【CN109880786A】一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法【专利】

专利名称：一种提高凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢的方法及培养基
专利类型：发明专利
发明人：孙建新,徐中文,张金燕,闫海,李锴骁
申请号：CN201811240024.9
申请日：20181024
公开号：CN109207406A
公开日：
20190115
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用乳酸盐和/或乳酸作为凝结芽孢杆菌生长的唯一或主要碳源促进其细胞形成芽孢的方法，该方法利用如下培养基培养凝结芽孢杆菌，对凝结芽孢杆菌进行好氧培养，培养基组成为：酵母膏10.0g/L；牛肉膏10.0g/L；蛋白胨10.0g/L；碳酸氢钠1.5g/L；磷酸二氢钾1.5g/L；七水硫酸镁1.0g/L；硫酸锰0.1g/L；氯化钙1.0g/L；去离子水1L；乳酸盐和/或乳酸含量为10‑30g/L。

本发明在培养凝结芽孢杆菌过程中可以促进凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢，芽孢形成率高达90％以上。

申请人：广东绿百多生物开发有限公司
地址：524000 广东省湛江市坡头区官渡工业园D区业兴路8号
国籍：CN
代理机构：广州广信知识产权代理有限公司
代理人：张文雄
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促使芽孢杆菌大量生成芽孢的方法芽孢杆菌是一种广泛存在于土壤中的细菌，其具有形成芽孢的能力，这种芽孢具有高度的抵抗力，能够在极端环境下存活。

芽孢杆菌的芽孢可以应用于食品工业、制药工业和农业等领域，因此大量生成芽孢具有重要的意义。

以下是促使芽孢杆菌大量生成芽孢的方法：1. 营养物质的添加：芽孢杆菌的生长需要一定的营养物质，例如碳源、氮源和矿物质等。

在培养芽孢杆菌时，可以添加适量的营养物质，以促进其生长和芽孢的形成。

2. 温度的调节：芽孢杆菌的生长和芽孢的形成受到温度的影响。

一般来说，芽孢杆菌的最适生长温度为30-37℃，而芽孢的形成温度为50-60℃。

因此，在培养芽孢杆菌时，可以通过调节温度来促进其芽孢的形成。

3. 氧气的控制：芽孢杆菌的生长和芽孢的形成受到氧气的影响。

芽孢杆菌喜欢在低氧环境下生长和形成芽孢。

因此，在培养芽孢杆菌时，可以通过控制氧气的供应量来促进其芽孢的形成。

4. pH值的调节：芽孢杆菌的生长和芽孢的形成受到pH值的影响。

一般来说，芽孢杆菌的最适生长pH值为7-8，而芽孢的形成pH值为5-6。

因此，在培养芽孢杆菌时，可以通过调节pH值来促进其芽孢的形成。

5. 添加适量的盐：芽孢杆菌的生长和芽孢的形成受到盐的影响。

在培养芽孢杆菌时，可以添加适量的盐，以促进其生长和芽孢的形成。

6. 添加适量的营养因子：芽孢杆菌的生长和芽孢的形成需要一些特殊的营养因子，例如维生素和氨基酸等。

在培养芽孢杆菌时，可以添加适量的营养因子，以促进其生长和芽孢的形成。

7. 适当的培养时间：芽孢杆菌的生长和芽孢的形成需要一定的时间。

在培养芽孢杆菌时，需要适当延长培养时间，以促进其芽孢的形成。

总之，促使芽孢杆菌大量生成芽孢需要综合考虑多种因素，通过合理的营养物质添加、温度、氧气、pH值、盐、营养因子和培养时间的控制，可以有效地促进芽孢的形成。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710161862.6(22)申请日 2017.03.17(83)生物保藏信息CGMCC No.12125 2016.02.01(71)申请人 哈尔滨中科生物工程有限公司地址 266109 山东省青岛市城阳区正阳路196号国际商务港507(72)发明人 隋利涛　曹亚彬　梁晓彤　(74)专利代理机构 北京天奇智新知识产权代理有限公司 11340代理人 陈永宁(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)A61K 35/742(2015.01)A61P 1/00(2006.01)A61P 37/04(2006.01)A23K 50/75(2016.01)A23K 10/18(2016.01)C12R 1/07(2006.01)(54)发明名称一种凝结芽孢杆菌及其用途(57)摘要本发明公开了一种凝结芽孢杆菌及其用途，属于生物工程技术领域。

