钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ和胞外信号调节激酶对高脂血症大鼠勃起功能障碍影响实验研究论文

[收稿日期]2021-08-25　[修回日期]2022-09-23[基金项目]湖北省卫生健康委2021-2022年度青年人才项目(WJ2021F032)[作者简介]冷冬月(1985-),女,硕士,主治医师.[文章编号]1000⁃2200(2024)02⁃0146⁃06㊃基础医学㊃SOX5对大鼠成骨细胞增殖及核因子⁃κB 信号通路的影响冷冬月1,李旭峰2,方兴刚1(1.湖北省十堰市太和医院中西医结合科,442000;2.湖北省十堰市人民医院中医科,442000)[摘要]目的:探究Y⁃box 蛋白5(SOX5)对大鼠成骨细胞(OB)增殖及核因子⁃κB(NF⁃κB)信号通路的影响㊂方法:取新生24h SPF 级SD 乳鼠,应用酶消化法分离大鼠颅骨OB㊂形态学观察和ALP 染色鉴定成骨细胞;取生长良好的第4代OB,分为空白对照组㊁pcDNA3.1组㊁pcDNA⁃SOX5组㊁si⁃NC 组㊁siRNA⁃SOX5组㊂转染48h 后qRT⁃PCR 检测细胞中SOX5mRNA 的表达;MTT 法检测细胞增殖活力;ALP 活性检测试剂盒测量ALP 活性;茜素红染色观察钙结节的形成情况;Western blotting 检测OB 分化及NF⁃κB 信号通路相关蛋白Runt 相关转录因子2(Runx2)㊁Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)㊁NF⁃κB p65及其磷酸化蛋白㊁KB 抑制蛋白激酶α(IκBα)㊁肿瘤坏死因子α(TNF⁃α)的表达㊂结果:与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB 中SOX5mRNA 水平㊁p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达显著升高(P <0.05),OB 增殖活力㊁ALP 活性㊁钙化结节数量和面积㊁Runx2㊁Collagen Ⅰ㊁IκBα表达显著降低(P <0.05);siRNA⁃SOX5组大鼠OB 中SOX5mRNA 水平㊁p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达明显降低(P <0.05),OB 增殖活力㊁ALP 活性㊁钙化结节数量和面积㊁Runx2㊁Collagen Ⅰ㊁IκBα表达明显升高(P <0.05)㊂结论:SOX5具有调控OB 增殖㊁分化的作用,其作用机制可能与调控NF⁃κB 信号通路有关㊂[关键词]骨质疏松;Y⁃box 蛋白5;成骨细胞;核因子⁃κB[中图法分类号]R 681 [文献标志码]A DOI :10.13898/ki.issn.1000⁃2200.2024.02.002Effects of SOX5on rat osteoblast proliferation and NF⁃κB signaling pathwayLENG Dongyue 1,LI Xufeng 2,FANG Xinggang 1(1.Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine ,Taihe Hospital ,Shiyan Hubei 442000;2.Department of Traditional Chinese Medicine ,Shiyan People′s Hospital ,Shiyan Hubei 442000,China )[Abstract ]Objective :To explore the effects of Y⁃box protein 5(SOX5)on rat osteoblasts (OB)proliferation and nuclear factor κB (NF⁃κB)signaling pathway.Methods :The newborn 24h SPF grade SD suckling rats were taken,and the OB of the rat skull was separated by enzyme digestion method.Morphological observation and ALP staining were used to identify osteoblasts.The fourth generation OBs with good growth were divided into blank control group,pcDNA3.1group,pcDNA⁃SOX5group,si⁃NC group,and siRNA⁃SOX5group.After 48h of transfection,qRT⁃PCR was used to detect the expression of SOX5mRNA in the cells;MTT method was used to detect cell proliferation viability;ALP activity detection kit was used to measure ALP activity;alizarin red staining was used to observe the formation of calcium nodules;Western blotting was used to detect OB differentiation and the expression of NF⁃κB signaling pathway⁃related proteins [Runt⁃related transcription factor 2(Runx2),type Ⅰcollagen (collagen Ⅰ),nuclear factor κB p65(NF⁃κB p65)and its phosphorylated protein,KB inhibits protein kinase α(IκBα),tumor necrosis factor α(TNF⁃α)].Results :Compared with the blank control group,the SOX5mRNA level,p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65,and TNF⁃αproteins expression in the OB of rats in the pcDNA⁃SOX5group were significantly increased (P <0.05),the OB proliferation activity,ALP activity,the number and area of calcified nodules,Runx2,collagen Ⅰ,and IκBαexpression were significantly reduced (P <0.05);the SOX5mRNA level,p⁃NF⁃κBp65/NF⁃κB p65,and TNF⁃αproteins expression in the OB of rats in the siRNA⁃SOX5group were significantly reduced (P <0.05),the OB proliferation activity,ALP activity,the number and area of calcified nodules,Runx2,collagen Ⅰ,and IκBαexpression were significantly increased (P <0.05).Conclusions :SOX5can regulate the proliferation and differentiation of OB,and its mechanism may be related to the regulation of NF⁃κB signaling pathway.[Key words ]osteoporosis;Y⁃box protein 5;osteoblasts;nuclear factor⁃κB 骨质疏松症(OP)是一种骨代谢疾病,其特征在于骨量下降,伴随着骨组织和微结构的恶化以及骨矿物质密度的下降[1]㊂在OP 中,骨形成与吸收之间的不平衡最终导致了骨的变性和易骨折[2]㊂成骨细胞(osteoblasts,OB)是一类特殊的具有成骨潜能的细胞,在骨重建及骨稳态维持中都发挥着重要的作用[3];OB活性下降是OP的主要原因[4]㊂Y⁃box蛋白5(SOX5)是SOX家族SoxD组的成员,编码控制细胞命运的各种转录因子并在许多谱系中进行分化,包括神经元㊁软骨细胞和B细胞[5-7]㊂研究[8-9]表明SOX5与类风湿关节炎和软骨形成密切相关,是治疗绝经后OP的有希望的分子靶标㊂已经在卵巢切除小鼠的骨髓细胞中发现了差异表达的SOX5;且与绝经前健康女性的骨髓样本相比,绝经后OP病人骨髓中SOX5的mRNA和蛋白表达水平显著上调;SOX5过表达可抑制人间充质干细胞的成骨分化[10]㊂而SOX5对OB增殖的分子功能及作用机制尚不明确;因此,本研究以大鼠OB为对象,探讨SOX5对OB增殖的影响及其潜在的作用机制,为OP的治疗及药物开发提供参考㊂1　材料与方法1.1　实验材料　出生24h的SPF级SD乳鼠10只,雌雄不限,质量(10±3)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证为SCXK(京)2019⁃0009㊂饲养温度(20±2)℃,相对湿度为45%~60%㊂胎牛血清㊁胰蛋白酶㊁RPMI1640培养基均购自美国GIBCO公司;TRIzol RNA分离试剂及SYBR®Premix Ex Taq TM 