UltiMate3000型高效液相色谱仪操作规程

Ultimate 3000型高效液相色谱仪自主操作培训教材福州大学测试中心2018年9月第一部分Ultimate 3000型高效液相色谱原理和仪器配置一、液相色谱原理简介1、色谱法起源色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。

后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

2、液相色谱法的分离原理溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相(stationary phase)时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子交换、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。

又称为色层法、层析法。

英文为High Performance Liquid Chromatography，简称为HPLC。

3、HPLC分离模式包括反相模式 (RP-LC)；正相模式 (NP-LC)；离子对色谱 (IPC)；离子交换色谱 (IEC)；体积排阻色谱 (GPC/GFC)；亲和色谱（AC）等。

其中，反相和正相模式又属于液液分配色谱。

•流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。

正相与反相的出峰顺序相反；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。

C-18柱（常用反相柱）。

4、HPLC与经典液相色谱方法以及气相色谱（GC）方法的比较4.1 HPLC与经典液相色谱方法比较高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。

高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。

可以在数分钟内完成数百种物质的分离。

高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检测器——10-11g。

题目戴安U3000分析型液相色谱仪使用标准操作规程制定审核批准制定日期审核日期批准日期颁发部门质量部颁发数量份生效日期分发单位质检科、工程设备科1、目的：建立戴安U3000分析型液相色谱仪标准操作规程。

2、适用范围：本规程适用于戴安U3000分析型液相色谱仪的操作。

3、责任人：使用者。

4、内容：4.1准备工作4.1.1流动相的超声过滤，样品的前期处理。

4.1.2在线清洗液的更换（10%的甲醇水溶液，一周2次）。

4.2开机4.2.1插上仪器，电脑的各电源线。

4.2.2依次打开稳压器，电脑，泵，自动进样器，紫外检测器的电源。

4.3各部件的准备操作4.3.1在电脑上启动“服务监视器”，然后双击桌面的变色龙图标“chromeleon”打开软件。

4.3.2点击快捷方式见“默认面板”进入面板的设置。

4.4进入泵的面板：4.4.1点击“连接”；在流动相A、B、C、D选择将要做的（比如要用A相，就把它设置成100%）4.4.2将仪器的“Purge”阀拧开，点击软件上的“purge”进行排气泡（若没进行更换流动相，可以不用排气泡），大约4分钟后；再次点击“purge”停止排气泡，（purge设置3.00ml/min）将仪器的“Purge”阀拧紧即可；4.4.3将流速设置1.00ml/min（根据实际需要自己设置相应的流速），将压力的下限值设在8个左右，上限值设置280左右；打开泵的流速。

4.5进入自动进样器的面板4.5.1点击连接，在“温箱控制”设置实际所需要的稳定值4.5.2若注射器内有气泡，点击“灌注针”进行气泡的排除；若针需要清洗，点击“清洗针”4.5.3若要进行满环进样（20uL），点击“更多选项”，在“进样模式”选择“FullLoop”否则选择戴安U3000分析型液相色谱仪使用标准操作规程编码：QL-SB-SOP-357-00 “Partial”;4.6进入紫外检测器的面板4.6.1点击“连接”4.6.2点击“紫外灯”将氘灯打开（若需要可见光，请点“可见灯”）4.6.3在“波长”栏设置实际所需要的波长4.7采集波长在灯打开3分钟后，点击快捷方式键蓝色的圆点，在弹出的窗口选择紫外“UV”，点击确定，即开始采集基线。

RIGOL-L3000高效液相色谱仪1.目的：明确RIGOL-L3000高效液相色谱仪使用及维护保养。

2.范围：本规程适用于RIGOL L-3000高效液相色谱仪使用及维护保养。

3.职责：仪器操作员对本操作规程负责实施，QC主管、质量部长负责监督。

4.操作环境：电压：220V±10% 频率：50~60HZ 温度：20～30℃；相对湿度<80％；远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施，避免仪器处于强对流空气环境下。

