中国小麦花叶病毒 CWMV) ( 生物学特性初探

中国小麦花叶病毒(CWMV)侵染条件下小麦内参基因的选择吴讷;陈炫;姜瑶瑶;张天烨;羊健;朱统泉;张恒木;陈剑平【摘要】实时定量PCR(qRT-PCR)是分析功能基因表达水平的常用方法之一,qRT-PCR数据统计分析离不开合适内参基因的选择.为了选择中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)侵染条件下的小麦内参基因,本实验通过PCR扩增效率和扩增特异性分析,从10个持家基因中选择8个候选基因,然后以接种CWMV的小麦样品为材料,利用qRT-PCR技术进一步检测上述8个基因在CWMV侵染条件下小麦样品中的时空表达特性.基于这些数据,通过geNorm、NormFinder程序分析,结果表明,2个小麦基因(即26S和CDC)在CWMV侵染前后以及不同组织中表达最为稳定,26 S和CDC组合可选作CWMV与小麦互作过程中功能基因表达分析的内参基因.【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2018(030)007【总页数】6页(P1182-1187)【关键词】内参基因;小麦;中国小麦花叶病毒;qRT-PCR【作者】吴讷;陈炫;姜瑶瑶;张天烨;羊健;朱统泉;张恒木;陈剑平【作者单位】浙江农林大学农业与食品科学学院,浙江杭州311300;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021;浙江农林大学林业与生物技术学院,浙江杭州311300;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021;浙江农林大学林业与生物技术学院,浙江杭州311300;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021;浙江农林大学林业与生物技术学院,浙江杭州311300;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021;驻马店农业科学院,河南驻马店463000;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021;浙江农林大学农业与食品科学学院,浙江杭州311300;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021【正文语种】中文【中图分类】S435.121定量PCR(qRT-PCR)是现代分子生物学中研究基因表达的重要手段之一。

小麦黄花叶病毒病小麦花叶病毒病也叫黄花叶病。

调查发现,该病在黄淮海冬麦区的河南周口、驻马店、漯河以及安徽阜阳等地均有发生,是该区近几年发现的一种小麦新病害,已经成为小麦生产中的一个新问题。

一、小麦花叶病毒病症状染病后冬前不表现症状，到春季小麦返青期才出现症状，染病株在小麦4~6叶后的新叶上产生褪绿条纹，少数心叶扭曲畸形，以后褪绿条纹增加并扩散。

病斑联合成长短不等、宽窄不一的不规则条斑，形似梭状，老病叶渐变黄、枯死。

病株分蘖少、萎缩、根系发育不良，重病株明显矮化。

二、小麦花叶病毒病病原Wheat spindle streak mosaic virus简称WSSMV，称小麦梭条斑花叶病毒，又名小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic irus)。

属马铃薯Y病毒组。

病毒粒体线状，大小200~3000×13(nm)。

病株根、叶组织含有典型的风轮状内含体。

钝化温度50℃经10分钟，稀释限点1000~1000000倍。

地区不同致病力有差异，品种间抗病性差异明显。

三、小麦花叶病毒病传播途径和发病条件梭条花叶病毒主要靠病土、病根残体、病田水流传播，也可经汁液摩擦接种传播。

不能经种子、昆虫传播。

传播媒介是一种习居于土壤的禾谷多粘菌(Polymyxa graminis Led.)。

该菌是一种小麦根部的专性弱寄生菌，本身不会对小麦造成明显为害。

冬麦播种后，禾谷多粘菌产生游动孢子，侵染麦苗根部，在根细胞内发育成原质团，病毒随之侵入根部进行增殖，并向上扩展。

小麦越冬期病毒呈休眠状态，翌春表现症状。

小麦收获后随禾谷多粘菌休眠孢子越夏。

病毒能随其休眠孢子在土中存活10年以上。

土温15℃左右，土壤湿度较大，有利于禾谷多粘菌游动孢子活动和侵染。

高于20℃或干旱，侵染很少发生。

播种早发病重，播种迟发病轻。

四、小麦花叶病毒病防治方法1、选用抗、耐病品种。

2、轮作倒茬。

与非寄主作物油菜、大麦等进行多年轮作可减轻发病。

核农学报2024，38（5）：0861~0869Journal of Nuclear Agricultural Sciences小麦黄花叶病抗性研究及育种应用进展范德佳王汝琴何震天张容王建华韩燕陈士强 *（江苏里下河地区农业科学研究所，江苏扬州225007）摘要：小麦黄花叶病是一种全球性的土传病毒病，严重时会导致小麦产量大幅下降。