试剂盒均购买于日本TaKaRa公司;Lipofectamine TM 2000转染试剂盒购自美国Thermo公司;pcDNA⁃SOX5和pcDNA3.1载体㊁siRNA⁃SOX5和其阴性对照(si⁃NC)以及PCR引物序列由上海GenePharma 公司设计合成;氯化十六烷基吡啶鎓(美国Sigma⁃Aldrich,货号:C9002);碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒(P0321S)㊁MTT试剂盒(C0009S)购自碧云天生物科技公司;茜素红染色试剂(北京索莱宝科技有限公司,货号:G8550);兔抗大鼠Runt相关转录因子2(runt⁃related transcription factor2,Runx2)(ab236639)㊁Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)(ab270993)㊁核因子⁃κB p65 (nuclear factor kappa⁃B p65,NF⁃κB p65) (ab16502)㊁p⁃NF⁃κB p65(ab76302)㊁肿瘤坏死因子α(TNF⁃α)(ab205587)㊁KB抑制蛋白激酶α(KB inhibits protein kinaseα,IκBα)(ab109300)㊁山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)㊁β⁃actin(ab8227)均购自英国abcam公司㊂细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司);ABI Prism®7300型荧光定量PCR系统(美国);倒置荧光显微镜(IX73,购自日本Olympus公司);iMark680多功能酶标仪㊁蛋白转膜装置购自美国Bio⁃Rad公司㊂1.2　成骨细胞的分离、鉴定　应用酶消化法分离大鼠颅骨成骨细胞[11]㊂取新生24h内SD乳鼠,处死后,乙醇浸泡5min,在无菌条件下,取出头盖骨,PBS冲洗后切成1mm3的骨颗粒,37℃水浴中用0.1%的胶原酶以1∶10的比例将骨颗粒消化分离20min,然后再次用胶原酶分离约1h㊂将分离获得的悬浮液以1200r/min离心,去上清液,用PBS漂洗3次,并加入含有15%胎牛血清㊁青霉素(100U/mL)和链霉素(100U/mL)的培养液㊂在37℃㊁5%CO2下孵育,1周换液2次,待细胞融合约80%时传代,换用成骨诱导培养基(基础培养基+50μg/mL维生素C+10mmol/Lβ⁃甘油磷酸钠+10nmol/L地塞米松)㊂取第3代细胞通过ALP染色和形态观察行成骨细胞鉴定,取生长良好的第4代细胞用于实验㊂鉴定成骨细胞:(1)形态学观察:在倒置相差显微镜下观察原代和继代培养成骨细胞的生长和形态变化,并在随机选择的视野中拍照㊂(2)ALP染色:将第3代的成骨细胞培养7d,并参照ALP染色试剂盒的说明进行ALP染色㊂去除成骨细胞的培养基,PBS清洗细胞2~3次,并用4%多聚甲醛固定10min㊂清洗后加入300μL显色液,避光于37℃的培养箱中孵育2h,显微镜下观察㊂1.3　分组及转染　取生长良好的第4代成骨细胞,按每孔2×106个接种于24孔板,分成5个处理组:(1)空白对照组,不进行任何转染;(2)pcDNA3.1组,用Lipofectamine2000按照说明书将100nmol/L pcDNA3.1转染至成骨细胞;(3)pcDNA⁃SOX5组,用Lipofectamine2000按照说明书将100nmol/L pcDNA⁃SOX5转染至成骨细胞;(4)si⁃NC组,将si⁃NC转染至成骨细胞;(5)siRNA⁃SOX5组,将siRNA⁃SOX5转染至成骨细胞㊂转染48h后收获细胞以进行后续实验㊂1.4　qRT⁃PCR检测细胞中SOX5mRNA的表达　使用TRIzol试剂提取细胞总RNA,使用分光光度计测量总RNA的浓度㊂按照试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA,进行PCR扩增(见表1)㊂反应体系(20μL):cDNA(200ng/μL)2μL,SYBR®Premix Ex Taq TM(2×)10μL,上下游引物各0.4μL,ddH2O7.2μL㊂循环条件:94℃持续10min,然后在94℃持续10s,60℃持续20s和72℃持续1min进行40个循环㊂用β⁃actin作为对照,相对SOX5mRNA的表达量采用2-ΔΔCt方法计算㊂表1　RT⁃PCR引物序列基因引物序列SOX5F:5′⁃CAG CCA GAG TTA GCA CAA TAG G⁃3′R:5′⁃CTG TTG TTC CCG TCG GAG TT⁃3′β⁃actinF:5′⁃TTG CGT TAC ACC CTT TCT TG⁃3′R:5′⁃TGT CAC CTT CAC CGT TCC A⁃3′1.5　MTT法检测细胞增殖活力　转染48h后将成骨细胞以2×103细胞/孔的浓度接种到96孔板中,继续培养24h,然后每孔中加入20μL的MTT溶液(5mg/mL),于培养箱中孵育4h,吸去上层清液后加入150μL的DMSO, 490nm波长处测定各孔吸光度值(OD),计算细胞增殖率㊂细胞增殖率=(实验组OD值-空白孔OD 值)/(对照组OD值-空白孔OD值)×100%㊂1.6　ALP活性测定　ALP是成骨细胞分化的早期标志㊂将转染的成骨细胞用成骨培养基培养7d㊂然后,除去OM培养基,并使用0.1%TritonX⁃100裂解细胞获得细胞裂解液,然后12000g离心10min,取上清液为样品㊂使用ALP活性检测试剂盒测量上清液中ALP活性㊂于405nm处测定各组OD值,使用对硝基苯酚绘制标准曲线;另用BCA法测定每个样品的总蛋白浓度㊂并将每个样品的ALP活性标准化为相应的总蛋白含量㊂1.7　茜素红染色　采用茜素红染色观察钙结节的形成数量,评估成骨细胞的矿化能力㊂成骨细胞按1.3方法进行分组处理,转染后将细胞培养2周,弃去培养液,细胞用PBS洗涤2次,并在室温下用4%多聚甲醛固定30min㊂弃去多聚甲醛,PBS洗涤后在37℃下用0.1%茜素红染液染色1h㊂倒置光学显微镜下观察图像并拍照,并使用Image⁃Pro Plus6.0软件统计钙化结节染色阳性区域的面积和数量㊂1.8　Western blotting检测成骨细胞NF⁃κB信号通路相关蛋白的表达　使用RIPA裂解液提取细胞中蛋白质㊂使用BCA试剂盒对蛋白质浓度进行定量㊂取等量蛋白质样品上样(每泳道30μg),10%SDS⁃PAGE分离蛋白质,并通过半干转移将其转移到PVDF膜上㊂将膜用5%脱脂牛奶封闭,并在4℃下与一抗(Runx2㊁CollagenⅠ㊁NF⁃κB p65㊁p⁃NF⁃κB p65㊁TNF⁃α㊁IκBα㊁β⁃actin,1∶1000)孵育过夜㊂第2天,将膜与偶联辣根过氧化物酶的二抗孵育(1∶2000)2h,然后使用化学发光试剂盒(ECL)进行显色㊂以β⁃actin为内参,分析结果㊂1.9　统计学方法　以上所有实验均重复3次㊂采用单因素方差分析(One⁃way ANOVA),Tukey的事后检验用于单因素方差分析后的成对比较㊂2　结果2.1　成骨细胞原代培养和鉴定　原代培养第3天,倒置相差显微镜下见成骨细胞从碎骨块周围爬出,呈放射状贴壁生长,形态不规则,呈多边形或三角形,有较多突起,单核卵圆形, 1~2个核仁,胞质丰富清晰,ALP染色呈阳性,蓝黑色颗粒沉积在细胞质及细胞核ALP活性部位(见图1)㊂2.2　各组成骨细胞中SOX5mRNA的表达　与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB 中SOX5mRNA水平显著升高(P<0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB中SOX5mRNA水平明显降低(P <0.05)(见表2)㊂表2　各组大鼠OB中SOX5mRNA水平比较(x±s;n i=3)分组SOX5mRNA空白对照组 1.00±0.00 pcDNA3.1组 1.02±0.01 pcDNA⁃SOX5组 4.65±0.37*si⁃NC组 1.01±0.01 siRNA⁃SOX5组0.41±0.05* F315.94 P<0.01 MS组内0.028 q检验:与空白对照组比较*P<0.052.3　各组成骨细胞增殖活力　与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB增殖活力显著降低(P <0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB 增殖活力明显升高(P <0.05)(见表3)㊂表3　各组大鼠OB 增殖活力比较(x ±s ;n i =3)分组增殖率/%空白对照组100.00±0.00pcDNA3.1组102.13±10.01pcDNA⁃SOX5组64.75±6.16*si⁃NC 组104.06±9.31siRNA⁃SOX5组137.31±7.42* F144.83 P<0.01 MS 组内55.976 q 检验:与空白对照组比较*P <0.052.4　各组成骨细胞ALP 活性　与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB中ALP 活性显著降低(P <0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB 中ALP 活性明显升高(P <0.05)(见表4)㊂表4　各组大鼠OB 中ALP 活性比较(x ±s ;n i =3)分组ALP 活性空白对照组 1.00±0.00pcDNA3.1组 1.03±0.08pcDNA⁃SOX5组0.75±0.05*si⁃NC 组 1.02±0.06siRNA⁃SOX5组1.54±0.09* F 60.49 P<0.01 MS 组内0.004 q 检验:与空白对照组比较*P <0.052.5　各组成骨细胞钙结节形成情况　