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海蜇胶原蛋白提取工艺及促愈合作用研究丁进锋，苏秀榕*，张春丹，李妍妍，徐嘉杰(宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211)摘 要：通过响应面法优化海蜇胶原蛋白的提取工艺，并通过小鼠皮肤创伤模型研究海蜇胶原蛋白的促愈合作用。
通过单因素试验选取因素与水平，根据Box-Benhnken 中心组合试验设计原理，在单因素基础上采用三因素三水平响应面分析法(RSM)，对海蜇胶原蛋白的酸法提取工艺进行优化；采用小鼠皮肤创伤模型，创面外用胶原蛋白，并以云南白药处理为阳性对照，通过十字测量法测量创面大小并计算创面愈合率。
结果显示海蜇胶原蛋白的最佳提取工艺条件为提取时间62.64h 、液料比23.6:1，醋酸浓度0.562mol/L ；动物实验表明海蜇胶原蛋白能够明显缩短伤口愈合时间，对创面修复有促进作用。
响应面法优化得到的提取条件准确可靠；海蜇胶原蛋白具有明显的促愈合作用。
关键词：海蜇；胶原蛋白；响应面；伤口愈合Extraction of Collagen from Jellyfish (Rhopilema esculentum ) and Wound Healing-Promoting Effect in MouseDING Jin-feng ，SU Xiu-rong*，ZHANG Chun-dan ，LI Yan-yan ，XU Jia-jie (Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)Abstract ：The optimum condition of jellyfish (Rhopilema esculentum Kiahinouye 1891) collagen was studied, and the effect of jellyfish collagen on promoting the wound healing was studied based on the model of mouse skin wounds. Experimental factors and their levels were determined by single-factor tests, and then a three factors and three levels test was designed based on the principle of Box-Benhnken design. The extraction conditions were optimized through response surface method (RSM).In the experiment of wound healing in mouse, cutting-skin injures model in mouse were created and wounds were treated with collagen, at the same time yunnan baiyao was used as positive control. The size of wounds was measured through cross measurement, and the healing rates were calculated. Results showed the optimal conditions of jellyfish collagen extraction were obtained as following: extraction time 62.64 h, the solid/water ratio of 1:23.6, acetic acid concentration of 0.562 mol/L. Animal tests showed that treatment with collagen could significantly accelerate the process of re-epithelialization, and promote wound healing.Key words ：jellyfish ；collagen ；Response surface method (RSM)；wound healing中图分类号：TS254.4 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)24-0019-05收稿日期：2010-08-13基金项目：浙江省自然科学基金项目(Y304358)；宁波市科技局重点资助项目(200120041)作者简介：丁进锋(1984—)，男，硕士研究生，研究方向为水产品加工与贮藏工程。
