原代肿瘤细胞的培养

肿瘤细胞原代培养及药敏(MTT法)的质量控制徐文科1,乔小云2(1.安徽省皖南医学院弋矶山医院,安徽芜湖241001;2.江苏省南京市鼓楼医院,江苏南京210008)摘要:目的考察肿瘤细胞原代培养及药敏(MTT法)各项操作规程,为质量控制提供实践依据。

方法在操作过程中,注意强化无菌操作、规范化取舍标本、显微镜下控制单细胞悬液浓度、培养和测定条件的控制、工作液稳定性的研究。

结果肿瘤细胞原代培养及药敏(M TT法)的结果稳定性有了很大的提高。

结论通过严格控制实验操作程序,肿瘤药敏M TT 法的临床相符性令人满意,可在实际工作中推广。

关键词:肿瘤细胞;培养;药敏;质量控制肿瘤细胞培养和药敏实验是筛选抗肿瘤药物的主要研究方法[1,2]。

不合适的临床抗肿瘤化疗药物不仅使治疗失败,同时能诱导肿瘤细胞产生耐药性。

因此,对提高临床疗效、减轻毒副作用也具有重要的意义[3]。

目前国内的医疗机构中,对肿瘤组织进行细胞培养及药敏实验大多采用体外四氮唑盐(M TT)法,具有操作简便、成本低廉、耗时少、无放射性等优点[4~6]。

该法主要的缺陷是,结果不稳定导致与临床相符性差。

究其原因,因为在整个操作过程中,需要严格质量控制的步骤较多,各种操作过程需要多次试验来验证[7,8]。

我们在实际工作中,通过流程质量控制,获得了比较满意的结果。

现报道如下。

1操作规范化1.1强化无菌操作在细胞培养及药敏实验时,需要配制1640培养液、工作浓度的试剂和抗肿瘤药物、含有抗生素的生理盐水等。

这些药液的配制要求必须在净化的空间中配制,以免有细菌的污染。

参与配制的玻璃瓶、培养皿、不锈钢细胞滤筛、试管、移液管、吸头等器械均需在清洗后121e、30 m i n水蒸汽湿热灭菌。

对微量移液系统、洗耳球等不宜湿热灭菌的物品,在实验操作前后,用75%乙醇或0.1%醋酸氯己定溶液擦拭灭菌,可以获得较好的无菌效果。

1.2病理标本的规范化取舍一般来说,在室温条件下,组织细胞离体2h,后,活性受影响。

原代细胞的培养与建系凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。

细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。

第一节原代细胞的取材人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。

一、取材的基本要求.1．取材要注意新鲜和保鲜.2．应严格无菌.3．防止机械损伤.4．去除无用组织和避免干燥.5．应注意组织类型、分化程度、年龄等.6．作好记录二、各类组织的取材技术皮肤和粘膜的取材内脏和实体瘤的取材血液细胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材动物组织取材人胚体组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材皮肤和粘膜的取材.主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘米。

内脏和实体瘤的取材.内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。

血液细胞的取材.血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。

骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材.严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。

动物组织取材.1、鼠胚组织取材.首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。

.2、幼鼠胚肾（或肺）取材.幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。

第6章肿瘤细胞得培养肿瘤细胞培养就是研究癌变机理、抗癌药得敏感性、肿瘤细胞与癌分子生物学特性得重要手段。

癌细胞就是比较容易培养得细胞，当前所建立得细胞系中癌细胞就是最多得。

应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1)可免受机体内环境因素得影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化与生物因素对肿瘤细胞生命活动得影响。

(2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞得结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变得发生机理；(3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性与遗传行为得改变。

(4)可用于快速筛选抗癌药物与研究耐药机理。

(5)研究周期短，比较经济。

但就是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变;体外实验所得得结果不能完全代表体内得情况，应与体内试验结合研究更为合理等。

一、肿瘤细胞培养得生物学特性1、形态与性状形态不规则,细胞界限淸晰，伸展较差,核膜、核仁轮廉明显，核仁多、核浆丰富、折光性强, 电镜观察细胞表而微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不左向运动与铺着不依赖性有关、2、生物特性癌细胞在无血淸或低血淸(2%~ 5 %)时仍能生长,营养要求不奇，因能自分泌促增殖因子, 在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱与密度大，有丰富得三极有丝分裂，分裂指数髙，细胞倍增周期短。

3、永生性永生性也称不死性,在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptos i s ),体外培养得肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。

但体外培养得永生性与体内肿瘤得恶性(包括侵润性) 就是两种性状，受不同基因调控得，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若「代,说明体外培养得永生性可在体外培养后获得得。

另外，体外培养得许多细胞系，如N 1H3T3、Rat -1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。