倒置显微镜下观察可见细胞呈多层重叠生长,各组细胞间均可见橘红色钙化结节;与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB 钙化结节数量和面积显著降低(P <0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB 钙化结节数量和面积明显增加(P <0.05)(见图2㊁表5)㊂2.6　各组成骨细胞分化及NF⁃κB 信号通路相关蛋白的表达　与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB 中p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达显著升高,Runx2㊁Collagen Ⅰ㊁IκBα表达显著降低(P <0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB 中p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达明显降低,Runx2㊁Collagen Ⅰ㊁IκBα表达明显增加(P <0.05)(见图3㊁表6)㊂3　讨论 OB 是骨形成的主要功能单位,负责骨骼重塑过程中骨骼基质的合成㊁分泌和矿化㊂OB 在维持骨量和减少骨质流失中起关键作用㊂刺激OB 增殖并促进其分化成熟是调节骨代谢㊁促进新骨形成㊁修复骨缺损的重要方法[12]㊂MTT 法是检测细胞增殖的指标,可以反映生活细胞的代谢水平㊂本研究采用MTT 法检测SOX5对OB 增殖活性的影响,结果显示SOX5mRNA 过表达后,对体外培养的OB 增殖有明显的抑制作用,而采用siRNA 技术干扰SOX5的表达后,OB 增殖率明显增加;表明沉默SOX5具有促进OB 增殖的作用㊂ OB 的增殖通常通过测量细胞总蛋白㊁ALP 活性和Collagen Ⅰ分泌来评估㊂ALP 是OB 分泌的一组膜结合糖蛋白,是OB 早期分化的特异性标志,ALP 活性的高低,能较客观地反映OB 分化成熟的程度[13]㊂Runx2㊁Collagen Ⅰ是OB 相关的蛋白,在成骨分化活动中起重要的促进作用[4],在增殖阶段,OB 分泌Collagen I 以帮助矿化并减少骨质流失㊂OB 分化成熟后多层重叠生长形成结节样结构,并不断分泌基质和矿物质,形成矿化结节㊂茜素红染色可以评估成骨分化晚期细胞外基质矿化情况钙化结节的形成情况[14]㊂本实验中,将转染的OB 用成骨培养基培养7d 后,通过ALP 活性检测了SOX5对OB 分化的影响,结果显示SOX5过表达后,ALP 活性值较低,OB 钙化结节数量和面积降低,且Runx2㊁Collagen Ⅰ表达减少,分析可能与细胞增殖㊁分化受到抑制有关;而SOX5mRNA 表达下调时,ALP 活性㊁细胞钙化程度及Runx2㊁CollagenⅠ表达增加㊂分析沉默SOX5促进成骨细胞ALP活性的原因可能是:(1)与促进细胞增殖有关,OB数量的增加,分泌的ALP也随之增加;(2)上调ALP mRNA表达水平,促进ALP的分泌,调节OB的分化㊂表5　各组大鼠OB钙结节形成情况(x±s;n i=3)分组钙化结节数量钙化结节面积/mm2空白对照组898.62±51.4360.54±5.71 pcDNA3.1组901.05±72.6161.12±5.63 pcDNA⁃SOX5组616.47±60.54*33.28±4.17* si⁃NC组895.09±58.3062.35±4.24 siRNA⁃SOX5组1174.81±73.42*89.76±6.79* F28.7041.08 P<0.01<0.01 MS组内4074.34729.154 q检验:与空白对照组比较*P<0.05表6　各组大鼠OB分化及NF⁃κB信号通路相关蛋白的表达(x±s;n i=3)分组Runx2CollagenⅠ　p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65　IκBαTNF⁃α空白对照组0.98±0.10 1.12±0.11　0.49±0.04　0.89±0.080.32±0.02 pcDNA3.1组 1.01±0.09 1.10±0.10*0.51±0.050.91±0.070.31±0.03 pcDNA⁃SOX5组0.66±0.07*0.74±0.07* 1.28±0.11*0.40±0.05*0.87±0.06* si⁃NC组0.99±0.06 1.08±0.090.52±0.070.88±0.040.34±0.04 siRNA⁃SOX5组 1.25±0.08* 1.31±0.12*0.33±0.04* 1.22±0.06*0.16±0.03* F20.0312.8892.2768.09150.30 P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01 MS组内0.0070.0100.0050.0040.001 q检验:与空白对照组比较*P<0.05 NF⁃κB控制主要骨骼细胞类型(破骨细胞[15]㊁成骨细胞[16]和软骨细胞[17])的分化或活性㊂生理和病理性骨重塑的刺激都会影响NF⁃κB信号转导[18];NF⁃κB的启动子活性主要是由核移位和NF⁃κB磷酸化引起[19]㊂在静息细胞中,NF⁃κB以NF?κB/IκBα复合物的形式存在于细胞质;在病理条件下,刺激激活核因子抑制剂IκB激酶(IκB kinases, IKKs),该激酶通过靶向将IκBα蛋白降解,释放NF⁃κB并允许其核移位和DNA结合,促进TNF⁃α㊁IL⁃1β等炎性因子的表达,减少骨细胞形成,使OB增殖㊁分化能力降低㊂研究发现NF⁃κB的激活下调OB分化[20];抑制IκBα的降解,稳定NF⁃κB/IκBα复合物,可抑制NF⁃κB的活化,减少炎性因子的释放[21-22]㊂HUANG等[23]发现在人牙槽骨OB分化中,三七皂苷R1可通过抑制NF⁃κB通路,逆转TNF⁃α诱导的钙结节和ALP活性的降低㊂杨青坡等[24]发现姜黄素能降低骨组织中NF⁃κB表达,明显改善OP大鼠骨密度㊂在本研究中,我们通过pcDNA3.1质粒转染构建SOX5过表达OB,发现大鼠OB中磷酸化NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达升高, IκBα表达降低,说明NF⁃κB信号通路被激活;而沉默SOX5的表达后,IκBα表达增加,磷酸化NF⁃κB p65㊁TNF⁃α表达降低,提示NF⁃κB信号通路被抑制㊂综上所述,沉默SOX5具有促进OB增殖的作用,并可调节OB的分化,其作用机制可能与抑制NF⁃κB信号通路的激活有关,过表达SOX5则发挥相反作用㊂但本研究尚存在一定不足,未对NF⁃κB 信号通路进行干扰从反面进行验证;此外,由于体内外环境的巨大差异,在体内沉默SOX5是否发挥相同的作用,有待进一步研究㊂[参考文献][1]　MENG YC,LIN T,JIANG H,et al.miR⁃122exerts inhibitoryeffects on osteoblast proliferation/differentiation in osteoporosis byactivating the PCP4⁃Mediated JNK pathway[J].Mol Ther NucleicAcids,2020,20:345.[2]　杨菁,聂子淮,滕斌,等.基于FRAX风险评估的分层管理在社区老年骨质疏松症病人中的应用研究[J].蚌埠医学院学报,2022,47(2):254.[3]　CHOTIYARNWONG P,MCCLOSKEY EV.Pathogenesis ofglucocorticoid⁃induced osteoporosis and options for treatment[J].Nat Rev 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钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在维拉帕米逆转肺腺癌顺铂化疗耐药中的作用刘淼;范平生;张腾跃;黄金;樊高飞;刘亚贝【摘要】目的探讨钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在维拉帕米逆转肺腺癌顺铂化疗耐药中的作用.方法在肺腺癌细胞系(A549)中,采用CCK-8法检测维拉帕米逆转顺铂耐药的能力,采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测维拉帕米逆转顺铂耐药中凋亡水平的效果,采用Western blotting检测逆转耐药过程中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ蛋白表达水平的变化.结果在肺腺癌细胞系(A549)中,单药顺铂组、顺铂联合维拉帕米组的细胞增长抑制率分别为(55.00±2.60)％、(32.30±1.80)％,差异有统计学意义(P＜0.05).凋亡实验表明,单药顺铂组细胞凋亡率为10.30％,顺铂联合维拉帕米组为21.60％,差异有统计学意义(P＜0.05).Western blotting结果显示,在A549细胞中,顺铂联合维拉帕米组P-CaMKⅡ/CaMKⅡ的表达明显低于单药顺铂组.结论在肺腺癌细胞中,CaMKⅡ参与维拉帕米逆转化疗耐药的过程.【期刊名称】《实用临床医药杂志》【年(卷),期】2019(023)010【总页数】4页(P5-8)【关键词】肺腺癌;维拉帕米;顺铂;耐药性;钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ【作者】刘淼;范平生;张腾跃;黄金;樊高飞;刘亚贝【作者单位】安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000【正文语种】中文【中图分类】R734.2目前，早期肺癌仍缺乏有效的诊断手段，大多数肺癌患者初诊时已为中、晚期，错过了根治性治疗的机会[1]。