酶-超声波辅助提取海蜇胶原蛋白及其组成分析
薛宇鑫;于阔跃;董高缘;袁颖;吕艳芳;季广仁;李颖畅
【期刊名称】《中国调味品》
【年(卷),期】2024(49)6
【摘要】为确定酶-超声波辅助提取海蜇胶原蛋白的最佳工艺,采用单因素实验和响应面实验对工艺进行优化,考察胃蛋白酶添加量、提取时间、超声时间、超声功率对海蜇胶原蛋白得率的影响,并对胶原蛋白的氨基酸组成和结构进行分析。
结果表明,酶-超声波辅助提取海蜇胶原蛋白的最佳条件为胃蛋白酶添加量1%、提取时间48 h、超声时间32 min、超声功率318 W,此时海蜇胶原蛋白得率为38.03%。
甘氨酸是海蜇胶原蛋白中的主要氨基酸,为24.96%,海蜇胶原蛋白的紫外吸收峰位于235 nm处。
在酰胺A、B带以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带中,有海蜇胶原蛋白的典型红外光谱特征吸收峰。
该研究为海蜇深加工提供了理论基础。
【总页数】7页(P70-76)
【作者】薛宇鑫;于阔跃;董高缘;袁颖;吕艳芳;季广仁;李颖畅
【作者单位】渤海大学食品科学与工程学院生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心;锦州笔架山食品有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】TS254.9
【相关文献】
1.超声波辅助水酶法提取蚕蛹油工艺优化及脂肪酸组成分析
2.超声波辅助酶法提取茶叶籽油及其脂肪酸组成分析
3.超声波辅助酶法提取苹果籽油工艺优化及其脂肪酸组成分析
4.超声波辅助酶法提取牛皮胶原蛋白及其结构表征
5.超声波辅助酶法提取草鱼内脏鱼油工艺优化及脂肪酸组成分析
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开题报告药学复合酶解制备海蜇多肽抗氧化活性的研究一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义癌症已经成为影响人类生命健康与致死的重要因素,经典的化疗药物虽然可以在一定程度上抑制肿瘤生长，但同时也损害了患者的正常细胞与器官，给病人带来极大的痛苦。
随着海洋药物和肿瘤细胞分子生物学研究的快速进展，恶性肿瘤的细胞内信号转导、细胞凋亡的诱导、细胞的转移、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正逐渐被阐明。
以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶(蛋白酪氨酸激酶、芳香化酶、拓朴异构酶I等)作为药物筛选靶点已经被大量研究,并由此发现了选择性地作用于特定靶位的高效、低毒、特异性强的新型抗肿瘤药,即分子靶向药(Molecular targeted drugs， MTD) 和抗体靶向药(Antibody targeted drugs，ATD)，该类型药物已成为当今世界各国抗肿瘤药物研发的重要方向。
生物活性肽（biologically active peptides）是指那些具有特殊生理活性的肽类，是世界上药物及保健品研究的热点，目前通过蛋白酶解生产的活性肽主要来源于陆地的蛋白源，如牛乳酯蛋白、大豆蛋白、玉米醇溶蛋白等。
海洋生物为了适应高盐、高压、低温、缺氧等极端的海洋生境，其蛋白质的氨基酸组成或序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，在种类和数量上也远远超过陆地蛋白资源。
近年来对海洋生物活性肽,特别是抗肿瘤活性肽的研究取得了很大进展。
人们现如今所提取的抗肿瘤蛋白主要有从海鞘、海绵、软体动物、珊瑚中提取的环行多肽，从贝类、海参、乌贼墨等中提取的糖蛋白，还有从海藻、鲎、鲨鱼软骨中提取的多肽。
但是由于海洋资源的开发利用较晚，海洋活性肽尚未形成规模产业，因此，借鉴陆地活性肽开发的酶工程技术，以海洋生物蛋白资源为原料，通过对酶解、制备等工艺的综合研究，即可研制出陆地蛋白源和化学合成所无法生产的系列天然、高效、新颖的生物活性肽。