5.内容：5.1 准备：5.1.1配制所需的流动相(HPLC级)，用对应的0.45μm微孔滤膜过滤，超声脱气20min；5.1.2准备系统清洗液。

5.1.3配制样品和标准溶液，用对应的0.45μm针式过滤器过滤。

5.1.4根据相应的检测方法更换合适的色谱柱(注意方向)。

5.1.5检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否正确连接，废液管和废液瓶是否接好。

5.2依次开启L-3000各模块电源，打印机、电脑显示器与主机电源。

开通电源后仪器将进行自检，待自检结束后，运行RIGOL色谱工作站软件。

5.3更换流动相，排气泡：5.3.1将对应的滤杯放入装有少量新流动相的烧杯中；5.3.2逆时针转动泵的排液阀旋钮90°～ 180°以打开排液阀；5.3.3用针筒连接放空阀排液管，抽尽泵头内的空气，直至管线内无可见‘气柱’；5.3.4打开设备监视器界面,点击“清洗”，将流速设置为5mL/min，冲洗2分钟；5.3.5排完空气后，将排液阀顺时针旋转拧紧，关闭排液阀。

5.4 开启在线清洗：打开在线清洗，设置清洗速度为中速，用10%异丙醇水溶液清洗泵头。

5.5方法设置5.5.1 通过RIGOL色谱工作站选择所需的使用方法。

如需新建方法，依次设置仪器各组件、积分和校正等参数，然后保存并发送方法；5.5.2 点击“发送方法”，系统将自动开始平衡。

5.6 平衡系统5.6.1检查管路连接、柱接头及系统各处是否漏液，如漏液可按各组件相应的手册指导予以排除。

UItiMate 3000高效液相色谱仪标准操作规程起草人日期年月日审核人日期年月日日期年月日日期年月日质量部审核日期年月日批准人日期年月日颁发部门质量部执行日期年月日分发部门检测中心〔3〕替换的文件名及编号修订的原因、目的：1.目的建立UItiMate 3000型高效液相色谱仪操作规程，使高效液相色谱仪的操作标准化、规范化。

2.适用范围适用于本公司UItiMate 3000型高效液相色谱仪的操作。

3.责任仪器使用人员负责本文件的执行，检测中心主任负责监督和指导。

4.依据UItiMate 3000型高效液相色谱仪使用说明书。

5.内容5.1.型号及仪器组成5.1.1.型号：UItiMate 3000型5.1.2.仪器组成：UItiMate 3000四元泵+UV检测器+自动进样器+柱温箱5.2.操作程序5.2.1.使用前的准备工作5.2.1.1.接入稳压电源将稳压电源的输入端插头插在墙上的插孔上。

5.2.1.2.打开电源开关按下稳压电源前面板的“ON”键，大约一分钟后，稳压电源将正常供电。

5.2.1.3.更换泵头清洗瓶中溶液：必须采用非循环模式进行冲洗，将一只1000mL容量的清洗瓶置于U3000系统上方的托盘中，清洗液为10%左右的甲醇或异丙醇的水溶液，所使用的试剂必须为色谱纯，用超纯水或二次蒸馏水来配置。

5.2.2.打开仪器电源开关打开仪器各部份后面板电源线下方的电源开关，仪器将开机自动进行自检。

各部分自检成功后，方可正常进行以下各步操作。

（备注：各电源开关没有先后顺序；）；5.2.2.1.打开电脑:打开电脑，等待约1～2分钟，变色龙服务监视器将会自动启动。

然后双击桌面的变色图标，打开软件。

5.2.3.四元泵：5.2.3.1.确定好各通道的流动相后，先向上掀开泵头前面板，然后拧松快速清洗阀（反时针两圈左右）。

然后在软件中按此“冲洗”键，泵将以3.0 mL/min的速度自动快速清洗泵内残留的气泡，5分钟将自动停止（备注：需要依次对各通道单独进行排气，不能同时进行）5.2.3.2.排气结束后，将清洗阀拧紧，调节好各通道的流动相比例及流速，启动“马达”按钮即可；5.2.4.自动进样器的清洗：自动进样器的清洗分三个部分，一般在每天或每次使用自动进样器前需先进行如下三个步骤排除自动进样器的气泡。