浙江大学学报（农业与生命科学版）47（1）：11~20，2021Journal of Zhejiang University (Agric.&Life Sci.)http ：///agr E -mail ：zdxbnsb @植物蛋白磷酸酶2C 结构和功能的研究现状与进展陈耘蕊，毛志君，李兆伟，范凯*（福建农林大学农学院，作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室，福州350002）摘要蛋白磷酸酶是蛋白质可逆磷酸化过程中2个关键酶之一，蛋白磷酸酶2C （protein phosphatase 2C,PP2C ）是蛋白磷酸酶的重要成员。

PP2C 是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，可以调控真核生物细胞生命活动。

PP2C 成员主要参与激素信号转导途径，尤其可作为脱落酸信号途径的关键调节因子，能响应各种生物和非生物胁迫，在器官发育和种子萌发等方面也具有重要的促进作用。

在不同的植物中也发现了越来越多的PP2C 成员，该酶在不同的植物、不同的生长环境以及不同的生理活动中均有不同的调控方式，这也是目前及今后对PP2C 成员的研究方向。

本文主要介绍了植物PP2C 家族的结构特点、亚细胞定位及其在生长发育、激素信号转导、逆境胁迫方面的研究现状，以及在提高植物生物产量、促进果实发育等方面的新进展。

关键词蛋白磷酸酶2C ；植物生长发育；激素信号转导；胁迫响应中图分类号Q 945文献标志码AResearch status and progress in structure and function of protein phosphatase 2C in plants.Journal of Zhejiang University (Agric.&Life Sci.),2021,47(1):11-20CHEN Yunrui,MAO Zhijun,LI Zhaowei,FAN Kai *(Key Laboratory of Ministry of Education for Genetics,Breeding and Multiple Utilization of Crops,College of Agriculture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China )Abstract Protein phosphatase is one of the two key enzymes in the process of protein reversible phosphorylation.Protein phosphatase 2Cs (PP2Cs)are the important members of protein phosphatases.They are attributed to serine/threonine protein phosphatases (STPs)and can regulate the life activities of eukaryotic cells.PP2C members play an important role in hormone signal transduction pathways,especially abscisic acid (ABA)signal pathways;they can respond to various biotic and abiotic stresses,and also regulate organ development and seed germination.Recently,more and more PP2C members are found in plants.The regulation mechanisms of the PP2C members are diverse in different plants,different growth environments,and different physiological activities.The related research is an important topic.This review mainly introduces the structural characteristics,and subcellular localization of PP2C family in plants,and the research progresses in plant growth and development,hormone signal transductions,and stress responses,as well as in aspects of improving plant biological yield and promoting fruit development.Key words protein phosphatase 2C;plant growth and development;hormone signal transduction;stress responseDOI ：10.3785/j.issn.1008-9209.2020.05.291基金项目：国家自然科学基金（31701470）；中国博士后科学基金（2017M610388，2018T110637）；福建农林大学杰出青年科研人才计划（xjq201917）。

世界 中西 医结 合 杂志 ２ １ ０ ２年第 ７卷第 ２ 期
Ｗｏ ｄＪｕ ｌ ｆｎｅ ｔｄＴａｉｏａ ａ ｄＷｅｔ ｎＭ ｄｃｎ ２ １ ， ｏ ７ Ｎ ． ｒ ｏｍａ ｏ ｔ ｅ ｒｄｔ ｎ１ ｎ ｓ ｒ ｅｉｉｅ ０ ２ Ｖ １ ，ｏ２ ｌ Ｉ ￣ａ ｉ ｅ ．
・１ ７ ・ ７
胞 后 除极 ， 而诱 发 恶 性 室性 心 律 失 常 ， ａ 从 Ｃ ＭＫⅡ是
转 录 因子促 进 心 肌 肥 大 ， 主要 包 括 Ａ Ｐ 活 化 转 录 Ｎ 、
因子 一１ ｃ ＭＰ反 应 元 件 结 合 蛋 白 （ Ａ ｅｐ ｎｅ 、Ａ ｃ ＭＰ ｒｓｏ ｓ ｅ ｍ ｎ ｂｎ ｉｇｐｏ ｉ， Ｒ Ｂ 以及 心肌 细胞增 强 因 ｌ ｅ ｔ ｉｄｎ ｒｔ ｎ Ｃ Ｅ ） ｅ ｅ 子 ２ ｍ ｏｙｅｅｈ ｎ ｅ ￣ｃ ｒ ， ） （ ｙ ｃｔ ｎ ａ ｃｒ ｔ ＭＥ 等 。Ｃ ＭＫ ｏ２ ａ
件 下早 期后 除极 和 尖 端扭 转 型心 动 过 速 的 发 生率 ，
研究 证 明 Ｊ钙 调 蛋 白（ ａ 是 ｃ 信 号 变化 的重 ， Ｃ Ｍ） ａ
要感 受 器 ， 是 Ｃ ｎ调 节蛋 白及 转 录 反应 的重 要效 也 ａ
应器 。钙 调素 依赖 性蛋 白激 酶 Ⅱ（ ａ Ｃ ＭＫⅡ） 调节 能 基 因的转 录表 达 ， 信 号传 导 和调 节 心 脏 功 能 中 的 在 作用 与其 异 构 体 的 亚 细胞 定 位 有 关 。Ｃ ＭＫⅡ的 活 ａ 性 和表 达程 度 在 心 律 失 常 、 肌 肥 厚 、 肌 细 胞 凋 心 心 亡 的发生 中起 着非 常重 要 的作用 。
时， 心律 失 常 的 发 生 率 也 明 显 升 高 。蔡 少 艾 等 、 Ｃ ｂ ｎ ｔ 实验 结果 显示 ， 丙 肾上 腺 素磷 酸化 Ｒ Ｒ ｕ ａ ｌ ０ ３ 异 ｙ２ 所 致 的心律 失常 可 能与 Ｃ ＭＫⅡ系统有 关 。 ａ

Ca2+在信号传导中对植物生理的影响一、摘要本文简要分析Ca2+在信号传导中作为第二信使配合钙调蛋白和钙依赖型蛋白激酶的机制原理，并概述其对植物生长生理的影响。

二、关键词：Ca2+钙调素 CDPK 第二信使三、引言我们知道，矿质元素对植物的生长发育和生理过程起着重要作用，Ca2+就是其中最为重要的离子之一。

Ca2+既是植物细胞壁的重要组成部分，大部分Ca2+在细胞壁中与果胶酸形成果胶酸钙，起支持和加固作用；Ca2+对维持膜结构的稳定性也有一定作用；同时，Ca2+作为第二信使配合钙调蛋白和CDPK在植物生理的信号传导过程中具有重要作用。