海蜇胶原蛋白肽的生物活性研究李玉芬;郑明星;叶秀云;林娟【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)008【摘要】以海蜇加工下脚料为原料提取胶原蛋白,酶解制备胶原蛋白肽并对酶解液进行抽滤分离,并对所得不同分子量的胶原蛋白肽进行生物活性研究.结果表明:抽滤分离到四种不同分子量的胶原蛋白肽:分子量＞ 10 kDa(JCP1)、分子量3～10kDa(JCP2)、分子量1～3 kDa(JCP3)和＜1 kDa(JCP4).生物活性研究表明,JCP1具有最强的超氧阴离子自由基清除能力和酪氨酸酶双酚酶抑制效果,其IC50值分别为22.6和11.96 mg/mL,JCP1对酪氨酸酶的抑制类型为可逆混合竞争型抑制;JCP3具有最强的还原力、羟自由基、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除能力和血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性,其IC50值分别为14.9、2.21、0.61和15.8 mg/mL;JCP4具有最强的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力,其IC50值为28.3 mg/mL.【总页数】7页(P67-72,84)【作者】李玉芬;郑明星;叶秀云;林娟【作者单位】福州大学,福建省海洋酶工程实验室,福建福州350116;福州大学,福建省海洋酶工程实验室,福建福州350116;福州大学,福建省海洋酶工程实验室,福建福州350116;福州大学,福建省海洋酶工程实验室,福建福州350116【正文语种】中文【中图分类】TS254.9【相关文献】1.海蜇胶原蛋白肽的酶解制备工艺 [J], 李玉芬;郑明星;叶秀云;林娟2.海洋胶原蛋白肽的制备及生物活性研究进展 [J], 陈华;易湘茜;陈忻;孙恢礼3.海蜇胶原蛋白肽的降血脂及抗氧化作用的研究 [J], 丁进锋;苏秀榕;李妍妍;高翔;岳福鹏;蒋鑫4.海蜇胶原蛋白肽的免疫活性的研究 [J], 丁进锋;苏秀榕;李妍妍;高翔;岳福鹏;蒋鑫5.降血脂、抗氧化海蜇胶原蛋白肽值得一试 [J], 刘凤翊;姜莉莉;杜国丰;张林;杨大苹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
降血脂、抗氧化海蜇胶原蛋白肽值得一试作者：刘凤翊姜莉莉杜国丰张林杨大苹来源：《中国食品》2020年第13期海蜇富含蛋白质、矿物质和维生素等，可作为胶原蛋白的新型原料，应用于滋补和护肤等领域。
海蜇胶原蛋白经过酶解产生胶原蛋白肽，可用于降低血脂指数、肝系数等。
一、研究对象和方法1.研究对象。
由盐渍海蜇中提取海蜇胶原蛋白，经胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解后超滤，得到海蜇胶原蛋白肽。
选取10只年龄、身体状况一样的小白鼠，用高脂饲料喂养6个月，并限制它们的活动，让小白鼠的血脂指数、肝系数升高。
2.研究方法。
将小白鼠分为实验组和对照组，其中实验组5只，放在甲笼中；对照组5只，放在乙笼中。
实验组小白鼠食用海蜇肽，对照组不食用海蜇肽，两组小白鼠在生活环境、身体状况、饮食、作息时间等方面基本一致，无差异（p>0.05）。
6个月后，观察两组小白鼠的血脂指数、肝系数等身体指标的变化，分析海蜇胶原蛋白肽在降血脂及抗氧化方面的作用。
二、结果食用海蜇膠原蛋白肽6个月后，实验组小白鼠的血脂指数、肝系数等身体指标恢复正常，明显低于对照组。
结果表明，海蜇肽能有效降低小白鼠血脂指数和肝系数。
研究结果具有明显差异，有统计学意义（p三、结论通过实验分析对比可以得出结论：海蜇胶原蛋白肽具有降血脂及抗氧化的作用，且抗氧化作用更为明显，可尝试应用于人类治疗。
相关工作人员可深入挖掘海蜇的药用价值、食用价值和皮肤护理价值，让海蜇成为大众养生滋补和女性延缓衰老的佳品。
（基金项目：营口市“企业·博士双创计划”项目-海蜇胶原蛋白高附加值产品的开发；营口理工学院科研项目，项目编号YYL201814。
）作者简介：刘凤翊（1982.11-），女，辽宁营口，博士，营口理工学院副教授，研究方向：海洋资源利用。
开题报告药学酶解制备海蜇多肽工艺条件优化一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义生物活性肽是指那些有特殊生理活性的肽类，是世界上药物及保健品研究的热点，目前通过蛋白酶解生产的活性肽主要来源于陆地的蛋白源，如牛乳酯蛋白、大豆蛋白、玉米醇溶蛋白等。
海洋生物为了适应高盐、高压、低温、缺氧等极端的海洋生境，其蛋白质的氨基酸组成或序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，在种类和数量上也远远超过陆地蛋白资源。
在种类繁多的海洋蛋白氨基酸序列中，潜在着许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解，就能释放出有活性的肽段。
过去两个世纪，人们通过物理、化学和酶法对食品蛋白质进行改性，在改变蛋白质的功能方面做了广泛的研究。