目的：建立戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程，确保仪器使用的规范化、标准化。

范围：适用于戴安U3000高效液相色谱仪的操作。

责任：QC主管、仪器操作员对本规程的实施负责。

内容：内容：1、流动相的配制1.1首先配制常用流动相以及泵后密封圈清洗液小瓶（5%-10%甲醇溶液)如下图（图1）。

配制过程中有机相必须用有机系0.45 µm的滤膜过滤，水相或缓冲盐用水系0.45µm的滤膜过滤。

然后超声20分钟，超声时应避免超声温度过高以使有机相挥发。

一般流动相可以保存3天，含缓冲盐的流动相必须临用新配，注意水相、5%甲醇或10%甲醇溶液（清洗液）必须每天更换！1.2 D通道抽滤并超声的10%甲醇；注意各通道必须保证流动相充足，当流动相体积150ml2、开机、仪器方法设置。

2.1稳压电源打开JJW-3KV A稳压器“ON”位置，等2-3分钟稳定后，按下ON-LINE 1KV A 蓄电池电源前面板的“ON”，等2-3分钟。

2.2 打开泵(Pump)、自动进样器(Sampler)及所需检测器后面板电源线下方的电源开关，仪器将开机自动进行自检。

各部分自检成功后，方可进行以下各部操作。

2.3 打开电脑，等5-7分钟，电脑稳定。

2.4打开软件，连接仪器。

打开变色龙软件控制面板双击电脑桌面的“变色龙Chromeleon 7”图标。

出现如下对话框点击“确定”后出现进样器界面（图2）：（图2）输入自己的用户名及密码，进入软件界面如下图（图3）（图3）在图3左侧出现两台仪器，一台为—U3000，一台为—U3000-01，根据需要选择操作的仪器。

在主页项中连接“泵”，“Sampler(自动进样器)”，及所需检测器，UV是紫外检测器，FLD是荧光检测器，A2D是蒸发光和示差折光检测器（图4）。

然后点击“泵(Pump)”选项，再点击下方的“更多选项”（图5-6），（图5）将“通过进样器”后“Yes”改为“NO”。

U-3000操作手册1．操作条件：电压：220V, 温度：10-40℃，湿度：10%-85%。

2．注意事项：密封圈清洗溶液为1：9甲醇/水，每次使用前更换，样品必须经过0.45μm 的滤膜过滤，流动相也必须经过0.45μm过滤（色谱纯除外）并脱气。

3．若流动相含有无机盐或酸，每天仪器使用完后，要用5%：95%的甲醇/水清洗系统至少30min后再用100%甲醇冲30min关机。

开机则用5%：95%的甲醇/水冲10min，换流动相。

先开仪器电源，再开电脑，待电脑右下角的服务器监测器由黄色变为灰色，双击面上的图标，进入工作站，如图为工作站根目录，点击快捷栏内的“default panel tabset”出现以下界面，点开“”My Computer”前加号：选择“Chromeleon Server”,“OK”，出现下面的控制界面，分别在“Pump”下设置比例和流速如果流路内有气泡，拧松泵混合器上的“Purge”阀，点上图内的“Purge off”前的按钮，快速排气泡，待气泡排完后，上图内的“Purge off”前的按钮停止，拧紧“Purge”阀，在“Col．Comp”下设置柱温，在“VWD”下开氘灯，设置波长。

系统开始平衡，点快捷栏内的兰色圆点“”采集基线，待基线稳定后，点“”停止采集基线，准备测样。

新建文件夹（第一次使用必须）点快捷栏内“”，回到根目录，右键点击根目录，，点“New Directory”，输入文件夹名称，“OK”。

建立程序文件点“File”下“New”，“OK”，“下一步”，设置温度，“下一步”，设置流速和各通道比例，“下一步”，设置取样和推样速度，“下一步”，设置采集时间，选择采集信号，“下一步”，“下一步”，“下一步”，设置波长，“下一步”，“完成”，如需要，可更改一些参数后，点右键，选“Check”，“确定”，点快捷栏内的“”，选择保存路径，输入名称后“Save”，关闭窗口。

新建方法文件点“File”下“New”，点“File”下“Save As”选择保存路径，输入名称后“Save”，关闭窗口。

省产品质量监督检验检验研究院仪器设备操作规程（cg———2016）设备编号（）仪器名称U3000 液相色谱仪操作规程编制审核批准2016 年月日U3000高效液相色谱仪操作规程一基本原理U3000高效液相色谱系统由：①输液泵②自动进样器、③色谱柱温箱、④检测器、⑤数据处理系统组成。