四、正文1、钙稳态在静息态的胞质中Ca2+浓度≤0.1μmol/L，而通常在细胞壁、ER、液泡、线粒体中的浓度会高2~5个数量级。

细胞壁是植物细胞的最大钙库[1]。

细胞中各处的钙离子浓度梯度在未受刺激时是保持相对稳定的，当受到刺激时，由于胞外Ca2+浓度高与胞内，此平衡就会被打破。

信号分子与受体结合通常引起跨膜的离子流动，从而引起膜电位的改变。

在质膜上，存在Ca2+通道，类似于水通道，引起Ca2+的内流；同时存在Ca2+泵，是Ca2+外流的通道。

在胞内钙库如液泡、ER等结构的膜上也存在相应的结构，其上的Ca2+通道是从钙库流向胞质的通道，Ca2+泵、Ca2+/nH+反向运输体是Ca2+从胞质流向钙库的通道。

因此细胞质中的游离Ca2+的浓度主要受质膜和内膜系统上的Ca2+通道和Ca2+泵的调节。

任何一种外界刺激或激素所引起的细胞反应通过Ca2+作为第二信使传递的直接证据是细胞质中是否有游离Ca2+的浓度变化。

2、Ca2+的作用方式有两种：第一种是游离Ca2+的浓度直接或间接影响植物的生理过程；第二种是胞质里的Ca2+与钙结合蛋白，如钙调蛋白CaM（也叫钙调素）、钙依赖型蛋白激酶（CDPK）结合而起作用。

3、钙调素3.1 钙调素( Calmodulin, CaM)是一种分布最广，功能最重要的钙依赖性调节蛋白。

咬合干扰大鼠咬肌线粒体钙超载的离子变化特征及其钙调蛋白激酶Ⅱ的调节机制曾林;刘静【摘要】目的探明咬合干扰作用下大鼠咬肌组织线粒体钙离子浓度与细胞外钠离子浓度的变化特点,探讨钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)对线粒体“钙超载”现象的调控机制.方法在SD大鼠右侧上颌第一磨牙咬合面粘接直径0.6 mm钢丝段,建立咬合干扰大鼠模型,实验组分为3、7、14、21d及去除咬合干扰后3d组,并设立对照组.应用苏木精-伊红(HE)染色法观察咬肌组织形态学的变化;应用荧光分光光度法检测咬肌线粒体钙离子浓度;应用6-氢氧化锑钾直接比浊法检测咬肌肌纤维细胞外钠离子浓度;应用Western blotting技术检测咬肌组织p-CaMK Ⅱ(Thr286)/CaMK Ⅱ表达水平.结果与对照组比较,建模3、7、14和21 d实验组咬合干扰侧咬肌线粒体Ca2+浓度持续升高(P＜0.05),去除咬合干扰后3d组Ca2+浓度显著下降且低于正常对照组(P＜0.05).建模3d组、7d组、14d组及21 d组细胞外Na+浓度持续升高(P＜0.05),去除咬合干扰后3d组Na+浓度显著降低(P＜0.05).建模3d、7d 和14 d实验组咬合干扰侧p-CaMK Ⅱ(Thr286)/CaMK Ⅱ表达水平持续升高(P＜0.05),但其表达水平在建模21d组下降且低于对照组水平(P＜0.05),去除干扰3d 组表达水平显著下降且低于21 d组(P＜0.05).非咬合干扰侧变化趋势同干扰侧趋势一致,但干扰侧变化更显著(P＜0.05).结论咬合干扰可使大鼠咬肌线粒体Ca2+和胞浆Na+浓度升高,引发“钙超载”;线粒体Ca2+浓度升高与CaMK Ⅱ磷酸化水平相关,提示其对线粒体“钙超载”具有负反馈调节作用.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2018(038)006【总页数】6页(P755-760)【关键词】线粒体钙超载;咬合干扰;咬肌;钙调蛋白激酶2;咀嚼肌功能紊乱【作者】曾林;刘静【作者单位】暨南大学口腔医学院;暨南大学华侨医院口腔科,广东广州510630;暨南大学口腔医学院修复学教研室,广东广州510632【正文语种】中文钙离子是细胞凋亡信号中关键的第二信使，而线粒体凋亡途径是细胞凋亡发生的核心［1］。

网络出版时间：２０２３－１２－０１１６：０３：１９　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．Ｒ．２０２３１１３０．１３２３．０４８◇生殖药理◇从内质网应激研究高脂饮食对小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响周本文１，２，３，张长城１，３，邓　何１，２，陈思敏１，３，常言语１，３，杨焱娜１，２，付国庆１，３，袁　丁１，赵海霞１，２（三峡大学１．国家中医药管理局中药药理科研三级实验室、２．基础医学院、３．健康医学院，湖北宜昌　４４３００２）收稿日期：２０２３－０６－０５，修回日期：２０２３－０９－１６基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８２０７４２０５，８２２７４１９１）作者简介：周本文（１９９６－），女，硕士生，研究方向：高脂饮食对雄性生殖功能的影响及药物防治机制，Ｅ ｍａｉｌ：１７５４１９８８４７＠ｑｑ．ｃｏｍ；赵海霞（１９８６－），女，博士，副教授，研究方向：生殖功能障碍的病理生理机制及药物防治机制，鄂产中草药的药理活性及作用机制，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈａｏｈａｉｘｉａ．ｍｍ＠１６３．ｃｏｍ；张长城（１９７３－），男，博士，教授，研究方向：机体衰老的生理病理机制与药物防治机制，生殖与不育的病理机制与药物防治机制，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｇｒｅａｔｗａｌｌ＠ｃｔｇｕ．ｅｄｕ．ｃｎｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２３０４０３２文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）１２－２３４６－０８中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ３２１ １；Ｒ３２２ ６４；Ｒ３２９ ２４；Ｒ３２９ ２５；Ｒ５８９ ２摘要：目的　从内质网应激的角度研究高脂饮食对小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响。

方法　将Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性小鼠随机分为正常组和高脂饮食组，每组６只，分别给予普通饲料和高脂饲料持续喂养５个月。

小鼠称体质量，麻醉后处死，取睾丸组织，称质量并计算睾丸指数；取附睾组织进行精液分析；ＨＥ染色检测睾丸组织形态学变化；ＴＵＮＥＬ染色检测生精细胞凋亡；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测睾丸凋亡及内质网应激相关蛋白的表达水平；免疫荧光法检测ＧＲＰ７８蛋白表达和定位的变化。

钙调蛋白依赖性激酶在神经元发育中的调控机制作为一种重要的信号传导分子，钙调蛋白依赖性激酶不仅在细胞的生长、分化和死亡等基础生理过程中起着至关重要的作用，而且在神经元发育过程中的调控机制也备受研究学者关注。

在一系列的实验研究中，科学家们发现，钙调蛋白依赖性激酶参与了神经元的健康发育以及神经退行性疾病的发生，并为疾病的预防与治疗提供了新的思路与途径。

神经元发育过程中的激酶如今，越来越多的研究表明，神经元的发育需要严格的时间表达和空间调控，它们之间的配合令神经元的形态变化、分化过程、突触形成和功能的成熟同步进行。

