降解大豆抗原蛋白菌株的的筛选及发酵条件探究的方案设计

２００８．０５３２大豆含有丰富的蛋白质和平衡的氨基酸，是人和畜禽优质的植物性蛋白源。

但其中含有的抗原蛋白会导致人和动物的过敏反应也越来越受到人们的关注。

大豆抗原蛋白是指大豆及其制品中含有的一些大分子蛋白质或糖蛋白，可引起人或畜禽产生过敏反应，又称为致过敏因子。

研究表明，大豆中主要的抗原物质有２种：大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白。

据报道，生大豆中具有抗原活性的大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白含量分别占大豆总蛋白质含量的１０％～２０％和１％～２％。

目前，在欧美等国，大豆已被列为引起食物过敏反应的八大食物过敏源之一，过敏人群常表现为颤抖、咽喉水肿、皮疹和急性哮喘等症状。

另外，在畜禽生产中，日粮过敏反应的现象也时常发生，在幼龄动物饲料中添加生大豆作为蛋白质来源会导致仔猪、犊牛等的腹泻、肠黏膜细胞增生等一系列不良反应，严重的甚至导致死亡。

随着大豆及其制品在人类食品和动物饲料中的广泛应用，由大豆引起的食物过敏现象呈上升趋势。

自２０世纪３０年代Ｄｕｋｅ首次发现大豆蛋白可引起婴儿腹泻、虚脱和肠道炎症反应以来，人们对大豆蛋白的研究便从未间断，现已从婴幼儿、仔猪和犊牛对大豆蛋白的过敏反应现象大豆中主要抗原蛋白致敏机理的研究进展中国农业大学动物科技学院农业部饲料工业中心／孙　鹏摘 要　该文简要介绍了大豆中主要抗原物质大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白对幼龄畜禽致敏作用的研究现状，并对其机理进行了综述，同时对今后的研究方向和重点工作进行了初步探讨。

关键词　大豆球蛋白；β－伴大豆球蛋白；致敏机理逐渐深入到大豆抗原蛋白的致过敏机理研究。

１ 大豆抗原蛋白的组成结构大豆中约含３５％～４０％的蛋白质，根据沉降系数的不同可分为４大类，即２Ｓ、７Ｓ、１１Ｓ和１５Ｓ组分。

其中，具有抗原性的蛋白主要包括大豆疏水蛋白（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ），大豆壳蛋白（Ｈｕｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ），大豆抑制蛋白（Ｐｒｏｆｉｌｉｎ），大豆空泡蛋白（Ｖａｃｕｏｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ），大豆球蛋白（Ｇｌｙｃｉｎｉｎ）和β－伴大豆球蛋白（β－Ｃｏｎｇｌｙｃｉｎｉｎ）等。

专利名称：一株降解大豆主要过敏原的芽孢杆菌及其应用专利类型：发明专利
发明人：陈坚,张娟,朱婷,堵国成,谈铭
申请号：CN201210193348.8
申请日：20120613
公开号：CN102827788A
公开日：
20121219
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一株降解大豆主要过敏原的芽孢杆菌，本发明的降解菌Bacillus
sp.BBE201108是从预制备豆制品原料（大豆粉糟）中筛选所得。

其筛选步骤为：微生物的富集，微生物的分离，透明圈法，SDS-PAGE验证，得到一株降解性能较好的菌株。

该菌株能有效降解大豆主要过敏原Gly m Bd 60K。

因此，能在一定程度上降低大豆蛋白致敏性，为保障大豆制品在人类食品和畜禽饲料中安全与高效利用提供参考。

申请人：江南大学
地址：214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号
国籍：CN
代理机构：北京汇信合知识产权代理有限公司
代理人：王秀丽
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餐饮废水高效降解蛋白菌株的分离筛选及诱变选育
研究的开题报告
1. 研究背景
随着生活水平的提高，人们对于餐饮服务行业的要求也越来越高。