但两者有相关性，永生性可能就是细胞恶性变得某一阶段。

原代培养(primary culture) 是指直接从机体取出组织或细胞后所进行的首次培养。

由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。

这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。

利用此方法还可直接服务于临床实践，例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选，根据肿瘤细胞对加入的化疗药物的敏感性来帮助选择最有效的化疗方案，有可能起到增强疗效、降低副作用的作用。

原代培养可分为消化法和组织块培养法，这里统一作介绍。

一、培养细胞生长的条件1、细胞的营养需要a、基本营养物质：氨基酸、维生素b、促生长因子等物质c、此外激素也可有助于细胞生长培养液（medium）：培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。

血清（FBS，FCS，CS，HS）、合成培养基，如:DMEM、RPMI 1640和Ham F12 等。

2、细胞的生存环境a、温度:适宜的温度与取材的动物种类有关b、气相及pH: 5%CO2；pH: 7.2-7.43、无污染及无毒：无毒是培养细胞的必须条件，细菌，病毒，支原体等。

二、培养细胞的生长方式1、贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。

见于各种实体瘤细胞2、悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。

各种造血系统肿瘤细胞【实验步骤】一、消化法培养的基本操作1、操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手，手和临时带进无菌室的物品、工具等均用新洁尔灭浸泡消毒2分钟。

2、将胎鼠或新生鼠处死，然后用75%酒精浸泡消毒数秒，迅速带进入无菌室。

3、将胎鼠或新生鼠置超净工作台上，使其背部朝上，用碘酒棉球擦洗背部的被毛，然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦过的部位。

4、在腰部的后缘，用解剖镊提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤，用镊子将剪开的皮肤拉向两侧。

用解剖剪剪开背部的肌肉，此时，即可见蚕豆状的肾脏，用镊子取出肾脏，放于无菌的已加入D-Hanks液的培养皿中。

肿瘤细胞原代培养
肿瘤细胞原代培养是一种将体内肿瘤组织中的细胞分离出来，在培养基中进行繁殖和扩增的方法。

这种方法可以帮助研究人员更深入地了解肿瘤细胞的生物学特性，发现新的治疗方法和药物。

肿瘤细胞原代培养需要选择适当的细胞类型和培养条件。

通常采用的细胞类型有肺癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤细胞。

培养条件包括培养基的成分、PH值、温度、氧气含量、营养物质等。

肿瘤细胞原代培养的优点是可以获得大量的肿瘤细胞，方便进行实验和研究。

同时，原代培养的肿瘤细胞更接近于体内的肿瘤细胞，更适合用于药物筛选和毒性测试。

然而，肿瘤细胞原代培养也存在一些缺点。

由于肿瘤细胞的不稳定性和异质性，有些肿瘤细胞很难在培养中生长和扩增。

此外，肿瘤细胞原代培养也容易受到外界因素的干扰，如细菌和真菌的污染、PH 值的变化等，从而影响实验结果的准确性。

因此，在进行肿瘤细胞原代培养时，需要注意细胞的选择和培养条件的控制，尽可能减少外界因素的干扰，以获得准确可靠的实验结果。

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抗肿瘤药物的体外体内模型权威验证评价肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，而抗肿瘤药物的研发是治疗肿瘤的重要手段之一。