使用高效液相色谱时，液体待检测物由流动相带入色谱柱，通过压力在色谱柱中移动，由于试样中各组分在色谱柱固定相与流动相间分配或吸附特性的差异，不同的物质组分顺序离开色谱柱，经检测器检测得到不同的色谱峰信号，依据组分的保留时间和响应值（峰面积或峰高）进行定性和定量分析。

二操作前准备1.1流动相的配制：1.1.1根据所供试品的性质、相关的文献资料、工作经验等按比例配制流动相。

1.1.2根据流动相的性质确定采用有机膜（0.45um）还是水相膜(0.45um)对流动相进行过滤。

1.1.3将过滤后的流动相进行超声脱气10~15分钟。

1.2对照品供试品处理：1.2.1称取或量取适量的对照品或供试品，用适当的溶剂（最好采用流动相或流动相的主成分）进行充分溶解（也可借助超声波进行超声溶解），使其浓度为0.1~1mg/mL（根据检测结果再适当调节溶液的浓度）。

1.2.2根据对照品或供试品的性质确定采用有机针头滤膜（0.45um）还是水相针头滤膜(0.45um)进行过滤。

1.3色谱柱的选择：根据样品的性质选择适当的色谱柱。

三操作顺序1.开机2.1打开UPS（不间断电源）电源，打开仪器接线板电源开关；2.2打开电脑显示器电源，打开电脑主机电源（POWER），启动电脑；2.3依次打开泵、自动进样器、柱温箱、检测器的电源；2.4双击屏幕右下角“服务管理器”快捷图标,出现对话界面后点击“启动仪器控制器”启动,等显示“本地仪器控制器运行空闲”,可以关闭界面。

2.5双击在桌面上的Chromeleon 7图标（工作站主程序）。

2.6在左下方点击仪器，则在右边会自动显示该仪器控制面板。

文件类型：Work Instruction 部门: China Service T&A UltiMate 3000 Autosampler Operating InstructionsUltiMate 3000 Variable Wavelength Detectors Operating InstructionsUltiMate 3000 Diode Array Detectors Operating InstructionsU3000液相色谱仪操作注意事项1.目的规范U3000液相色谱仪开关机注意事项，正确使用仪器，保证检测工作顺利进行、操作人员人身安全和设备安全。

2.适用范围适用于U3000液相色谱仪(仪器配置:Pump+WPS+TCC+VWD/DAD+CM7.2)的使用操作。

3.职责3.1 U3000液相色谱仪操作人员应严格按照本规程进行仪器的开关机，对仪器进行正确地日常维护，并填好使用记录。

3.2 U3000液相色谱仪保管人员负责监督仪器操作是否符合规程，对仪器进行正确地开关机、定期维护、保养。

3.3 室主任负责仪器综合管理。

4．开关机操作程序4.1 开机注意事项4.1.1流动相的配制：根据所供试品的性质、相关的文献资料、工作经验等按比例配制流动相；根据流动相的性质确定采用有机膜还是水相膜对流动相进行过滤；将过滤后的流动相进行超声脱气5分钟。

4.1.2样品的处理：称取或量取适量的对照品或供试品，用适当的溶剂（最好采用流动相或流动相的主成分）进行充分溶解（也可借助超声波进行超声溶解），根据检测结果再适当调节溶液的浓度;样品尽量过滤（有机膜或者水膜）。

4.1.3请确认：清洗泵头密封圈的10%异丙醇或甲醇水溶液没有走空，洗针的D通道或者洗针液瓶没有走空。

4.1.4依次打开泵、自动进样器、柱温箱、检测器的电源；4.1.5双击电脑右下角“服务管理器/Chromeleon Service Manager”快捷图标,出现对话界面后点击“启动仪器控制器/Start Instrument Controller”,等显示“本地仪器控制器运行空闲/The local Instrument Controller is running idle ”,可以关闭界面。