同时，餐饮业排放的废水也越来越成为环境问题的一个热点。

大量有机物质的排放不仅会污染水源，还会对水生生物造成危害。

因此，餐饮废水处理成为当下亟待解决的问题之一。

目前，餐饮废水处理的主要方法是生化处理，其中以微生物法最为常见。

2. 研究目的
本研究旨在从餐饮废水中分离筛选高效降解蛋白质的微生物，并进行诱变选育，以提高该类微生物的降解效率，为餐饮废水的治理提供有效的途径。

3. 研究内容和方法
3.1 分离筛选高效降解蛋白质的微生物
采集餐饮废水样品，并通过平板法和涂布法将其分离培养。

利用对蛋白质具有降解作用的染色方法（如卟啉琥珀酸盐等），筛选出对蛋白质降解效率高的微生物。

3.2 诱变
利用物理和化学方法对上述筛选出的微生物进行诱变，如辐射、化学物质的处理等，以提高其降解效率。

3.3 选育
从经过诱变的微生物中筛选出降解效率高的优良菌株进行进一步的培养和繁殖。

4. 研究意义
本研究通过分离筛选出高效降解蛋白质的微生物，并通过诱变选育提高其降解效率，为餐饮废水的治理提供了一种新的途径。

同时，本研究也有助于对餐饮业排放废水的治理方法进行探索和完善。

5. 预期结果
通过本研究，预计能够成功分离出高效降解蛋白质的微生物，并通过诱变选育提高其降解效率。

同时，也将为微生物法治理餐饮废水提供一种新思路。

高活性发酵豆粕生产菌株筛选及其最佳发酵条件的研究的开题报告一、选题背景及意义豆粕是大豆加工后的副产物，是常用的饲料原料。

然而，豆粕中所含的蛋白质、脂肪、碳水化合物等营养成分并不易为动物所吸收利用，因此需要进一步的处理，提高其营养价值。

发酵就是一种有效的处理方式，通过微生物的作用，可以降解豆粕中的抗营养物质，提高其蛋白质含量和生物价值，从而提高其饲用价值和经济效益。

目前，市场上存在着各种不同种类和质量的发酵豆粕产品，但是质量参差不齐，很难区分其优劣。

因此，本研究旨在针对发酵豆粕生产中的核心环节——菌株筛选及最佳发酵条件的研究进行探究，以期找到更优质且实用的发酵豆粕生产技术。

二、研究内容及研究方法（一）研究内容1. 分离筛选高活性的发酵豆粕菌株，并对其进行生理生化特性测定，筛选得到最佳实用菌株。

2. 确定发酵豆粕的最佳发酵条件，包括菌种种类、发酵时间、温度、pH值、豆粕初始含水量等因素。

3. 对比分析不同发酵条件下豆粕的营养成分及品质特性，以评估最佳发酵条件的优劣。

（二）研究方法1. 采用平板法、串联PCR、鉴定鉴定等技术手段，从自然环境中筛选优良的发酵豆粕菌株，并对其进行生理生化特性测定。

2. 采用Box-Behnken实验设计，优选出最佳发酵条件，同时通过响应面法对各因素进行分析优选。

3. 通过化学分析、气相色谱分析等方法，对比分析不同发酵条件下豆粕的营养成分及品质特性。

三、预期成果及意义（一）预期成果1. 从自然环境中筛选出一种优良的发酵豆粕菌株，并对其进行生理生化特性测定，得到一种最佳实用菌株。

2. 确定出发酵豆粕的最佳发酵条件，包括菌种种类、发酵时间、温度、pH值、豆粕初始含水量等因素，并通过响应面法对各因素进行分析优选。

3. 对比分析不同发酵条件下豆粕的营养成分及品质特性，评估最佳发酵条件的优劣。

（二）意义1. 本研究筛选得到的菌株和最佳发酵条件，可为发酵豆粕生产提供理论和实践依据，为提高豆粕的饲用价值和经济效益做出贡献。

新方法小肽与氨基酸具有相互独立的吸收、转运机制,小肽的吸收耗能底、不易饱和且不同的肽之间转运无竞争性与抑制性,同时小肽本身对肽和氨基酸的转运具有促进作用,动物对小肽的吸收比氨基酸更迅速、更有效。