本发明所述凝结芽孢杆菌(Bacillus Coagulans)zkng160127，于2016年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏单位为哈尔滨中科生物工程有限公司，保藏编号为CGMCC No.12125。

本发明的凝结芽孢杆菌具有耐酸、耐胆盐、抑制病原菌生长的特性，能够有效提高免疫力，促进生长和改善肠道微环境，具有优异的益生作用。

权利要求书1页 说明书10页序列表1页 附图2页CN 106754579 A 2017.05.31C N 106754579A1.一种凝结芽孢杆菌，其特征在于：所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)zkng160127，保藏编号为CGMCC No.12125。

2.根据权利要求1所述凝结芽孢杆菌，其特征在于：分离于健康散养鸡肠道内容物。

3.根据权利要求2所述凝结芽孢杆菌，其特征在于：菌落形态为不透明白色，圆形有光泽，边缘整齐，表面较平且湿润。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911004204.1(22)申请日 2019.10.22(71)申请人 北京大学地址 100871 北京市海淀区颐和园路5号(72)发明人 鲁安怀　朱莹　丁竑瑞　李艳　王长秋　(74)专利代理机构 北京万象新悦知识产权代理有限公司 11360代理人 李稚婷(51)Int.Cl.C12N 1/38(2006.01)C12N 1/20(2006.01)(54)发明名称一种促进芽孢杆菌生长的方法(57)摘要本发明公开了一种促进芽孢杆菌生长的方法，将一定量的矿物材料加入水中加热煮沸，过滤，取滤液配制培养基培养芽孢杆菌，其中所述矿物材料不溶于水，主要成分为方解石和白云石。

本发明利用天然易得的矿物材料在短时间内加快芽孢杆菌的生长，见效明显，成本低廉，且安全无毒，有利于在工业、农业、食品安全等领域大规模推广和应用。

权利要求书1页 说明书6页 附图4页CN 112695007 A 2021.04.23C N 112695007A1.一种促进芽孢杆菌生长的方法，将一定量的矿物材料加入水中加热煮沸，过滤，取滤液配制培养基培养芽孢杆菌，其中所述矿物材料不溶于水，主要成分为方解石和白云石。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述矿物材料主要成分为质量比为2.5:1～3:1的方解石和白云石。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述矿物材料为天然矿物材料，其中包含质量分数为70％～75％的方解石和20％～25％的白云石，以及质量分数为5％的石英。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述矿物材料的颗粒粒径为微米级级别至纳米级别。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每升去离子水中加入50～150g所述矿物材料，然后加热至沸腾，冷却后通过抽滤将矿物材料和水溶液分离，取矿物材料处理后的水溶液配制培养基。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201880021048.7(22)申请日 2018.01.25(30)优先权数据62/450,735 2017.01.26 US(85)PCT国际申请进入国家阶段日2019.09.25(86)PCT国际申请的申请数据PCT/US2018/015125 2018.01.25(87)PCT国际申请的公布数据WO2018/140542 EN 2018.08.02(83)生物保藏信息NRRL B-21661 1997.03.07NRRL B-50421 2010.10.05NRRL B-50455 2010.12.06(71)申请人 拜耳作物科学有限合伙公司地址 美国密苏里州(72)发明人 A ·希尔林　V ·P ·托马斯　周鳳玲　(74)专利代理机构 北京北翔知识产权代理有限公司 11285代理人 孙占华　张广育(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)A01N 63/00(2006.01)C05B 17/00(2006.01)C05F 11/08(2006.01)C12R 1/07(2006.01)C12R 1/01(2006.01)(54)发明名称促进芽孢杆菌属孢子萌发的方法(57)摘要本发明提供了促进促进植物生长的芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属分离株的孢子萌发和/或营养生长的方法，所述方法包括将无机磷酸盐和促进植物生长的芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属分离株同时或惯序地施用到植物、植物部分、植物繁殖体、植物种子和/或植物在其中生长或意欲在其中生长的位置。