小麦黄花叶病毒（WYMV）是主要的病原体之一，属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）大麦黄花叶病毒属（Bymovirus），以禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）为媒介感染小麦。

目前已鉴定出14个抗WYMV的基因位点，图位克隆了1个抗病基因，证实了3个基因具有抗病性调控功能，已育成多个抗病小麦品种（系）。

本文从小麦黄花叶病毒的病原体特性、病害分布、小麦抗性遗传和抗病育种等方面，综述了WYMV及小麦抗病性的研究进展，并对WYMV抗性基因挖掘和小麦抗病育种应用进行了展望。

关键词：小麦黄花叶病；病毒特性；抗病基因；抗病育种DOI：10.11869/j.issn.1000⁃8551.2024.05.0861小麦黄花叶病是一种在世界各地广泛发生的土传病毒病，可导致小麦产量大幅度降低，其中中国有约200万公顷冬小麦的生产受到小麦黄花叶病的威胁。

该病害在我国最早发现于四川省雅安市，目前已扩展至长江中下游以及淮河流域，在山东、河南、江苏、安徽、湖北、陕西等地相继发生［1-3］。

其症状与非生物胁迫（营养缺乏、霜冻或涝渍等）导致的老叶褪绿不同，黄化斑点在小麦幼苗的新生叶上即可表现出来。

一般而言，受感染小麦植株在营养生长期新生叶呈现黄色，在拔节期生长发育迟缓或成熟延迟，最终导致产量下降，病害严重时小麦加工和烘焙品质也会大幅降低。

我国的小麦黄花叶病主要由小麦黄花叶病毒（wheat yellow mosaic virus， WYMV）和中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus， CWMV）侵染导致，WYMV在中国和日本均有分布，而CWMV仅分布在中国的山东、河南、河北、江苏等地［1］。

中国小麦花叶病毒侵染性克隆构建及运动蛋白的功能分析中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)为真菌传杆状病毒属(genus Furovirus)的一个新成员,通常与大麦黄花叶病毒属(genus Bymovirus)的小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)复合侵染,引起我国山东胶东冬小麦地区发生严重的田间病害。

该病毒由土壤中的禾谷多黏菌(Polymyxa graminis L.)传播,此菌在土壤中广泛分布,且抗逆性强,很难用化学药剂防治,而在生产上抗CWMV的小麦品种缺乏,急需进行抗病新种质的创新。

研究CWMV致病机理,不仅为抗病种质资源的创制提供理论依据,并且丰富相关植物病毒的分子生物学知识。

本研究主要内容分两部分：(1)构建CWMV侵染性cDNA克隆；(2)对CWMV RNA1编码的37K蛋白功能进行研究和分析。

根据已报道的CWMVRNA1和RNA2序列(登录号：AJ271838和AJ271839)分段设计序列引物,扩增了CWMVRNA1和RNA2的cDNA片段并进行了拼接,对拼接产物进行亚克隆,获得CWMV全长cDNA克隆。

以获得的克隆质粒为模板,线性化后,利用T7RNA聚合酶进行体外转录,体外转录产物摩擦接种烟草和小麦,17℃培养,Western blot未能检测到接种的烟草或小麦植株中CWMV外壳蛋白的表达。

体外转录物转染拟南芥原生质体后,17℃培养,在原生质体内可检测到微量外壳蛋白的积累,表明此侵染性克隆具有活性,但效率较差,有待于摸索条件进一步提高其侵染活力。

利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合表达系统,对CWMVRNA1编码的37K基因进行融合表达,得到预期大小的蛋白条带。