此外,小肽在加强动物机体的免疫功能、促进组织蛋白质的沉积与提高动物的生产性能上都比游离氨基酸的效率高。

以这一先进理论为指导,江西省农业科学院与江西核工业天地和药业有限公司应用生物发酵技术降解大豆蛋白,生产出功能大豆多肽饲料。

制备功能大豆多肽饲料的工艺目标是:一方面培养微生物产生非淀粉多糖(NSP酶,淀粉酶,糖化酶等消化酶,破坏植物细胞壁以提高消化率和分解利用导致幼龄动物肠道病原微生物生长的不良寡糖、大豆凝集素、非淀粉多糖、胰蛋白酶抑制因子与大豆抗原等抗营养因子,对豆粕进行“解毒”;另一方面培养微生物产生蛋白酶,降低豆粕蛋白的大分子丰度,产生多肽(含寡肽。

同时采用低温脉冲干燥工艺保留产品中益生菌、消化酶、乳酸和多种生物活性因子。

现就生物发酵法生产大豆多肽的菌种选育及其发酵工艺与大豆多肽饲料的应用前景作一概述。

1 生物发酵法高效制备大豆多肽菌种的选育1.1 菌种的筛选及其优化组合初步挑选的菌种再经过富集培养基的多次复选、多种不同分离培养基(如粗筛产纤维素酶菌株分离培养基与初筛产蛋白酶菌株分离培养基等、斜面培养基的筛选以及发酵基础培养基的豆粕发酵试验,定向筛选出复合菌生物发酵法制备大豆多肽菌种的筛选及大豆多肽在饲料配方中的应用系。

该复合菌系组成为乳酸菌、枯草芽孢杆菌、粪链球菌、黑曲霉与酵母菌。

乳酸菌为乳酸球菌与植物乳酸菌,前者筛选自酸奶,后者筛选自青贮饲料堆,用途为生产乳酸。

枯草芽孢杆菌筛选自猪粪堆,作为益生菌和生产外切蛋白酶。

粪链球菌筛选自动物肠道,作为益生菌同时生产乳酸。

黑曲霉筛选自橘子皮,生产果胶酶,纤维素酶、内切蛋白酶。

酵母筛选自豆制品厂的污泥,与黑曲霉协同作用,利用黑曲霉的分解产物,同时作为益生菌。

所筛选出的菌种,再经多代分离纯化,然后接种发酵豆粕。

1豆粕豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产品，是非常优质的畜禽植物蛋白饲料原料，其蛋白质含量43%~46%，而且含有多种矿物质、维生素和必需氨基酸。

豆粕在畜禽日粮中添加比例较大，但是豆粕中含有多种抗营养因子，这些抗营养因子会对饲料的消化、吸收和利用过程中产生不利影响，降低对豆粕营养物质的利用效果，并且当抗营养因子的含量超过动物的耐受范围时还会影响到动物的健康和生产性能，特别是对幼小动物的影响较大。

1.1豆粕中的抗营养因子目前被关注的豆粕中抗营养因子见表1：1.2抗营养因子的处理方法目前，降低豆粕中抗营养因子的方法主要有物理法、化学法、生物法。

1.2.1物理法物理法主要是加热的方式去除抗营养因子。

豆粕中的胰蛋白酶抑制因子、凝集素、脲酶等抗营养因子对热敏感，可以通过加热的方式去除，但低聚糖、大豆球蛋白、植酸等对热不敏感，不能通过加热的方式去除。

另外进行热处理时，必须保证热处理的强度适宜，加热不足则抗营养因子破坏不够；加热过度引发美拉德反应和焦糖化导致氨基酸利用率下降，会降低蛋白质的生物学效率。

1.2.2化学法化学法的主要原理是利用化学试剂与抗营养因子相结合，来改变抗营养因子的分子结构，使其失去活性。

常用的化学试剂有尿素、硫酸钠、硫酸亚铁等。

使用化学法处理过程中会有大量化学物质残留，导致去除困难及成本增加，常不被采用。

1.2.3生物法生物法是利用微生物对豆粕进行发酵，利用微生物在发酵过程中产生的蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、糖化酶等多种酶类，来消除豆粕中的抗营养因子；一般筛选具有特殊能力的菌种，如能将淀粉等大分子分解为小分子的微生物，降解大分子蛋白较强的微生物，以及能够产生特殊风味的微生物。