权利要求书3页 说明书24页 附图19页CN 110462021 A 2019.11.15C N 110462021A1.一种促进促进植物生长的芽孢杆菌属(Bacillus)或类芽孢杆菌属(Paenibacillus)分离株的孢子萌发和/或营养生长的方法，所述方法包括将无机磷酸盐和促进植物生长的芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属分离株同时或惯序地施用到植物、植物部分、植物繁殖体、植物种子和/或植物在其中生长或意欲在其中生长的位置。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811241570.4(22)申请日 2018.10.24(71)申请人 亚太星原农牧科技海安有限公司地址 226600 江苏省南通市海安县城东镇开发区晓星大道115号(72)发明人 兰玉华　赖水明　张诗　李炯明　陈志敏　吴有林　(74)专利代理机构 上海科盛知识产权代理有限公司 31225代理人 褚明伟(51)Int.Cl.C12N 3/00(2006.01)C12R 1/07(2006.01)C12R 1/01(2006.01)(54)发明名称一种促进芽孢生成的培养基(57)摘要本发明涉及一种促进芽孢生成的培养基，所述培养基包括如下重量份的组分：玉米粉：3-5，蛋白胨：0.3-0.5，豆粕粉：2-3，镁盐：0.01-0.03，氯化物：0.001-0.01，钾盐：0.01-0.03，钙盐：0.01-0.05，锰盐：0.003-0.005。

所述培养基用作液体发酵培养基使用。

与现有技术相比，本发明培养基能够有效缩短芽孢生成的时间，操作简易，并显著提高芽孢产率。

权利要求书1页 说明书5页CN 109468259 A 2019.03.15C N 109468259A1.一种促进芽孢生成的培养基，其特征在于，所述培养基包括如下重量份的组分：玉米粉：3-5，蛋白胨：0.3-0.5，豆粕粉：2-3，镁盐：0.01-0.03，氯化物：0.001-0.01，钾盐：0.01-0.03，钙盐：0.01-0.05，锰盐：0.003-0.005。

2.根据权利要求1所述的一种促进芽孢生成的培养基，其特征在于，所述培养基包括如下重量份的组分：玉米粉：3-5，蛋白胨：0.3-0.5，豆粕粉：2-3，葡萄糖：1-2，镁盐：0.01-0.03，氯化物：0.001-0.01，钾盐：0.01-0.03，钙盐：0.01-0.05，锰盐：0.003-0.005。

(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510435242.8(22)申请日 2015.07.22CCTCC NO: M 2015273 2015.05.03C12N 1/20(2006.01)C12R 1/07(2006.01)(71)申请人江南大学地址214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号申请人江苏大有生物科技发展有限公司(72)发明人张梁 石孔泉 辛瑜(74)专利代理机构无锡华源专利商标事务所(普通合伙) 32228代理人聂启新(54)发明名称一种凝结芽孢杆菌及其高密度发酵方法以及干菌粉制备方法(57)摘要一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)ZS-007，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015273；采用液体发酵工艺，发酵液中凝结芽孢杆菌活菌数1.52×1010cfu/mL 以上、芽孢数1.38×1010cfu/mL 以上、芽孢率90.8％以上。