常见的突触激酶主要包含了钙调蛋白依赖性激酶（CAMK）、蛋白激酶C（PKC）和蛋白激酶A（PKA）等。

在这其中，CAMK是一种与神经元发育密切相关的激酶，它的活性通过钙-/钙调蛋白及其信号通路的调节而被严格限制。

在神经元的发育过程中，CAMK的活性调控可以促进神经元的成长、分化、突触的塑造和功能的成熟。

CAMK在神经元中的分布和调控CAMK的基因在哺乳动物中表达广泛，其亚型亦不止一种。

在神经元中，CAMK主要通过多种表达方式进行调控，如CAMKⅡ的自磷酸化和机械感受器的活性改变等。

此外，神经元中的CAMK活性可以由信号通路中的其他因素调控。

事实上，很多神经递质综合神经元内部的激酶、酶和钙通道等，以促进本身的释放和作用。

CAMK在神经元发育中的作用机制不同类型的CAMK参与到神经元发育过程中的方式也是不同的。

首先，CAMK的活性可以促进神经元的成长（Nikolic等）。

在神经元的过度发育阶段，较高水平的CAMK活性可以促进神经元的生长并帮助形成健康稳定的神经系统。

其次，CAMK对突触的塑造和功能的成熟也具有重要的作用（Wu等）。

神经系统突触的塑造是神经元发育的关键部分，突触的塑造与突触磷酸酶和突触前神经细胞因子合成相关，大多数研究表明CAMK在突触的塑造和成熟方面发挥了极其重要的作用。

同时它还可以促进突触的形成和运转，并对突触的可塑性和动态进行调节。

蛋白激酶ＣＫ２在神经退行性疾病病理生理机制中的作用及应用进展崔孟颖　冯其贞　武　菲△（神经生物学研究所，济宁医学院，济宁２７２０６７）摘要　蛋白激酶ＣＫ２（ｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅ２，ＣＫ２）是一种高度保守的丝／苏氨酸蛋白激酶，广泛分布于真核细胞的胞质和胞核中。

ＣＫ２可通过对其底物的磷酸化作用调制底物的生物学活性，从而参与细胞内多条重要的信号转导通路。

越来越多的研究发现，在多种神经退行性疾病中ＣＫ２表达及活性异常，是其病理生理机制的重要一环，提示ＣＫ２有重要的研究意义，可能是某些神经退行性疾病潜在的治疗靶点。

本文将对ＣＫ２在多种神经退行性疾病中病理生理作用以及ＣＫ２抑制剂、激动剂的最新研究进展作一综述。

关键词　ＣＫ２；神经退行性疾病；ＣＫ２抑制剂中图分类号　Ｒ３３８ＲｏｌｅａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅＣＫ２ｉｎｔｈｅＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＮｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＤｉｓｅａｓｅｓ ＣＵＩＭｅｎｇ Ｙｉｎｇ，ＦＥＮＧＱｉ Ｚｈｅｎ，ＷＵＦｅｉ△（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＪｉｎｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｉｎｇ２７２０６７，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　ＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣＫ２ｉｓａｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ｗｈｉｃｈｉｓｗｉｄｅｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍａｎｄｎｕｃｌｅｕｓｏｆｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＣＫ２ｃｏｕｌｄｍｏｄｕｌａｔｅｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｔｓｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｖｉａｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ｔｈｕｓｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｎｇｉｎｍａｎｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｐａｔｈ ｗａｙｓ．ＭｏｒｅａｎｄｍｏｒｅｅｖｉｄｅｎｃｅｓｈａｖｅｐｒｏｖｅｄｔｈｅａｂｎｏｒｍａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＫ２ｉｎｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎ ｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅｓ，ａｎｄｈａｖｅｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔＣＫ２ｍａｙｂｅｏｎｅｏｆｔｈｅｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｓｕｇ ｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔＣＫ２ｉｓｏｆｇｒｅａｔｖａｌｕｅｔｏｓｔｕｄｙａｎｄｍａｙｂｅａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｗｔａｒｇｅｔｆｏｒｓｏｍｅｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｒｅｖｉｅｗ，ｗｅｆｏｃｕｓｅｄｏｎｔｈｅｒｅｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆＣＫ２ｉｎｖａｒｉｏｕｓｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅｓａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓａｎｄａｃｔｉｖａｔｏｒｓｏｆＣＫ２．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ＣＫ２；Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅ；ＣＫ２ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ 酪蛋白激酶（ｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＣＫ）是一种高度保守的非环核苷酸依赖的丝／苏氨酸蛋白激酶，包括ＣＫ１、ＣＫ２和Ｇｏｌｇｉ ＣＫ（Ｇ ＣＫ）／Ｆａｍ２０Ｃ（ｆａｍｉｌｙｗｉｔｈｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ２０，ｍｅｍｂｅｒＣ）。

Key words： cAMP； cAMP response element binding protein； phosphodiesterase 4； Extracellular signal regulating kinase； Learning and memory
过激活腺苷酸环化酶催化 ATP 水 解 生 成 的。cAMP 主要 通 过 激 活 PKA 使 靶 酶磷酸 化，然 后 开 启 基 因 表达，在 细 胞 生 命 活 动 中 有着重 要 的 意 义，参 与 调 节许多 细 胞 的 代 谢、基 因 表达、细胞生长和分裂等。
pde4抑制剂rolipram能使n甲基d天冬氨酸受体的激活从而激活mapkerkcreb信号通路在神经保护及学习记忆过程中发挥重要作用31在camppkacreb信号通路及相关调控蛋白pde4和erk对学习记忆的影响及机制方面人们已做了大量研究并取得显著成果但把三者之间联系起来是否能为临床提供一条新的治疗途径及筛选新的有效药物预防麻醉引起的术后学习记忆障碍还要进一步探索
基金项目： 国家自然科学基金（ 81000469）
在神经系统中，CREB 作为细胞内多种信号通路
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医学综述 2011 年 8 月第 17 卷第 15 期 Medical Recapitulate，Aug． 2011，Vol． 17，No． 15
的一个重要 组 成 部 分，其 下 游 效 应 包 括 影 响 神 经 元 的存活与生长、突触的可塑性和长期记忆的形成［4］。 实验证实，CREB 活性的降低可抑制长时程记忆的形 成，其数量的 增 加 或 活 性 的 增 强 可 促 进 长 时 程 记 忆 的形成［5］。研究已证实，受 cAMP 调节的下游蛋白 CREB 参与了氯胺酮导致未成年大鼠学习记忆障碍 的形成［6］，CREB 直接参与了水迷宫空间学习记忆的 形成［7］。而另一研究证实大鼠纹状体边缘区及海马 等脑区的 CREB 在空间学习记忆的早期就开始参与 长时记忆的形成［8］。 1． 3 磷 酸 化 的 CREB 蛋 白 （ phosphorylated CREB， P-CREB） CREB 磷酸化是许多信号转导通路的一 个会 聚 点，在 神 经 元 的 生 长、突 触 可 塑 性、学 习 和 记 忆功能、损伤和再生等方面起着重要作用。CREB 的 转录活性主要依赖于第 133 位丝氨酸残基（ Ser133） 的磷酸化（ 即 P-CREB） 。CREB 的 Ser133 位点被磷 酸化后，它 就 成 为 活 性 状 态，可 启 动 多 种 基 因 的 转 录，引起细 胞 内 多 种 长 期 生 物 学 效 应。 记 忆 的 形 成 依赖 P-CREB 通路诱导下游基因的表达［9］。研究证 实，中 枢 神 经 系 统 神 经 递 质 的 合 成、基 因 表 达、细 胞 增殖等均被通过以 P-CREB 为第二信使系统起作用 的神经递质调控。