经发酵后抗原性蛋白被水解为氨基酸和肽，低聚糖被水解为单糖，植酸被分解为无机磷酸盐，消除了豆粕的抗营养性，同时产生一些大豆肽、有益微生物代谢产物、细菌素等活性物质。

2不同微生物对豆粕中抗原的降解2.1材料菌种：来源于希普菌种保藏中心，编号为酵母不同菌种降解豆粕抗原的比较王俊青朱帆程林春劳泰财（广东希普生物科技股份有限公司，广东广州510890）[中图分类号]S816.7[文献标识码]A[文章编号]1005-8613（2018）10-0032-04[摘要]本实验选用多种微生物发酵豆粕原料，对降解豆粕抗原能力进行了研究，结果表明枯草杆菌05降解抗原蛋白的性能较强，发酵后的豆粕经SDS-PAGE检测，从球蛋白亚基条带颜色深浅的变化，判断该发酵豆粕的β-球蛋白和大豆球蛋白被完全降解，小分子肽含量明显升高。

大豆是一年生草本植物，世界上许多国家的比较重要的豆类，根据大豆的种子和种皮可以分为饲料豆、青大豆、黄大豆、黑大豆和其他大豆[1]。

大豆中富含许多优质蛋白，含有丰富的人体必需氨基酸[2]，同样也是许多动物饲料中的植物蛋白原料。

但大豆蛋白的分子量相当大，分子结构复杂，所以在动物胃肠道里面经过消化酶作用后，主要以肽的形式被吸收。

大豆蛋白不但为生物体提供生长、发育所需的营养，还能提高其身体免疫力，促进其新陈代谢[3]。

豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产物，豆粕是制作动物饲料的主要原料，还可以用来制作糕点食品、以及化妆品和抗菌素原料。

以豆粕为原料，经过微生物发酵分解生成许多小分子物质如多肽类等。

大豆肽是生物活性肽，在代谢调控方面具有非常重要的作用，其中一些多肽的理化性质比大豆蛋白好，溶解性比较好，吸水性比较稳定，基本不受PH影响，具有较好的低黏性和较高的流动性，此外，降解豆粕小分子物质的相对分子量较小（1000KD)，容易消化吸收，其致敏性也比较低，适合食品、动物饲料、鱼粉等的生产加工。

降解豆粕在工业生产中主要以酶水解法和微生物发酵法为主[4][5]，微生物水解法又包括固态发酵法和液态发酵法，酶水解法制备的产品会产生不利于产品的味道，使产品口感差[6]。

所以本试验采用微生物发酵法中的固态发酵法，改善降解豆粕产生的大豆肽的品质，提高大豆肽的产量，消除抗营养因子[7]，对发酵条件进行优化，完善好豆粕发酵的工艺，来提高降解豆粕的效率，为大豆肽以及动物饲料的后续研究试验及工业化生产与应用提供基础。

1材料和设备1.1试验菌种枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌、根霉G、根霉F、白腐及里氏木霉为实验室提供菌种。

1.2试验材料大豆粕（粉碎过筛）、麸皮（均为市场购买）；牛血清蛋白（标准品）；葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸段为旦12,冷伟芳3,刘谢缘1，4,冷桂华1,习小文1，廖金贤1（1.宜春学院化学与生物工程学院，江西宜春336000；2.上海海洋大学食品学院，上海201306；3.抚州市农业技术推广中心，抚州344000；4.集美大学海洋食品与生物工程学院，福建厦门361021）摘要：以枯草芽孢杆菌、酵母菌、根霉F、根霉G、里氏木霉、乳酸杆菌及白腐为菌种固态发酵降解豆粕为目的，通过采用对比试验法筛选降解豆粕的较佳菌液接种量、发酵时间、是否密封、菌液配比。