喷雾干燥获得的干菌粉中，活菌数8.0×1011cfu/g 以上；干菌粉可与淀粉、葡萄糖等填充剂混合后得到凝结芽孢杆菌微生态制剂。

本发明凝结芽孢杆菌具有高密度发酵和高菌体含量的特点，有利于降低产品成本，有助于产品市场推广，对于促进畜禽健康养殖具有积极意义。

(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页 附图1页(10)申请公布号CN 104974966 A (43)申请公布日2015.10.14C N 104974966A1.一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)ZS-007，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015273。

2.一种权利要求1所述的凝结芽胞杆菌的高密度发酵方法，其特征在于具体步骤如下：(1)菌种活化将凝结芽孢杆菌菌种接种至营养琼脂斜面培养基上，25-37℃下培养24-48hr；然后划线转接于营养琼脂茄子瓶斜面，25-37℃下培养24-48hr；营养琼脂斜面培养基及营养琼脂茄子瓶的组成均为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15-20g/L，pH7.2-7.4；(2)摇瓶培养将步骤(1)得到的菌种接种至摇瓶中，振荡培养18-30hr；摇瓶培养基配方：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2-7.4；250mL摇瓶装液量为20mL，500mL摇瓶装液量为50mL；培养条件：摇瓶转速200r/min，温度25-37℃；(3)种子罐扩培种子罐培养基组成：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2-7.4；种子罐体积10-1000L，装液量50-80％；培养条件：搅拌转速180-250r/min，通气量0.5-1.0vvm，温度25-37℃，培养时间18-30hr；(4)发酵罐发酵以0.1％-10％的接种量将步骤(3)得到的种子液接入发酵罐，发酵培养基组成：葡萄糖25g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，初始pH7.0；发酵罐体积1-50m3，装液量50-80％；培养条件：搅拌转速100-200r/min，通气量0.5-0.8vvm，温度25-37℃，培养时间16-48hr；取发酵液镜检时，当90％以上的菌体都形成芽孢时，即到发酵终点，得到发酵液。

专利名称：一种凝结芽孢杆菌的发酵装置专利类型：实用新型专利
发明人：王昆
申请号：CN201921085578.6
申请日：20190711
公开号：CN210620787U
公开日：
20200526
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本实用新型公开了一种凝结芽孢杆菌的发酵装置，包括用于进行菌体发酵过程的顶筒，还包括起到搅拌作用的搅拌轴，同时还包括固定在搅拌轴顶端位置处的电动机，所述顶筒的底端设置有底筒，且顶筒的内部插接有输水管，所述输水管上靠近端头位置处固定安装有控制阀，所述底筒的底端中心位置处连通有出料口。

本实用新型所述的一种凝结芽孢杆菌的发酵装置，通过螺纹接头和螺纹接槽进行顶筒与底筒之间的连接，能够实现装置的组合使用，以此方便进行装置内部的清洗，提高装置清洗的干净程度，通过增设在输水管内部的内辅管，能够方便远距离水源与装置之间的连接，以此方便进行水源的供给，减少装置移动带来的不便，适用不同工作状况，带来更好的使用前景。

申请人：陆良佰佳益康生物科技有限公司
地址：650000 云南省曲靖市陆良县工业园区大莫古片区
国籍：CN
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811183211.8(22)申请日 2018.10.11(83)生物保藏信息CGMCC No. 14413 2017.07.13(71)申请人 山东隆科特酶制剂有限公司地址 276400 山东省临沂市沂水县城北工业园(72)发明人 王兴吉　郭庆文　王克芬　张杰　钱娟娟　郭庆亮　(74)专利代理机构 北京瑞盛铭杰知识产权代理事务所(普通合伙) 11617代理人 栗华楠(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)C12N 9/38(2006.01)C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称一株凝结芽孢杆菌及其液体发酵产酶方法(57)摘要本发明属于发酵工程技术领域，特别涉及一株高产β-半乳糖苷酶的凝结芽孢杆菌及其液体发酵技术。