对37K包涵体蛋白进行了纯化,并免疫苏格兰大白兔制备了抗血清。

ELISA 检测感病小麦叶片表明,此抗血清可以用于检测感病的小麦和在烟草叶片中此蛋白的表达。

小麦土传花叶病的特点及危害到小麦返青时期，总有一些农户反映自己的麦田到底得了一种病，也有的说得了“黄锈病”。

其实这是小麦土传花叶病在作祟。

每年发生的小麦病毒病有三种，分别是小麦土传花叶病、黄矮病、丛矮病。

后两种在今年春节前后发病不具备条件，因为今年蚜虫越冬基数低且少，比较三者的发病症状及规律，再经过对比得病麦苗也不难看出。

下面小编就为大家介绍下小麦土传花叶病的特点及危害。

1、小麦土传花叶病是土壤禾谷多粘菌传播的病毒病害总称。

感病后明显特征为叶片扭曲，叶面有突起点，叶片扭曲和突起部位进而黄化，形成黄叶；病株茎杆中空且明显软化，后期极易倒伏，严重影响产量。

发病规律：该病是以自然介体禾谷多粘菌传播，可随耕作、流水等方式扩大危害；一般温度在10-25℃显症，高于20℃病菌随介体进入休眠状态；春季多雨潮湿、地势低洼、重茬连作、沙土地等均有利于病害发生；灌溉地水流的下方严重。

2、小麦黄矮病：小麦从幼苗到成株期都能感病。

苗期感病时，叶片失绿变黄，病株矮化严重，高度只有健株的三分之一到二分之一，甚至更矮。

典型症状为：上部幼嫩叶片从叶尖开始发黄，逐渐向下扩展，使叶片中上部也发黄(发黄部分一般占全叶三分之一到二分之一)，发黄叶片呈亮黄色，鲜艳有光泽，叶脉间有黄色条纹，所以叫做黄叶病。

早期病株在田间呈点片分布，感病晚的病株常单株分散在田间。

小麦黄矮病主要以蚜虫吸食麦苗并传毒。

3、小麦丛矮病：染病植株上部叶片有黄绿相间条纹，分蘖增多，植株矮缩，呈丛矮状。

冬小麦播后20天即可显症，最初症状心叶有黄白色相间断续的虚线条，后发展为不均匀黄绿条纹，分蘖明显增多。

轻病株返青后分蘖继续增多，生长细弱，叶部仍有黄绿相间条纹，病株矮化。

一般不能拔节和抽穗。

小麦丛矮病毒不经汁液、种子和土壤传播，主要由灰飞虱传毒。

灰飞虱吸食后，需经一段循回期才能传毒。

小麦梭条斑花叶病毒病小麦梭条麻花叶病，又名小麦黄花叶病。

主要分布于我国四川、陕西、江苏、浙江、湖北和河南等省。

此病在我国60年代以前只是零星发生，70年代以来在四川等地扩大蔓延，成为小麦生产上的问题。

近年来，在江苏、河南和陕西等地不断扩大蔓延，新病区不断扩展，为害日趋严重，而且仍有继续扩大蔓延的趋势，成为很多麦区小麦生产上的新问题。

该病只为害小麦。

除零星发病田外，一般病田减产10～50%，重者可损失60～80%，甚至绝收，严重影响产量。

此病在田间还可与土传小麦花叶病混合侵染小麦。

症状小麦梭条斑花叶病一般只为害冬小麦。

感病小麦冬前一般不表现症状，要到春季小麦返青期才出现症状。

长江流域及其以南地区气候适宜时，冬前有时也表现出轻微症状。

病株发病初期新出生的叶片呈现褪绿至坏死的梭形条斑，与绿色组织相间，成花叶症状；后期由于病组织扩大，可导致整个叶片发黄，严重的发病植株矮小，分蘖减少。

电镜切片观察，在病叶细胞中可见到风轮状、柱状或膜状内含体。

内含体在细胞中常常集结成块存在，占去细胞的大块区域。

风轮状或柱状内含体由弯曲的片层组成，纵切面上类似一条直线，相互之间常是平行排列；横切面上，弯曲的片层围绕一个共同的中心轴而成风轮状。

小麦梭条斑花叶病的田间症状及发病特点与土传小麦花叶病十分相似，不易区分。

通过电镜观察病毒粒体或血清学方法如酶联免疫吸附法或免疫电镜方法检测可区分两病的病原。

病原病原为小麦梭条斑花叶病毒（wheat spindle streak mosaic virus），又名小麦黄花叶病毒（wheat yellow mosaic virus），属马铃薯Y组病毒。