近年来，随着生物技术和酶制剂产业的不断发展，酶法水解蛋白质以达到对蛋白质进行改性的应用越来越普遍。
在酶解蛋白的产物中，活性肽由于具有优良的持水性、胶凝性、乳化性、溶解性、渗透性而增加了其应用的范围，更为重要的是水解后的活性肽增加了原蛋白质或组成氨基酸所不具备的重要生理功能,如抗肿瘤、提高免疫力、抗菌、镇痛、促进矿物质吸收和防治肝脑疾病等，因此己被广泛应用于食品、化妆品和医药等行业。
在国外，对生物活性肽的研究开发较早，因此在利用海洋蛋白资源开发活性肽方面也积累了丰富的经验，特别是日本、美国和欧洲等发达国家把海洋生物中活性肽系列产品的研究与开发作为发展海洋药物和保健食品的一个重要方向，并取得了丰硕的成果。
目前，许多的生物活性肽产品已经实现了工业化。
国外对海洋蛋白酶解的研究主要分为四个方面的内容:(1)海洋蛋白水解的蛋白酶的选择及其条件的优化; (2)海洋蛋白水解物(肽)的加工、功能特性的研究;(3)海洋蛋白水解物(肽)的氨基酸组成、分子量分布以及营养价值的研究;(4)海洋蛋白水解物(肽)的生理活性的研究及其应用。
近年来，鉴于国外海洋蛋白水解制备生物活性肽方面研究的迅猛发展，我国在该领域的研究工作也逐步加强。
水产胶原蛋白肽工艺流程
胶原蛋白肽的工艺主要分为酶解液、过滤、喷雾干燥几部分。
酶解液部分：
1、加入投料鱼鳞重量3％～8％的酶制剂，对预处理后的鱼鳞进行酶解，得到一次胶原蛋白肽酶解液；
2、将滤出的鱼鳞打磨成粉，然后加入加入投料鱼鳞重量3％的酶制剂，得到二次胶原蛋白肽酶解液；
3、将得到的一次胶原蛋白肽酶解液和二次胶原蛋白肽酶解液搅拌混合，然后使用超滤膜进行精滤，将精滤后的胶原蛋白肽液进行蒸煮浓缩，得到胶原蛋白肽浓缩液。
过滤部分：
1、一级膜过滤主要除去活性炭，大分子，悬浮物等杂质，透过液澄清透明，色泽好；
2、二级膜过滤主要用于胶原蛋白肽的分子量分级，根据不同需求，可将绝大多数的胶原蛋白肽集中在某一分子量区间，更易于人体的吸收；
3、三级膜过滤用于产品的脱盐与浓缩，在常温下，使胶原蛋白肽成为低盐母液，并可同时浓缩胶原蛋白肽，对产品无任何影响，并解决了蒸发浓缩时对胶原蛋白肽的影响；
喷雾干燥部分：
过滤后的液体在进喷雾塔前需浓缩达到一定浓度后才可以喷雾干燥，这对提高经济效益和生产效率的意义很大。
胶原蛋白肽的分
子量分布在特定区间，母液体积较处理前减少70%，液体澄清透明，喷雾干燥出来的成本颜色洁白，易溶于冷水。
海蜇胶原蛋白的提取及纯化刘磊;陈伟【期刊名称】《天然产物研究与开发》【年(卷),期】2011(23)1【摘要】Pepsin-solubllised collagen (PSC) which was isolated from the mesogloea of jellyfish (Rhopilema esculentum) ,by limited pepsin digestion and isolated by selective precipitation with NaCl and cm-cellulose chromatography.The PSC exhibited a maximum absorbance at 235 nm.The results of SDS-PAGE and amino acid compositions suggested the purified collagen was type Ⅰ collagen.It was the same with those of the collagen from jellyfish umbrella and the acidsoluble collagen from its mesoglce, such as S.nomurai and Rhopilema asamushi.As a primitive animal, amino analysis of pac revealed the slight difference between invertebrate and vertebrate.%通过胃蛋白酶的限制性酶切、选择性盐析及阳离子交换柱的层析作用,低温从海蜇中胶层提取可得到胃蛋白酶促溶且去除端肽(telopeptide)的胶原蛋白(PSC).紫外-可见扫描测得PSC的最大吸收峰位于235nm.凝胶电泳及氨基酸分析显示这些都符合Ⅰ型胶原的特征,同水母S.nomurai和Rhopilema asamushi来源的胶原蛋白基本一致,作为一个低等动物,其氨基酸分析显示了脊椎动物和非脊椎动物的微小差异.【总页数】4页(P72-75)【作者】刘磊;陈伟【作者单位】江南大学医药学院分子生物学实验室,无锡,214122;江南大学医药学院分子生物学实验室,无锡,214122【正文语种】中文【中图分类】Q58;R282.77【相关文献】1.高压辅助提取海蜇胶原蛋白的工艺 [J], 庄永亮;李八方;赵雪;闫鸣艳;张秀坤2.海蜇胶原蛋白提取工艺及促愈合作用研究 [J], 丁进锋;苏秀榕;张春丹;李妍妍;徐嘉杰3.海蜇伞部胶原蛋白的提取及其理化性质 [J], 庄永亮;赵雪;张朝辉;闫鸣艳;李八方4.海蜇皮营养成分分析及胶原蛋白的提取 [J], 郝更新;杨燊;戴燕彬5.海蜇Ⅰ型胶原蛋白的提取及结构特性研究 [J], 冯玲玲;冯进;李春阳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