所述凝结芽孢杆菌具体为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)突变株BR -171，保藏号为CGMCC No.14413。

该菌株能够稳定、高效产β-半乳糖苷酶，通过50L发酵罐液体深层发酵，同时经补料发酵培养84h，产酶可达4000u/ml以上。

所述菌株生产的β-半乳糖苷酶最适反应pH为5.0，在β-半乳糖苷酶pH2.5～8.5范围内仍具有80％以上的活力，该酶的pH耐受性范围适合大部分乳制品；β-半乳糖苷酶最适作用温度为60℃，在65℃下保温2h后剩余酶活仍达到88.4％，具有显著的耐热性；在乳制品行业具有较高的工业价值。

权利要求书1页 说明书7页 附图3页CN 109207402 A 2019.01.15C N 109207402A1.一种高产β-半乳糖苷酶的凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌具体为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)BR -171，保藏号为CGMCC No.14413。

2.如权利要求1所述凝结芽孢杆菌，其特征在于，采用BR -171发酵生产β-半乳糖苷酶的方法具体如下：(1)一级种子罐培养：将种子液以3.5％接种量接入一级种子罐，培养温度32-36℃，搅拌速度200-400rpm，通风量1:1-2,罐压0.05MPa ,培养时间10-20小时；(2)发酵培养：将一级种子罐菌种以5-10％接种量接入发酵罐，培养温度32-36℃，搅拌速度200-700r/m，通风量1:1-3,罐压0.05MPa ,溶解氧15-30％，pH7.0-7.2；培养时间70-100h；补料控制：当发酵液中的还原糖含量至5mg/mL -8mg/mL时，开始添加补料培养基，补料量使发酵液还原糖含量维持为2mg/mL -5mg/mL；放罐标准：60-80％菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610635151.3(22)申请日 2016.08.04(83)生物保藏信息CGMCC No.12553 2016.05.27(71)申请人 北京好实沃生物技术有限公司地址 100044 北京市海淀区高粱桥斜街59号中坤大厦903(72)发明人 李雪平　(74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限公司 11002代理人 王文君(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)C12N 1/18(2006.01)C12N 1/04(2006.01)A23K 10/18(2016.01)C12R 1/07(2006.01)C12R 1/46(2006.01)C12R 1/865(2006.01)(54)发明名称一种含凝结芽孢杆菌的复合菌剂及其制备方法(57)摘要本发明提供了一种含凝结芽孢杆菌的复合菌剂,该复合菌剂含有凝结芽孢杆菌、粪肠球菌及酿酒酵母菌混合发酵的活性菌泥和稳定化保护剂，所述活性菌泥与稳定化保护剂质量比0.3-1.0：1.0-3.0，该复合菌剂中前述三种菌的有效活菌数分别为≥4.5×1010CF U/g 、≥1.0×1010CFU/g、≥4.0×109CFU/g。

本发明的复合益生菌剂不但能促进动物对饲料的消化吸收、节约成本，而且还可调节动物肠道内环境，从而提高动物免疫力、促进动物健康生长，显著提高了动物的生产性能，降低了生产成本。

本发明提供了该复合菌剂的制备方法，解决了单菌发酵生产的能耗高、容易污染、工艺繁琐等问题，提高了各菌种生物活性。

权利要求书2页 说明书8页CN 106047769 A 2016.10.26C N 106047769A1.一种含凝结芽孢杆菌的复合菌剂，其特征在于，含有凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)及酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)和稳定化保护剂。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011636200.8(22)申请日 2020.12.31(83)生物保藏信息CCTCC NO:M 2020371 2020.07.28(71)申请人 安徽丰原生物技术股份有限公司地址 233700 安徽省蚌埠市固镇县经济开发区经二路东、纬四路北(72)发明人 李荣杰　穆晓玲　陈思弘　杨金环　王舒　孟瑶　(74)专利代理机构 北京睿阳联合知识产权代理有限公司 11758代理人 郭奥博　张颖(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)C12P 7/56(2006.01)C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称一种凝结芽孢杆菌及利用其制备L-乳酸的方法(57)摘要本发明提供了一种凝结芽孢杆菌及利用其制备L ‑乳酸的方法。