TNF-α和钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在大鼠心肌缺血后适应中的作用刘敏;张家明;李超;郝海菊;李景东【摘要】AIM: To study the changes of myocardial TNF -α and total calcium - calmodulin - dependent protein kinase II ( CaMKII ) in sarcoplasmic reticulum ( SR ) after ischemic postconditioning. METHODS: The hearts of SD rats were collected and divided into 5 groups, including sham group, ischemia - reperfusion group, ischemic postconditioning group, recombinant human tumor necrosis factor receptor: Fc fusion protein( rhTNFR:Fc ) + ischemia - reperfusion group and rhTNFR:Fc + ischemic postconditioning group ( all n = 16 ). Eight hearts of each group were used to determine the levels of TNF - α and total SR CaMKII by RT - PCR and Western blotting, and the rest were used for the infarct size detection. RESULTS: The ratios of the infarct area to the ischemic area and the ischemic area to the total area in ischemia - reperfusion group were significantly increased than those in sham group ( P < 0. 01 ), while the ratios in ischemic post-conditioning group, rhTNFR: Fc + ischemia —reperfusion group and rhTNFR: Fc + ischemic postconditioning group were significantly decreased than those in ischemia - reperfusion group ( P <0.01 ). The expression of TNF - α at mRNA and protein levels was lower and the activity of SR CaMK II was higher in ischemic postconditioning group, rhTNFR: Fc + ischemic reperfusion group and rhTNFR: Fc + ischemic postconditioning group as compared to those in ischemia — reperfusiongroup ( P < 0. 01 ). Moreover, the activity of SR CaMK II in rhTNFR: Fc + ischemic postconditioning group significantly increased as compared with ischemia - reperfusion group and ischemic postconditioning group ( P < 0.01 ), and that in ischemic post-conditioning group was higher than that in ischemia — reperfusion group. CONCLUSION: Decreased TNF -α level and increased activity of CaMK II may contribute to cardio protective effect of ischemic postconditioning.%目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)和肌浆网钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在大鼠心肌缺血后适应发生机制中的作用.方法:SD大鼠随机分为5组(各组n=16),包括假手术组(sham组)、缺血再灌注组(IR 组)、缺血后适应组(IP组)、重组人肿瘤坏死因子受体:Fc融合蛋白(rhTNFR:Fc)+缺血再灌注组(F+IR组)和rhTNFR:Fc+缺血后适应组(F+IP组).结扎冠状动脉左前降支建立心肌缺血再灌注损伤和缺血后适应模型,测量各组心肌梗死面积;RT-PCR及Western blotting测定心肌TNF-α mRNA和蛋白及CaMKⅡ含量和活性.结果:(1)与sham组比较,IR组梗死面积/缺血区面积及缺血区面积/总面积的比值均显著增加(P<0.01);与IR组比较,IP组、F+IR组和F+IP组这2个比值均显著减少(P<0.01),其中F+IP组减少更为明显.(2) 与sham组比较,其余各组心肌组织TNF-α mRNA和蛋白均显著升高(P<0.01);与IR组比较,IP组、F+IR组和F+IP组TNF-α表达均显著降低(P<0.01);与IR组比较,IP组、F+IR组和F+IP组CaMK Ⅱ活性均明显升高(P<0.01),其中以F+IP组升高最为显著.(4)与sham组比较,IR组和IP组肌浆网CaMKⅡ活性显著降低(P<0.01),而F+IR组和F+IP组均明显升高;与IR组比较,IP组、F+IR组和F+IP组CaMKⅡ活性均明显升高(P<0.01),其中以F+IP组升高最为显著.结论:缺血后适应可通过降低缺血再灌注时心肌组织TNF-α mRNA和蛋白表达、增加CaMKⅡ含量和活性发挥心肌保护作用.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2012(028)007【总页数】5页(P1330-1334)【关键词】缺血后适应;心肌;钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ;肿瘤坏死因子【作者】刘敏;张家明;李超;郝海菊;李景东【作者单位】华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科,湖北,武汉,430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科,湖北,武汉,430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科,湖北,武汉,430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科,湖北,武汉,430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科,湖北,武汉,430022【正文语种】中文【中图分类】R541近年来在多种动物和人类发现心肌缺血预适应和后适应现象，即在心肌缺血前后给予多次短暂的缺血再灌注能减轻随后的再灌注损伤，两者具有内源性心肌保护作用，受到实验和临床研究的高度重视。

Ca2+在信号传导中对植物生理的影响一、摘要本文简要分析Ca2+在信号传导中作为第二信使配合钙调蛋白和钙依赖型蛋白激酶的机制原理，并概述其对植物生长生理的影响。

二、关键词：Ca2+钙调素 CDPK 第二信使三、引言我们知道，矿质元素对植物的生长发育和生理过程起着重要作用，Ca2+就是其中最为重要的离子之一。

Ca2+既是植物细胞壁的重要组成部分，大部分Ca2+在细胞壁中与果胶酸形成果胶酸钙，起支持和加固作用；Ca2+对维持膜结构的稳定性也有一定作用；同时，Ca2+作为第二信使配合钙调蛋白和CDPK在植物生理的信号传导过程中具有重要作用。

四、正文1、钙稳态在静息态的胞质中Ca2+浓度≤0.1μmol/L，而通常在细胞壁、ER、液泡、线粒体中的浓度会高2~5个数量级。

细胞壁是植物细胞的最大钙库[1]。

细胞中各处的钙离子浓度梯度在未受刺激时是保持相对稳定的，当受到刺激时，由于胞外Ca2+浓度高与胞内，此平衡就会被打破。

信号分子与受体结合通常引起跨膜的离子流动，从而引起膜电位的改变。

在质膜上，存在Ca2+通道，类似于水通道，引起Ca2+的内流；同时存在Ca2+泵，是Ca2+外流的通道。

在胞内钙库如液泡、ER等结构的膜上也存在相应的结构，其上的Ca2+通道是从钙库流向胞质的通道，Ca2+泵、Ca2+/nH+反向运输体是Ca2+从胞质流向钙库的通道。

因此细胞质中的游离Ca2+的浓度主要受质膜和内膜系统上的Ca2+通道和Ca2+泵的调节。

任何一种外界刺激或激素所引起的细胞反应通过Ca2+作为第二信使传递的直接证据是细胞质中是否有游离Ca2+的浓度变化。

2、Ca2+的作用方式有两种：第一种是游离Ca2+的浓度直接或间接影响植物的生理过程；第二种是胞质里的Ca2+与钙结合蛋白，如钙调蛋白CaM（也叫钙调素）、钙依赖型蛋白激酶（CDPK）结合而起作用。

3、钙调素3.1 钙调素( Calmodulin, CaM)是一种分布最广，功能最重要的钙依赖性调节蛋白。

[收稿日期]2001-04-28 [修回日期]2001-07-163[基金项目]国家自然科学基金资助项目(39770175);国家杰出青年科学基金资助项目(39925012);国家重点基础研究规划(G 1999054000)资助项目△山东省临沂市人民医院神经科,276003T el :0539-*******;E -mail :wqb666@[文章编号]　1000-4718(2002)10-1300-03钙/钙调素依赖性蛋白激酶-Ⅱ及其生物学作用3王全保△,　王建枝(华中科技大学同济医学院,湖北武汉430030)C alcium/calmodulin -dependent protein kinase Ⅱand its biologic functionWANG Quan -bao ,WANGJian -zhi(Department o f Pathophysiology ,Tongji Medical Univer sity ,Wuhan 430030,China ) 【A R eview 】　Ca 2+/calm odulin -dependent protein kinase Ⅱ(CaMK Ⅱ)is a member of a family of Ca 2+/calm odulin -regulated protein kinases which als o includes Ca 2+/calm odulin -dependent protein kinas 2es Ⅰand Ⅲ,my osin light chain kinases and phosphorylase kinase.Unlike the other members of this family ,CaMK Ⅱis multifunctional protein kinase and distributes in a variety of tissues.It is especially abundant in neuronal system.In hippocam pus ,CaMK Ⅱis about 2%of the total protein.Studies have shown that CaMKⅡplays an im portant role in a variety of biological processes ,such as regulation of gene transcription ,synthe 2sis of neurotransmitter ,phosphorylation of cytoskeletonal protein ,hippocam pal learning and mem ory formation. [关键词]　钙调蛋白;蛋白激酶Ⅱ;学习;记忆 [KE Y WOR DS]　Calm odulin ;Protein kinase -Ⅱ;Learning ;Mem ory [中图分类号]　R363 [文献标识码]　A 钙/钙调素依赖性蛋白激酶-Ⅱ(calcium/calm odulin -dependent protein kinase -Ⅱ,CaMK Ⅱ)是一种多功能蛋白激酶,存在于许多动物细胞内,尤其在神经组织中含量丰富。