为了评估抗肿瘤药物的疗效和安全性，科学家们通常会使用体外体内模型进行验证评价。

这些模型可以模拟肿瘤细胞内的药物作用和体内的药物代谢，为药物研发提供重要的参考依据。

下面将介绍几种常用的体外体内模型，并对其权威性验证评价进行讨论。

一、细胞模型细胞模型是研究抗肿瘤药物作用机制和疗效评估的重要工具。

常见的细胞模型包括肿瘤细胞系、原代肿瘤细胞和3D细胞培养模型。

1. 肿瘤细胞系：肿瘤细胞系是从患者的肿瘤组织中分离和培养出来的细胞系。

它能够长期稳定地生长，在体外模拟肿瘤细胞的特性和药物反应。

通过测定细胞的增殖、凋亡和迁移能力，可以对抗肿瘤药物的治疗效果进行初步评估。

2. 原代肿瘤细胞：原代肿瘤细胞是从患者新鲜手术标本中分离和培养出来的细胞。

与肿瘤细胞系相比，原代肿瘤细胞更接近真实的肿瘤环境，具有更高的生物学真实性。

因此，原代肿瘤细胞模型被广泛应用于抗肿瘤药物的体外评估。

3. 3D细胞培养模型：3D细胞培养模型是一种能够模拟肿瘤组织结构和功能的模型。

它通过在细胞培养基中添加支撑基质，使细胞能够在三维空间中生长和相互作用。

这种模型更接近于真实的肿瘤微环境，能够更准确地评估抗肿瘤药物的疗效和毒副作用。

二、动物模型除了细胞模型外，动物模型也是评估抗肿瘤药物疗效和安全性的重要手段。

常见的动物模型包括小鼠模型、大鼠模型和人源异种移植瘤模型。

1. 小鼠模型：小鼠模型是最常用的抗肿瘤药物研发模型之一。

小鼠体内的肿瘤模型可以通过移植肿瘤细胞、异种移植瘤或基因敲除等方式得到。

通过观察肿瘤的生长抑制、体重变化和生存率等指标，可以评估抗肿瘤药物的疗效和毒副作用。

2. 大鼠模型：大鼠模型与小鼠模型类似，但由于其体型较大，更适合用于评估肿瘤治疗手术的效果。

大鼠模型还可以用于评估肿瘤转移和药物代谢等指标，为抗肿瘤药物的疗效评估提供更全面的信息。

人肺的成纤维细胞1.准备2个50ml的离心管，加入20ml的1640+10%FBS+0.1%三抗。

置于冰盒内。

手术标本取距离肿瘤2cm的标记CAF；距离肿瘤大于2cm的标记NF。

取回的组织在超净台内处理。

2.用1%双抗PBS清洗组织，直至溶液清洗。

尽量去除血清及杂志。

去除血管（黑）等附属物。

3.用剪刀剪碎组织（时间5min以内），大小1mm3,加入双抗PBS,将组织吹散，静止15min,更换新的PBS，离心沉淀组织块。

4.用FBS打湿25cm2培养瓶底，吸掉多余的FBS，静置。

准备200ul 的tip剪掉尖头，用火烧弯。

200ul的tip吸取组织快，接种于培养瓶内，每瓶大约25块。

将培养瓶倒置，加入2ml的1640+10%FBS+0.1%三抗，置于培养箱中，6.除，继续培养2-3天，待细胞长满，即可传代。

注：因为血清浓度低，内皮细胞可以爬出少量，但是很快就会死掉。

7.传代用0.25%胰酶常规消化，以1:2传代，传代完后，采用差速贴壁法纯化一次，即待细胞贴壁1.0 –1.5 h后(即绝大多数成纤维细胞都已经贴壁)，弃去未贴壁的细胞和培养液，更换新的培养液。

鼠成纤维细胞的原代培养1.小鼠颈椎脱臼致死,置于75%的酒精中,转移到超净台内.2.酒精擦拭小鼠2次.镊子夹取皮肤,剪开笑口,钝性分离.剪开肿瘤块外包膜(NF)一个小口,剥离出肿瘤块放入一个培养皿中.剪掉外包膜,放入另一个培养皿中（NF）.洗涤两次.封口转移至细胞放内.3.NF培基吸走,用剪刀剪碎至0.5-1mm3CAF剪取肿瘤块的内包膜，剪碎至0.5-1mm3Ⅳ型胶原蛋白（或胰酶），4℃（或37℃）培养箱过夜。

（或者此步骤省掉）。

4.用纯的血清或者20%血清浸湿组织块。

弯头吸管（注射器）吸取组织块，培养瓶种植0.5CM间隔，15-20块/25ML培养瓶。

5.将组织块加到培养瓶壁上，竖起，培养箱中培养2-4h，直至贴壁。

加入培养基培养。

翻动培养瓶使底朝上，加入2-3ML的培养基，塞紧瓶塞，置于培养箱，2-3h,待组织贴壁。

肿瘤细胞原代培养实验具体方法及步骤肿瘤细胞的原代培养与正常细胞的原代培养的条件基本相似。

一般常用原代细胞的基础培养基，10%血清浓度即可，在原代培养时需加入原代细胞培养的特制添加物，或原患者血清（1%-2%）以利细胞生长。

用细胞生长因子如胰岛素、氢化可的松、雌激素等等。

也可以考虑动物媒介培养。

根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子。

具体步骤一、将取得的瘤组织去除脂肪、结缔组织及坏死部分。

二、在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎组织，切成1-2 mm3小块。

三、接种于培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2或加盖并塞在普通恒温箱中培养。

注意一、注意污染1、严格进行动物皮肤消毒，使用三套器械取材。

新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%——5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。

2、严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。

自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。

细胞计数可在有菌环境中进行。

3、吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；吸取液体时，避免瓶口和吸管碰撞。

4、离心管入台前，管口、管壁应消毒。

5、实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。

6、使用过的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一个器皿中继续消毒，在浸泡器械时剪刀口要叉开放，镊子弯头要向下放，并加盖消毒。

凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。

二、器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。

经火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷却。

总结经验一、对肿瘤细胞系或细胞株的评价已建成的各种肿瘤细胞系或细胞株，无疑都是可用的实验对象。

近年我国已建成的肿瘤细胞系已非常多，并获得越来越广泛的应用。

但根据研究者的经验，在使用这些细胞系时，应持特别审慎态度，主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变的可能。

众所周知，长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的。

另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化。