所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FYLR2，其保藏编号为CCTCC M2020371，其16s rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

本发明提供的凝结芽孢杆菌可以以多种物质作为发酵碳源，通过分批发酵方法或连续发酵方法，具有单批次发酵时间短，总发酵时间长的优点，发酵能力强，可以得到碳源残余量极低甚至为零的发酵液，发酵液中L ‑乳酸浓度高，且纯度极高。

权利要求书2页 说明书12页序列表1页CN 112694993 A 2021.04.23C N 112694993A1.一种凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌具有如SEQ ID No:1所示核苷酸序列的16s rRNA。

2.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FYLR2，于2020年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M2020371。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910134467.8(22)申请日 2019.02.23(71)申请人 温州医科大学附属第一医院地址 325000 浙江省温州市瓯海区南白象(72)发明人 陈永平　金晓芝　陈达之　吴发玲　张磊　潘彤彤　(74)专利代理机构 重庆市信立达专利代理事务所(普通合伙) 50230代理人 包晓静(51)Int.Cl.C12N 5/079(2010.01)C12N 5/0793(2010.01)(54)发明名称一种肝性脑病细胞模型及其构建方法(57)摘要本发明属于脊椎动物的新品种技术领域，公开了一种肝性脑病细胞模型及其构建方法，大鼠星形胶质细胞、神经元细胞的分离、纯化及细胞培养小室里共培养，加入不同浓度氯化铵后形成肝性脑病细胞模型；解决了目前肝性脑病主要采用动物模型，其成本高，耗费时间长，及过于复杂的体内环境对实验结果易产生偏差；而现有的有关肝性脑病的细胞模型均过于粗糙、简单，不能很好的模拟疾病过程的问题。

本发明一种肝性脑病细胞模型的建立，尤其是以星形胶质细胞、神经元细胞共培养及不同浓度高氨为设计对象的模型，对肝性脑病的研究及治疗十分重要。

权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 109880799 A 2019.06.14C N 109880799A权　利　要　求　书1/1页CN 109880799 A1.一种肝性脑病细胞模型的构建方法，其特征在于，所述肝性脑病细胞模型的构建方法包括：步骤一，出生24小时内的SD大鼠用75％酒精消毒，超净台里取两侧大脑皮层组织，37℃条件下加入0.125％胰蛋白酶消化15min后加入含10％胎牛血清DMEM培养基终止消化，洗涤两次后加培养基成初细胞悬液，经200目筛网滤过后接种至多聚赖氨酸包被培养瓶中；于37℃，5％CO2培养箱孵育24h后换液，后每培养3天换一次液；约9-12d，细胞铺满瓶底后，培养瓶内保持无菌于恒温摇床震荡18h，舍弃脱落细胞悬液后，进行GFAP免疫荧光鉴定，鉴定成功的细胞即为原代星形胶质细胞；步骤二，-20℃冷冻麻醉E16-E18母鼠15min后用75％酒精消毒，超净台里取胚胎鼠两侧海马组织，37℃条件下加入0.125％胰蛋白酶消化15min后加入10％胎牛血清DMEM培养基终止消化，洗涤两次后加NB+B27培养基成初细胞悬液，经200目筛网滤过后接种至多聚赖氨酸包被培养瓶中；于NB+B27+0.5mmol/L现配谷氨酰胺培养基，37℃，5％CO2培养箱孵育，贴壁4h换液，后每培养3天换一次液，每一次换半液，约5d，进行MAP2免疫荧光鉴定，鉴定成功的细胞即为神经元细胞；步骤三，无菌条件下，密度为1*105/ml的星形胶质细胞接种在带有Transwell培养小室的下层培养板上于含10％胎牛血清DMEM培养基中过夜，后换成NB+B27+0.5mmol/L现配谷氨酰胺培养基加入不同浓度NH4Cl，于37℃，5％CO2培养箱孵育24h；步骤四，无菌条件下，上述带Transwell培养小室的培养板的微孔膜上接种密度为1* 105/ml的神经元细胞，于37℃，5％CO2培养箱继续孵育24h-48h，形成神经元细胞和星形胶质细胞共培养体系。