ｆｉｅ，Ｅｍａｉｆ：ｚｈａｎｇｊ９７５＠ｓｉｎａ．ｔｏｍ
Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅⅡ８
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｆｉｖｅ
（ＣａＭＫ ｌＩ ８）Ｏｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ＰＣ一３ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｈｕｍａｎ ＣａＭＫ Ⅱ８ ｓｉＲＮＡ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ＰＣ一３ ｃｅｌｌｓ．ＣａＭＫⅡ８ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ
・１０４８・
生垡塞墼处抖苤查！Ｑ！！生堡旦箜！！鲞箜堡塑ｇ！也』垦！Ｐ！！垡：垒Ｐ堕！！Ｑ！！，！！！．！！：盟！．堡
・实验研究・
钙／钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ６通过 Ｗｎｔ／１３一连环素通路调节前列腺癌细胞 增殖和侵袭
张兴华张杰 罗鹏程民医院泌尿外科
通信作者：张杰，Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎ自９７５＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ
【关键词】前列腺肿瘤；钙／钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ８；增殖；侵袭；Ｗｎｔ／１３一连环蛋
白通路 基金项目：国家自然科学基金（８１４７０９２３）
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ １Ｉ ８
ｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ
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ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓ．
Ｔｒｉｓ—ＨＣｌ缓冲液（ＴＢＳＴ）溶液４℃封闭ＰＶＤＦ膜过夜。 分别加入ｌ：１ ０００稀释一抗和内参，４℃摇床过夜。用 含０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０的ＴＢＳＴ溶液洗涤３次，然后加入辣

异丙肾上腺素对大鼠心脏功能的动态影响左琳;宋峰;赵锐;李端端;石山慧;贺忠梅;刘慧荣【摘要】目的：观察异丙肾上腺素(ISO)对在体大鼠心脏功能、心室肌细胞功能以及胞内相关下游蛋白表达的动态影响。

方法采用血流动力学方法及乳鼠心肌细胞培养,观察ISO对在体及离体大鼠心肌收缩能力的影响；通过Fura 2荧光探针法观察ISO对成鼠心肌细胞内游离钙水平的影响；Western blot 检测 ISO下游胞内相关蛋白表达水平的变化。

结果(5~500)nmol/L ISO对成鼠在体心功能有一个剂量依赖性增强效应,100 nmol/L为其最佳实验浓度：0.1μmoI/LISO作用大鼠心室肌细胞(1000~1200)s,胞内游离钙水平达高峰。

0.1μmoI/LISO作用于乳鼠心肌细胞30 min可使其跳动频率达高峰,维持至60 min后开始下降,与胞内钙变化规律一致。

心室肌细胞内钙调蛋白激酶Ⅱ(Calmodulin kinaseⅡ,CaMKⅡ)水平在ISO干预后3 h达高峰；G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)和β arrestin也在 ISO作用后48 h达高峰。

结论 ISO可通过兴奋胞内Ca2+ CaMKⅡ信号通路参与心肌细胞功能活动的动态调节；同时,ISO长期作用可升高胞内GRK2β arrestin水平,参与受体的脱敏调节。

【期刊名称】《中西医结合心脑血管病杂志》【年(卷),期】2015(000)005【总页数】5页(P589-593)【关键词】异丙肾上腺素;细胞内游离钙;心脏功能;钙调蛋白激酶Ⅱ;G蛋白偶联受体激酶2;β arrestin【作者】左琳;宋峰;赵锐;李端端;石山慧;贺忠梅;刘慧荣【作者单位】山西医科大学基础医学院生理学系太原 030001; 山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室;山西医科大学基础医学院生理学系太原030001;山西省儿童医院临床医学检验中心;山西医科大学基础医学院生理学系太原 030001; 山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室;山西医科大学基础医学院生理学系太原 030001; 山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室;山西医科大学基础医学院生理学系太原 030001; 山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室;首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学系【正文语种】中文【中图分类】R285;R255在心肌重构以及心衰的发生、发展过程中。

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中国当代儿科杂志 第 ９卷第 ４期 Ｃ ｈ ｉ ｎＪ Ｃ ｏ ｎ ｔ ｅ ｍ ｐＰ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｒ ２ ０ ０ ７年 ８月
Ｖ ｏ ｌ ． ９Ｎ ｏ ． ４ Ａ ｕ ｇ ． ２ ０ ０ ７
Ｄ Ａ ） 阻滞剂阻断不同类型的钙离子内流， 测定钙离子 的动态变化， 用Ｍ Ｔ Ｔ法测定细胞的活性， 免疫印记技 术检测 Ｃ ａ Ｍ Ｋ 和 Ｃ ａ Ｍ Ｋ 的表达， 以期阐明钙调蛋 Ⅱ Ⅳ 白依赖性激酶在神经元缺氧损伤中的作用。
中国当代儿科杂志 第 ９卷第 ４期 Ｃ ｈ ｉ ｎＪ Ｃ ｏ ｎ ｔ ｅ ｍ ｐＰ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｒ ２ ０ ０ ７年 ８月
Ｖ ｏ ｌ ． ９Ｎ ｏ ． ４ Ａ ｕ ｇ ． ２ ０ ０ ７
新生儿脑损伤专栏·实验研究
钙及钙调蛋白依赖性激酶在神经元缺氧损伤中的作用
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ｌ司外医学呼吸系统分Ⅱ｜｝２００３｛Ｆ第２３卷第４期尾加压素Ⅱ生物学作用的研究进展·１８３·广州呼吸疾病研究所（广州５１０１２０）彭公永综述冉丕鑫钟南山审校摘要尾加压崇１１（ｕｒｏｔｅｎｓｉｎｌｌＪＪ—ＩＩ）是发上见于硬甘鱼尾部下垂体的活性从。

日前·从人体中已克降出ｕＩｉ．并发现其受体ＧＰＲｌｌ分布下Ａｔ｝－的多个部位，ＵＩＩ与Ｇｔ’Ｒ１４结合后，参与许多生物学效应，如舒缩血管、收缩５１道歧促细胞增殖等。

关键词尾ＪＪⅡ妪索；生物学作用尾加压素¨（ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ１Ｉ。

ｕⅡ）最早发现于硬骨鱼垲部下垂体，后证实其分布具有种属普遍性。

近米，从人体中已克隆ｍＵ—Ｈ．并发现其受体ＧＰＲｌ４，ｕⅡ与ＧＰＲｌ４结合后，引起细胞内ｃａ引浓度升高，参与许多生物学效应，本文就其生物学作用做一综述。

１结构、受体及其分布１９８０年，ｕⅡ首次从虾虎鱼尾部Ｆ垂体中被人Ｔ。

提纯，日前在多种物种（包括人类）中郡克隆出了ｕＨ。

不同物种ＬＪＵ的结构虽有差异．但都有一环形结构，序列为半胱氨酸举丙氨酸色氨酸赖氨酸酪氨酸一半胱氯酸，此环状六肽是ｕ—ＩＩ的活性中心，从佰类到几娄，ｕⅡ的环形活性中心相当保守…，它与生长抑索一１ｄ的活肚中心（苯丙氨酸色氨酸赖氨酸苏氰酸）相类似．但荩冈分析证实二者并非同源。

与其他物种牛ｎ比，人的ｕ一１１只有ｎ个氨基酸残基，但其环状？ｉ肽结构仍十分保守。

研究ｕⅡ的前体发现．ｕ一｜１序列位丁其前休的ｃ端，哺乳炎ｕ一¨是其前体产生的唯有生物活性的多肽。

ＵＩＩ的分布很普遍。

在鱼类，ｕ—ｌＩ广泛分布于建部神绎分泌系统；在蛀，ＵⅡ上要分布于蜓髓和尾部脑垂体的运动神经元．在端脑、问腑、中脑及后脑仅有其舒ｕ—ＩＩ反应性的致密神经纤维网，尤其在丘脑、顶盖、人脑脚更为明显；胚胎期大鼠，ｕⅡ在骶骨水平运动神经元高度表达．在颈部水平和胸部水平仅有微鼍表达，出生后ｕ一¨在争身各水平运动神经元的表达都增加，成年后，ｕ—ＩＩ主要表达于脑ｒ和脊髓，其中在腑十外展神经梭高度分布，在脊髓背侧角中度分布．另外．在丰动脉也有低度分布”；在人类．ｕⅡ主要分布于脊髓的运动神经元，在：骨胳肌和人脑皮质分布水平【ｉ王较高，。