医药工业的发展已达到相当的规模，医药企业在4000家以上，其中约三分不断增加，一个以生物高新技术为主的产业，日益发展壮大，并逐步成为一个独立的新型产业，有改革开放以来，我国政府一直把医药生物技术产业作为重点建设行业来发展，早在“七五”就mRNA，反转录成DNA，构建质粒pBV867，转化到大肠杆菌N6405株中表达成功。

经过多年的中试研rHUIL－2等，在其表达量上有所突破，构建的工程菌均具有产业化生产价值，为我国基因工程制从“七五”末期到“八五”中期我国研究基因工程药物以仿制为主，如 rHUIFNα2b、 HGH、进入90年代以来是我国生物技术产业蓬勃发展的时期。

这一阶段表现为：1．仿制产品已步入工业化生产阶段，如HGH、rHUIFNα2b、EPO等。

2．重复研制产品也将进入试生产，如rHUIFNα2a、rHUIL－2等。

3．重复引进产品不断涌入，如G－SCF、GM－CSF、EPO、rHUIFNα2b等。

4．基因治疗、基因诊断和人类基因组计划也在这时期同时启动。

生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术创建人：时间：2013-04-17 【点击数：482】实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术1．实验目的（1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。

（2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。

2．实验原理重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。

重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。

发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。

工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。

目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。

另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。

当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。

补料的流加方式直接影响着发酵的效果。

分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。

但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。

过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。

基因工程菌发酵培养的流程Genetic engineering of bacteria is a complex process that involves manipulating the genetic material of the bacteria to produce desired products. 基因工程细菌是一个复杂的过程，涉及操纵细菌的基因物质以产生所需的产品。

This process begins with the selection of a suitable bacterial strain that has the potential to produce the desired product. 这个过程始于选择合适的细菌菌株，这些菌株有潜力产生所需的产品。

Once the bacterial strain has been selected, the genetic material of the bacteria is manipulated using techniques such as gene cloning and gene editing. 一旦细菌菌株被选择出来，就会使用基因克隆和基因编辑等技术来操纵细菌的基因物质。

After the genetic material has been manipulated, the bacteria are then cultured in a suitable growth medium to allow them to proliferate and produce the desired product. 在操纵基因物质之后，细菌就会在适宜的生长培养基中培养，以便它们能够繁殖并产生所需的产品。

This fermentation process involves closely monitoring the growth of the bacteria and providing the necessary nutrients and conditions for optimal product yield. 这个发酵过程涉及密切监测细菌的生长，并提供所需的营养和条件，以获得最佳的产品收率。

发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项（以大肠杆菌为例）利用重组DNA技术获取的生物药物在人类文明史上具有划时代的意义。

许多价值高产量低的功能蛋白如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长激素、胰岛素、人血白蛋白、蛋白酶等都在工程菌中获得了高效率表达。

由于工程菌高密度培养能够提高单位体积的产量，在工业生产上可以提高效率降低成本。

所以，高密度培养一直都是发酵工程师们所追捧的热点。

本文就工程大肠杆菌高密度发酵工艺开发中涉及的关键控制点加以探讨。

1工程菌种稳定可靠的菌种是工业化大生产的有力保障，直接关系到生产效率和成本高低。

不同于传统诱变育种模式，在对待工程菌菌种问题上，有人认为基因工程菌种构建完成后无需经过严格单克隆筛选，既节约时间成本又大大减少了工作量，这其实是一个认识误区。

这样做出来的菌种很难连续稳定传代50次以上，给中试放大以及后续的长期稳定生产留下了隐患。

业内一般以能否稳定遗传50代作为判断工程菌种优劣的一个标准。

发酵所需的接种量不是越大越好，要适当。

接种量过小导致适应期过长，菌种易提前老化，也增加了杂菌污染的风险。

接种量过大会过早引起溶氧不足，导致发酵失控。

且营养物质消耗过快也会影响后期正常生长。

一般大肠杆菌接种量遵循逐级增大的原则，并将最后一级的放大倍数控制在10倍左右。

种子培养一定要在最佳条件下进行，培养时间不宜过长，当种子生长至最佳状态时果断移种。

如果种子做的不好，其负面影响往往在发酵中后期会有所体现。

工程菌种培养会加入抗生素，不仅是为了抑制杂菌生长，更重要的是为了给菌种形成正向的抗性筛选压力，及时淘汰质粒丢失的菌株或者衰老的菌体，保证质粒携带菌群的正常生长与表达。

2高密度发酵培养基除了必须的碳源以外，有机复合氮源在蛋白表达阶段不可或缺。

有机复合氮源可提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质，能减轻细胞代谢负担，促进外源蛋白表达。

如果酵母膏和蛋白胨是以流加的方式添加时，存在一种非常有趣的代谢机制：当流加培养基中只有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中只有蛋白胨时，大肠杆菌难以再利用其所产生的乙酸。