海蜇胶原蛋白提取工艺及促愈合作用研究丁进锋;苏秀榕;张春丹;李妍妍;徐嘉杰【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2010(031)024【摘要】通过响应面法优化海蜇胶原蛋白的提取工艺,并通过小鼠皮肤创伤模型研究海蜇胶原蛋白的促愈合作用.通过单因素试验选取因素与水平,根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理,在单因素基础上采用三因素三水平响应面分析法(RSM),对海蜇胶原蛋白的酸法提取工艺进行优化;采用小鼠皮肤创伤模型,创面外用胶原蛋白,并以云南白药处理为阳性对照,通过十字测量法测量创面大小并计算创面愈合率.结果显示海蜇胶原蛋白的最佳提取工艺条件为提取时间62.64h、液料比23.6:1,醋酸浓度0.562mol/L;动物实验表明海蜇胶原蛋白能够明显缩短伤口愈合时间,对创面修复有促进作用.响应面法优化得到的提取条件准确可靠;海蜇胶原蛋白具有明显的促愈合作用.【总页数】5页(P19-23)【作者】丁进锋;苏秀榕;张春丹;李妍妍;徐嘉杰【作者单位】宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江,宁波,315211;宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江,宁波,315211;宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江,宁波,315211;宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江,宁波,315211;宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江,宁波,315211【正文语种】中文【中图分类】TS254.4【相关文献】1.史氏鲟鱼软骨提取物提取工艺及促创面愈合的研究 [J], 饶秋华;罗土炎;曹治云;罗钦;李弈君;王少珍;张志灯2.海蜇伞部酶促溶性胶原蛋白的热变性动力学 [J], 孙睿;王煦松;秦磊;张玉莹;徐献兵;杜明;董秀萍;李冬梅3.正交试验优化黄河鲤鱼鳞酶促溶性胶原蛋白提取工艺 [J], 肖枫;朱文学;康怀彬;刘丽莉;贺家亮;任国艳4.海蜇胶原蛋白肽的降血脂及抗氧化作用的研究 [J], 丁进锋;苏秀榕;李妍妍;高翔;岳福鹏;蒋鑫5.改进型胶原蛋白海绵填塞拔牙窝后止血和促愈合的小鼠实验研究 [J], 吕晓玉; 欧明明; 黄晓峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
海蜇胶原蛋白肽的酶解制备工艺李玉芬;郑明星;叶秀云;林娟【摘要】以海蜇加工下脚料为原料提取胶原蛋白,以还原力(RP)和水解度(DH)为指标,采用响应面法研究了酶解温度、酶解时间、pH、料液比、酶添加量对还原力和水解度的影响,得到最佳酶解胶原蛋白的工艺条件;并进一步与复合酶水解工艺进行比较,确定海蜇胶原蛋白肽的最优制备工艺.结果表明:胰蛋白酶的最优酶解条件为:温度44℃、pH8.5、料液比0.50 g/mL、酶添加量3.0％和酶解时间4h;风味蛋白酶的最优酶解条件为:温度44℃、pH7.5、料液比0.56 g/mL、酶添加量4.0％和酶解时间4h;进一步进行复合酶实验,结果表明采用风味蛋白酶和胰蛋白酶分别在其最适条件下进行先后酶解获得的酶解液的DH和RP最高,分别为(71.56％±0.0076％)和(0.341±0.0101).