法 ( 57 )摘要
一 种富含高 有机 硒凝结芽孢杆菌的 制备方 法，包括如下步骤：S1、凝结芽孢杆菌分离、纯化， 以获得菌种、备用；S2、将步骤S1获得的菌种接种 于不含硒的LB液体培养基中 ，并培养6h后向LB液 体培养基中 加入硒源 ，恒温震荡培养后 ，离心去 除 上清培养基 ，收 集菌体沉淀 ，即获得富 硒凝结 芽孢杆菌。其优点是 ：选 用凝结芽孢杆菌作为原 料进行富硒 ，可以高效的将无机硒转化为有机 硒 、微生物纳米 硒 ，为无机 硒转化为有机 硒提供 了一 种高效 、安全的 途径ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，在安全补硒领域具有 潜在的应用价值。
(74)专利代理机构 武汉河山金堂专利事务所 (普通合伙) 42212
代理人 胡清堂
(51)Int .Cl . C12N 1/20(2006 .01) C12R 1/07(2006 .01)
(10)申请公布号 CN 109762764 A (43)申请公布日 2019.05.17
( 54 )发明 名称 一 种富含高 有机 硒凝结芽孢杆菌的 制备方
权利要求书1页 说明书4页 附图2页
CN 109762764 A
CN 109762764 A
权 利 要 求 书
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1 .一种富含高有机硒凝结芽孢杆菌，其特征在于：包括如下步骤， S1、凝结芽孢杆菌分离、纯化，以获得菌种、备用； S2、将步骤S1获得的 菌种接种于不含硒的 LB液体培养基中 ，并培养6h后向LB液体培养 基中加入硒源，恒温震荡培养后，离心去除上清培养基，收集菌体沉淀，即获得富硒凝结芽 孢杆菌。 2 .根据权利要求1所述的一种富含高有机硒凝结芽孢杆菌，其特征在于：所述步骤S1中 每1g含有凝结芽孢杆菌的样品溶于100mL无菌水中，并在70℃水浴20min、冷却后取0 .1mL涂 布于LB固体培养基平板上培养；当平板上长出单个菌落后，将单个菌落挑取出来接种到LB 液体培养基中，在37-50℃、100-250rpm条件下培养，当培养基变浑浊后，进行平板划线法再 次纯化，每天观察平板上菌落生长情况，重复分离纯化直至菌落形态一致，作为菌种备用。 3 .根据权利要求2所述的一种富含高有机硒凝结芽孢杆菌，其特征在于：于37-50℃下 在LB固体培养基平板上培养。 4 .根据权利要求1所述的一种富含高有机硒凝结芽孢杆菌，其特征在于：所述步骤S2 中，硒源为含亚硒酸根、硒酸根的溶液，且加入硒源后使得培养基中硒含量为0 .1～500μg/ mL。 5 .根据权利要求1所述的一种富含高有机硒凝结芽孢杆菌，其特征在于：所述步骤S2 中，按照2-6％接种量接种于不含硒的LB液体培养基中。 6 .根据权利要求1所述的一种富含高有机硒凝结芽孢杆菌，其特征在于：所述步骤S2 中，在37-50℃、100-250rpm条件下培养6h。 7 .根据权利要求1所述的一种富含高有机硒凝结芽孢杆菌，其特征在于：所述步骤S2 中，在37-50℃、100-250rpm条件下恒温震荡培养24～48h。