Ultimate 3000型高效液相色谱仪操作规程一、开机前的准备工作1.检查设备电源、流路、信号连接是否完好。

2.流动相：配制相应的流动相，经0.45µm微孔滤膜抽真空过滤后，超声脱气15分钟，必须使用色谱纯的溶剂，水或缓冲盐溶液要用超纯水；盛放样品溶液和流动相所用的玻璃容器必须用超纯水清洗。

3.样品溶液：按方法取样或配制标准样品溶液，0.45µm滤膜过滤。

二、仪器的组成及开机平衡系统1.仪器组成：本仪器由Ultimate 3000分离单元、DAD-3000（RS）检测器、Chromeleon 7色谱工作站和打印机组成。

Ultimate 3000分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机，可容纳120个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞密封垫清洗系统，溶剂托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。

2.开机：依次接通Ultimate 3000分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。

接通Ultimate 3000分离单元后，仪器开始自检约20s，打开电脑，双击电脑右下角的变色龙软件的服务管理器，单击“启动Chromeleon仪器控制器”，激活服务管理器，双击电脑桌面的“Chromeleon 7”图标，进入变色龙软件。

3.脱气（Degasssger）：向上掀开泵头前面板，拧松快速清洗阀（逆时针两圈左右），然后按“冲洗”键，泵将以3.0ml/min的速度自动快速清洗泵类残留的气泡，5min将自动停止。

若想手动停止，只要再按“冲洗”键，将停止清洗。

4.清洗有缓冲盐的那个通道前后，一定要用超纯水清洗管路和泵头，以防止缓冲盐溶液直接与纯有机相混合而产生结晶堵塞比例阀。

5.清洗完毕，先停泵，再拧紧快速清洗阀。

切记不要在泵未停止清洗前拧紧快速清洗阀。

三、编辑仪器方法1.在Chromeleon Console“创建”菜单中点击“仪器方法”。

2.采集时间和采集通道设置：在弹出的“仪器方法向导”窗口中输入分析运行时间；在“诊断通道”项下点击“取消选择所有通道”，点击下一步。

U3000戴安液相色谱仪操作规程1.5接通电源，检查插座上各插孔的指示灯是否显示正常。

1.6准备好超声过的流动相和流路冲洗溶剂。

2开机2.1撤下设备停用卡，换上设备运行卡。

2.2换上A、B、C、D管路的溶剂：A、B、D管路为溶剂管路，可以放置流动相，C管路为洗进样针管路。

一般A路放甲醇，B路为纯化水，C路放5%甲醇水，D路放流动相。

C管路在运行样品时用5%甲醇水清洗进样针，做完样品用纯甲醇灌满，C管路中软管为冲洗泵头管路，并随仪器开机工作。

2.3运行检查：从上至下打开仪器各部件开关，待机器自检，核实无异常。

2.4开启仪器工作站：打开电脑，双击电脑桌面上仪器图标，显示工作站主界面；2.5脱气操作：在工作站主界面上，点击泵：XPG-3X00(RS,SD)，将旁通阀开关逆时针旋转一圈（自动进样器上），冲洗顺序为B→C→D→A，每个管路冲洗5分钟，每个管路脱气前，需先设参数为100%，再依次点击冲洗→忽略警告执行，每个管路冲洗时间均在自动进样器显示屏上显示（注意：D管路冲洗完成后，需将D管路设置为0，点击开始冲洗，方可冲洗A管路）。

冲洗排气完成后关闭旁通阀。

2.6清洗进样器在WPS-3000 SL项下启动栏中依次点灌注注射器、清洗缓冲环、外部清洗针。

注意：外部清洗针运行完毕后，点击进样阀栏中到进样位置。

2.7升流速：在XPG-3X00(RS,SD)界面，在流速/压力栏中填写所需的流速（注意：流速设定要0.2个单位逐步到所设定的流速，待柱压稳定后，再增加流量）。

2.8设柱温箱温度在TCC-3x00项下温度控制栏中设所需温度，点击回车。

2.9点紫外灯在VWD-3x00（RS）项下信号栏中输入所需波长，在命令栏中点击紫外灯（切记点一下）注意：待温度稳定5～10分钟后再开灯以上各项必须点击各项下的模块连接栏中连接才能执行命令。

待紫外灯点亮后可在xPG-3x00（RS，SD）项下流速/压力栏中输入所需流速开始平衡，平衡时间约30分钟。