%Taking jellyfish processing residues as rawmaterial,reducing power (RP)and degree of hydrolysis (DH)as indicators,the optimal digestion temperature,digestion time,pH,solid-liquid ratio,enzyme amount were analysed by response surface method according to the degree of hydrolysis of collagen.Then comparing with composite enzyme hydrolysis process,the optimum preparation technology of collagen was analysed.The result showed that temperature of 44 ℃,pH8.5,solid-liquid ratio of 0.50 g/mL,protease addition of3.0％,extraction time of 4 h and temperature of 44 ℃,pH7.5,solid-liquid ratio of 0.56 g/mL,protease addition of4.0％,extraction time of 4 h were determined as the optimal proteolysis conditions to prepare antioxidant peptides from jellyfish using trypsin and flavourzyme,respectively.The effects of multiple enzymes on DH and RP of the collagen peptide werefurther investigated.Sequential treatment of trypsin and flavourzyme under their optimal conditions on collagen led to peptide products with the highest values of DH(71.56％± 0.0076％)and RP(0.341 ± 0.0101).【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)007【总页数】9页(P132-139,145)【关键词】胶原蛋白;胶原蛋白肽;胰蛋白酶;风味蛋白酶;水解度;还原力【作者】李玉芬;郑明星;叶秀云;林娟【作者单位】福州大学福建省海洋酶工程实验室,福建福州 350116;福州大学福建省海洋酶工程实验室,福建福州 350116;福州大学福建省海洋酶工程实验室,福建福州 350116;福州大学福建省海洋酶工程实验室,福建福州 350116【正文语种】中文【中图分类】TS254.9自由基的累积会造成机体严重损伤,与DNA损伤、心血管疾病、衰老和癌症等疾病息息相关。
早期对机体内自由基的清除多采用一些合成类抗氧化剂,如丁羟甲苯和叔丁基羟基茴香醚等。
但是由于这些合成类抗氧化剂对人体具有较强的毒副作用,我国政府已经限制了该类添加剂的用量。
因此寻找天然、高效且无毒副作用的新型抗氧化剂是近几年的研究热点。
一些研究表明,胶原蛋白肽对自由基具有良好的清除效果,是一种天然的抗氧化剂。
Li等[1]使用不同蛋白酶酶解猪皮胶原蛋白,得到氨基酸序列为QGAR的抗氧化肽,具有较高的DPPH自由基清除能力、金属离子螯合能力和脂质过氧化抑制能力。
胶原蛋白肽拥有独特的氨基酸组成,拥有多种生理功能活性[2-3],如降血压、抗黑色素、免疫活性、促进钙吸收和抗关节炎等,具有广阔的应用前景。
目前制备胶原蛋白肽最常用的方法是酶解法,其工艺主要包括单酶酶解法[4]和复合酶酶解法[5]。
较为常用的提取用酶为胃蛋白酶[6]、中性蛋白酶[7]、碱性蛋白酶[8]和胰蛋白酶[9]等。
研究发现,单一酶作用范围较小,只能使小部分的蛋白降解;而选用复合酶法进行水解,可有效增大底物的水解程度,可以使得更多的活性氨基酸残基暴露出来[10]。
表1 不同蛋白酶的最适酶解条件Table 1 Optimal enzymatic conditions of different protease酶种类胃蛋白酶胰蛋白酶碱性蛋白酶中性蛋白酶风味蛋白酶木瓜蛋白酶温度(℃)373750505050pH2.08.08.07.07.07.0本文以海蜇加工下脚料为原料提取胶原蛋白,在单因素实验的基础上,采用响应面法对海蜇胶原蛋白肽的单酶水解工艺进行优化,并进一步与复合酶水解工艺进行比较,确定海蜇胶原蛋白肽的最优制备工艺,为海蜇加工下脚料的综合利用提供理论依据。
1 材料与方法1.1 材料与仪器海蜇加工下脚料已除盐的南蛰海蜇皮,海蜇体呈伞盖状,通体呈半透明,福建亿达食品有限公司;丙酮、碳酸氢二钠、Tris、浓盐酸(HCl)、福林试剂、谷胱甘肽、胃蛋白酶(1.58 U/mg)、胰蛋白酶(4.40 U/mg)、还原型谷胱甘肽国药集团;风味蛋白酶(7.62 U/mg)、木瓜蛋白酶(13.73 U/mg)、中性蛋白酶(9.02 U/mg)、碱性蛋白酶(84.63 U/mg) Solarbio公司;2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、血管紧张素转化酶(ACE)、马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)、马尿酸、Tyrosinase Sigma公司;DPPH Aladdin公司。
T6新世纪紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司;HWS24电热恒温水浴锅上海一恒科技有限公司;THZ-82恒温振荡器国华企业;BC/BD-320HCN卧式冷藏冷冻转换柜海尔集团;TP-114分析天平、UB-7pH计 DENVER INSTRVMENT;U-2910双光束分光光度计、CF16R-XI高速冷冻离心机 HITACHI;移液枪 Eppendorf;GL-3250C漩涡混合器 Qilinbeier;BL25H11搅拌机广东美的生活电器制造有限公司。
1.2 实验方法1.2.1 海蜇胶原蛋白肽的提取将海蜇加工下脚料用清水冲洗,将除盐的海蜇用搅拌机搅碎20 min,过滤沥干;添加丙酮溶液没过海蜇,静置1 d,蒸馏水清洗至无异味,过滤沥干;置于0.1 mol/L磷酸氢二钠溶液中浸泡三次,每3 h更换一次溶液,蒸馏水清洗至中性,过滤沥干,4 ℃冰箱存放备用。
取一定质量的海蜇皮匀浆,加入一定体积相应pH的缓冲液至一定料液比,添加一定比例的蛋白酶,置于一定温度酶解一定时间;待反应结束后,将酶解液置于沸水浴中加热10 min使蛋白酶失活,13000 r/min离心10 min,取上清多肽液进行水解度(DH)和还原力(RP)测定。
1.2.2 缓冲液体系 Phosphate缓冲体系:pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的缓冲液由0.1 mol/L的Na2HPO4·12H2O和0.1 mol/L NaH2PO4·2H2O配制而成。
Tris-HCl缓冲体系:pH(8.0、8.5、9.0)的缓冲液由0.1 mol/L的Tris和0.1 mol/L 的HCl配制而成。
1.2.3 蛋白酶的选择以DH和RP为指标,在酶添加量100 U/g、料液比1∶1(g/mL)和酶解时间4 h条件下,比较六种不同蛋白酶在其最适酶解条件(见表1)下对海蜇蛋白的酶解效果,并选用最适的两种蛋白酶用于下一步实验研究。
1.2.4 单因素实验1.2.4.1 温度对酶解效果的影响在酶添加量1.0%、酶解时间2 h、料液比1∶2 (g/mL)和pH7.0条件下,考察了不同温度(30、35、40、45、50、55 ℃)对胰蛋白酶和风味蛋白酶酶解效果的影响,测定酶解液的DH和RP。
1.2.4.2 pH对酶解效果的影响在酶添加量1.0%、酶解时间2 h、料液比1∶2(g/mL)和温度45 ℃条件下,采用两种不同缓冲体系(Phosphate缓冲体系和Tris-HCl缓冲体系)考察了不同pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)对胰蛋白酶和风味蛋白酶酶解效果的影响,测定酶解液的DH和RP。
1.2.4.3 料液比对酶解效果的影响在酶添加量1.0%、酶解时间2 h、温度45 ℃和pH8.0(pH7.0)条件下,比较不同料液比[3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 (g/mL)]下胰蛋白酶(风味蛋白酶)的酶解效果,测定酶解液的DH和RP。
1.2.4.4 酶添加量对酶解效果的影响在料液比1∶1 (g/mL)、酶解时间2 h、温度45 ℃和pH8.0(pH7.0)条件下,比较了不同酶添加量(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%)对胰蛋白酶(风味蛋白酶)酶解效果的影响,测定酶解液的DH和RP。
1.2.4.5 酶解时间对酶解效果的影响在酶添加量3.0%(酶添加量4.0%)、料液比1∶1 (g/mL)、温度45 ℃和pH8.0(pH7.0)条件下,测定不同酶解时间(2、3、4、5、6、7 h)下胰蛋白酶(风味蛋白酶)酶解液的DH和RP。
1.2.5 酶解胶原蛋白的响应曲面实验1.2.5.1 响应面实验设计在单因素实验的基础上,以DH和RP为响应值,以蛋白酶的酶解温度、pH和料液比作为自变量进行响应曲面实验,在Box-Behnken中心组合实验进行设计,确定海蜇蛋白单酶最优酶解工艺。