病毒粒体为弯曲的线条状，为两种粒体的二分体，长粒体约为600nm，短粒体约为300nm，病毒粒体直径约为12nm。

考马斯亮兰染色检测病毒的外壳蛋白，其分子量约为36千道尔顿。

提纯病毒免疫兔子获得病毒专化性抗血清可用于病毒的检测和鉴定。

由于病毒粒体比较脆弱，容易断裂，形成短粒体，同时病毒粒体又易首尾相接形成比其本身长的粒体。

浙江农业学报ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＺｈｅｊｉａｎｇｅｎｓｉｓꎬ２０１９ꎬ３１(５):７７７－７８３ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｚｊｎｙｘｂ.ｃｎ张岩ꎬ亓玉华ꎬ鲁燕华ꎬ等.小麦黄花叶病毒Ｐ３蛋白致病功能域的鉴定和分析[Ｊ].浙江农业学报ꎬ２０１９ꎬ３１(５):７７７－７８３.㊀ＤＯＩ:１０ ３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００４￣１５２４ ２０１９ ０５ １３收稿日期:２０１９￣０１￣２５基金项目:国家现代农业小麦产业技术体系(ＣＡＲＳ￣３￣１)ꎻ农业农村部/浙江省植保生物技术重点实验室开放课题作者简介:张岩(１９９３ )ꎬ女ꎬ山东枣庄人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物病毒￣宿主互作研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈａｎｇｘｉａｏｌｉ１０２８＠１６３.ｃｏｍ∗通信作者ꎬ陈剑平ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｊｐｃｈｅｎ２００１＠１２６.ｃｏｍ小麦黄花叶病毒Ｐ３蛋白致病功能域的鉴定和分析张㊀岩１ꎬ２ꎬ亓玉华１ꎬ２ꎬ鲁燕华２ꎬ杨乾坤２ꎬ何雨娟２ꎬ李俊敏２ꎬ３ꎬ陈剑平１ꎬ２ꎬ３ꎬ∗(１.福建农林大学植物保护学院ꎬ福建福州３５０００２ꎻ２.浙江省植物有害生物防控国家重点实验室培育基地ꎬ农业农村部/浙江省植保生物技术重点实验室ꎬ浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所ꎬ浙江杭州３１００２１ꎻ３.宁波大学植物病毒学研究所ꎬ浙江宁波３１５２１１)摘㊀要:小麦黄花叶病毒(ＷｈｅａｔｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＷＹＭＶ)隶属于马铃薯Ｙ病毒科(Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ)大麦黄花叶病毒属(Ｂｙｍｏｖｉｒｕｓ)ꎬ其基因组由两条正义单链ＲＮＡ组成ꎬ共编码１０个蛋白ꎮ先前的研究表明ꎬ马铃薯Ｙ病毒组多种病毒编码的保守蛋白Ｐ３具有多种功能ꎬ在病毒复制㊁致病性㊁克服宿主抗性㊁细胞间移动等方面均具有重要作用ꎬ而Ｐ３在大麦黄花叶病毒属中是否有类似功能目前还未见报道ꎮ本研究利用烟草脆裂病毒(ＴｏｂａｃｃｏｒａｔｔｌｅｖｉｒｕｓꎬＴＲＶ)介导的本氏烟基因沉默系统ꎬ明确了ＷＹＭＶ的Ｐ３碳端在本氏烟上具有致病功能域Ｐ３￣Ｃꎬ但完整的Ｐ３则不具有致病能力ꎮ进一步移码突变研究表明ꎬＰ３￣Ｃ的致病性是由其编码的多肽引起的ꎬ而非病毒来源的小干扰ＲＮＡ介导的宿主基因沉默ꎮ同时Ｐ３￣Ｃ的两个跨膜结构域对致病性具有重要作用ꎬ单独表达任何一个跨膜结构域Ｐ３￣Ｃ均不能在本氏烟上引起明显症状ꎮ关键词:小麦黄花叶病毒ꎻＰ３蛋白ꎻ致病性ꎻ中图分类号:Ｓ４３５ １２文献标志码:Ａ文章编号:１００４￣１５２４(２０１９)０５￣０７７７￣０７Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｄｏｍａｉｎｏｆＰ３ｐｒｏｔｅｉｎｏｆｗｈｅａｔｙｅｌｌｏｗｍｏ￣ｓａｉｃｖｉｒｕｓＺＨＡＮＧＹａｎ１ꎬ２ꎬＱＩＹｕｈｕａ１ꎬ２ꎬＬＵＹａｎｈｕａ２ꎬＹＡＮＧＱｉａｎｋｕｎ２ꎬＨＥＹｕｊｕａｎ２ꎬＬＩＪｕｎｍｉｎ２ꎬ３ꎬＣＨＥＮＪｉａｎｐｉｎｇ１ꎬ２ꎬ３ꎬ∗(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＦｕｚｈｏｕ３５０００２ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙＢｒｅｅｄｉｎｇＢａｓｅｆｏｒＺｈｅｊｉａｎｇＳｕｓｔａｉｎａｂｌｅＰｅｓｔａｎｄＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌꎬＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ/ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＺｈｅｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＨａｎｇｚｈｏｕ３１００２１ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＶｉｒｏｌｏｇｙꎬＮｉｎｇｂｏＵｎｉｖｅｒ￣ｓｉｔｙꎬＮｉｎｇｂｏ３１５２１１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｗｈｅａｔｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ(ＷＹＭＶ)ｂｅｌｏｎｇｓｔｏｔｈｅｇｅｎｕｓＢｙｍｏｖｉｒｕｓꎬｆａｍｉｌｙＰｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ.Ｉｔｓｇｅｎｏｍｅｃｏｎｓｉｓｔｓｏｆｔｗｏｓｅｎｓｅｓｉｎｇｌｅ￣ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｓｅｎｃｏｄｉｎｇａｔｏｔａｌｏｆ１０ｐｒｏｔｅｉｎｓ.Ｐｒｅｖｉｏｕｓｓｔｕｄｉｅｓｈａｄｓｈｏｗｎｔｈａｔｔｈｅｃｏｎ￣ｓｅｒｖｅｄｐｒｏｔｅｉｎＰ３ｅｎｃｏｄｅｄｂｙｐｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓｈａｄｍｕｌｔｉｐｌｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｖｉｒａｌｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎꎬｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙꎬｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇｈｏｓｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅꎬａｎｄｃｅｌｌ￣ｔｏ￣ｃｅｌｌｍｏｖｅｍｅｎｔ.ＨｏｗｅｖｅｒꎬｗｈｅｔｈｅｒＰ３ｈａｄｓｉｍｉｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｂｙｍｏｖｉｒｕｓｈａｄｎｅｖｅｒｂｅｅｎｒｅｐｏｒｔｅｄｙｅｔ.Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｏｂａｃｃｏｒａｔｔｌｅｖｉｒｕｓ(ＴＲＶ)￣ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｓｙｓｔｅｍｉｎＮｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａｗａｓｕｓｅｄｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＷＹＭＶＰ３.ＯｕｒｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＣｔｅｒｍｉｎａｌｏｆＷＹＭＶＰ３(Ｐ３￣Ｃ)ꎬｂｕｔｎｏｔｔｈｅｗｈｏｌｅＰ３ꎬｈａｄａｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ￣ｒｅｌａｔｅｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｏｍａｉｎｉｎＮ.ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ.ＦｕｒｔｈｅｒｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｍｕｔａｔｉｏｎｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔꎬｒａｔｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｖｉｒａｌｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｈｏｓｔｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇꎬｔｈｅｐａｔｈｏｇｅ￣ｎｉｃｉｔｙｗａｓｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｏｆＰ３￣Ｃ.ＩｎａｄｄｉｔｉｏｎꎬｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｎＮ.ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａｄｉｓａｐｐｅａｒｅｄｗｈｅｎａｎｙｏｆｔｈｅｔｗｏｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｉｎＰ３￣Ｃｗｅｒｅｍｕｔａｔｅｄꎬｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｏｆｔｈｅｔｒａｎｓ￣ｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓｉｎＰ３￣Ｃｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｗｈｅａｔｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ(ＷＹＭＶ)ꎻｐｒｏｔｅｉｎＰ３ꎻｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ㊀㊀我国土传小麦黄花叶病的病原主要为马铃薯Ｙ病毒科(Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ)大麦黄花叶病毒属(Ｂｙ￣ｍｏｖｉｒｕｓ)的小麦黄花叶病毒(ＷｈｅａｔｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＷＹＭＶ)[１]ꎮＷＹＭＶ由土壤中的禾谷多黏菌(Ｐｏｌｙｍｙｘａｇｒａｍｉｎｉｓ)传播ꎬ广泛分布于我国安徽㊁河南㊁江苏㊁湖北㊁陕西㊁四川和山东等冬小麦区[２]ꎮ由于我国的ＷＹＭＶ和国外发现报道的另一种同属的小麦梭条斑花叶病毒(ＷｈｅａｔｓｐｉｎｄｌｅｓｔｒｅａｋｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＷＳＳＭＶ)十分相似ꎬ之前在日本㊁印度和中国被认为是引起小麦黄花叶病害的第二个病毒[３－５]ꎮ１９９４年Ｓｏｈｎ等[６]报道了ＷＳＳＭＶ法国分离物ＲＮＡ１３ 端４ｋｂ序列ꎬ１９９５年于嘉林等[７]报道了一个中国河南分离物ＲＮＡ１３ 末端的８９１个核苷酸序列ꎬ发现与法国分离物仅有６９ ９％的序列同源性ꎮ随后ꎬ１９９８年Ｎａｍｂａ等[８]报道了日本ＷＹＭＶ基因组全长序列ꎬ与法国分离物相比ꎬ也仅有６９ ８％的同源性ꎬ从而表明它们是不同的病毒ꎬ在我国和日本造成小麦黄花叶病的大麦黄花叶病毒属病毒为ＷＹＭＶꎮＷＹＭＶ在小麦苗期侵染但不显症ꎬ通常在２月中下旬当气温升到６ħ左右时开始出现症状ꎬ３月中下旬为发生盛期ꎮ气温升至１５ħ以上时出现隐症ꎬ２０ħ以上病情会停止发展ꎬ但发病对产量造成的损失仍然存在ꎬ严重影响我国冬麦区小麦的安全生产[２]ꎮＷＹＭＶ由ＲＮＡ１和ＲＮＡ２两条正义单链线性ＲＮＡ组成ꎮＲＮＡ１全长７６３５个核苷酸ꎬ只包含一个编码２６９ｋｕ的多聚蛋白开放阅读框(ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅꎬＯＲＦ)ꎬ经蛋白酶切割后形成８个成熟的蛋白ꎬ分别简称为Ｐ３㊁７Ｋ㊁ＣＩ㊁１４Ｋ㊁ＶＰｇ㊁ＮＩａ㊁ＮＩｂ以及ＣＰ[９]ꎮ此外ꎬ在Ｐ３中还可以通过＋２移码产生ＰＩＰＯ蛋白ꎮＲＮＡ１的５ 和３ 末端非编码区分别为１６２和２５８个核苷酸ꎮＲＮＡ２全长３６５０个核苷酸ꎬ整个基因组也仅有一个ＯＲＦꎬ编码一个约１００ｋｕ的多聚蛋白ꎬ通过切割产生２个成熟的非结构蛋白Ｐ１和Ｐ２ꎮＲＮＡ２的５ ＵＴＲ和３ ＵＴＲ分别为１７１和７６７个核苷酸[２]ꎮＰ３氨基酸序列在马铃薯Ｙ病毒科中具有较高保守性ꎬ研究表明ꎬＰ３蛋白在病毒复制[１０]㊁致病性[１１－１２]㊁克服宿主抗性[１３]㊁细胞间移动[１４－１５]等方面均具有重要作用ꎮ利用野生型的马铃薯Ｙ病毒属(Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ)的芜菁花叶病毒(Ｔｕｒｎｉｐｍｏ￣ｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＴｕＭＶ)分离物Ｔｕ￣３和Ｔｕ￣２Ｒ１构建侵染性克隆ꎬ实验结果表明ꎬ交换分离物的Ｐ３部分序列后对两种病毒在甘蓝和萝卜上的症状产生显著影响ꎬ表明Ｐ３对ＴｕＭＶ在宿主植物上的致病性具有明显影响[１６]ꎮ同时ꎬ研究表明Ｐ３碳端(Ｐ３￣Ｃ)对马铃薯Ｙ病毒属的内质网(ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｍꎬＥＲ)定位和致病性有决定性作用ꎮ木瓜环斑病毒(ＰａｐａｙａｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓꎬＰＲＳＶ)的Ｐ３￣Ｃ末端具有ＥＲ定位信号ꎬ对Ｐ３的功能有重要作用[１７]ꎮ虽然Ｐ３在马铃薯Ｙ病毒属中的功能已有较多研究ꎬ但大麦黄花叶病毒属中的Ｐ３是否有类似功能目前还未见报道ꎮ本研究对ＷＹＭＶ的Ｐ３功能进行了初步研究ꎬ为进一步深入理解土传病毒的致病机理提供了新的信息ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料植物材料:感染ＷＹＭＶ的小麦样品于本实验室－８０ħ冰箱保存ꎬＲＴ￣ＰＣＲ检测确认带毒情况ꎻ野生型本氏烟于本实验室温室种植ꎬ将小苗移植于营养土ʒ珍珠岩ʒ蛭石(体积比)为３ʒ１ʒ１的土壤中ꎬ２４ħꎬ光照１６ｈ/黑暗８ｈ处理条件下培育ꎮ菌株与载体:大肠埃希菌感受态(ＤＨ５α)购于南京百思禾生物科技有限公司ꎻ农杆菌感受态(ＧＶ３１０１)购于上海唯地生物技术有限公司ꎻ烟草脆裂病毒侵染性克隆载体为本实验室保存８７７ 浙江农业学报㊀第３１卷㊀第５期菌株ꎮ１.２㊀试剂琼脂糖购于翊圣生物公司ꎻＫＯＤＦＸＮｅｏ高保真扩增酶和Ｌｉｇａｔｉｏｎｖｅｒｓｉｏｎ.２购于ＴＯＹＯＢＯ公司ꎻＴｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ和Ｔｈ￣ｅｒｎｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＦａｓｔＤｉｇｅｓｔＰｓｔⅠ购于ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司ꎻＲＮＡ提取试剂:Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒购于赛默飞生物公司ꎬ氯仿购于上海凌风化学试剂有限公司ꎻｃＤ￣ＮＡ逆转录试剂盒购自天根生物公司ꎻＲＴ￣ｑＰＣＲ试剂ＣｈａｍＱＴＭＳＹＢＲ®ｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ购于诺唯赞生物公司ꎻＤＮＡＭａｒｋｅｒ㊁ＲＮＡＦｒｅｅＨ２Ｏ㊁ＴＡＥ缓冲液等购自上海生工生物公司ꎻ乙醇等其他试剂均为国药集团化学试剂有限公司产品ꎮ１.３㊀ＷＹＭＶＰ３蛋白相关基因克隆从ＮＣＢＩ下载ＷＹＭＶＰ３基因序列(ＮＣＢＩ登录号ＡＪ１３１９８２ １)ꎬ根据ＤＮＡＭＡＮ软件预测Ｐ３基因的跨膜结构域(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ＴＭＨＭＭ/)ꎬ分别设计Ｐ３和Ｐ３碳端(Ｐ３￣Ｃꎬ位于Ｐ３的７１２￣９８１个核苷酸)㊁Ｐ３￣Ｃ缺失单个跨膜结构域(Ｐ３￣Ｃ￣ｄＮ㊁Ｐ３￣Ｃ￣ｄＣ)的上下游引物ꎬ下划线为ＰｓｔⅠ识别位点(表１)ꎮ以Ｔｒｉｚｏｌ法(具体方法参照Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ＲＮＡ提取试剂盒说明)提取ＷＹＭＶ侵染的小麦叶片ＲＮＡꎬ通过ＲＴ￣ＰＣＲ扩增出Ｐ３以及Ｐ３￣Ｃ特异基因片段ꎬ割胶回收ＰＣＲ产物ꎮ１.４㊀ＴＲＶ载体构建将含有沉默载体的质粒按照总体积６０μＬ体系进行单酶切处理ꎬ其中含抽纯质粒３０μＬꎬＦａｓｔＧｒｅｅｎＢｕｆｆｅｒ６μＬꎬＰｓｔⅠ２μＬꎬ其余用ｄｄＨ２Ｏ补足ꎮ其中载体质粒经酶切３７ħ处理３０ｍｉｎ后ꎬ需加入去磷酸化酶ＴｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓ￣ｐｈａｔａｓｅ以防止其发生自连ꎬ３７ħ再处理３０ｍｉｎ后进行切胶回收备用ꎮ表达载体总体积１５ ０μＬꎬ含单酶切目的基因产物６ ５μＬꎬ表达载体单酶切产物１ ０μＬꎬＬｉｇａｔｉｏｎｖｅｒｓｉｏｎ.２７ ５μＬꎮ于１６ħ连接１２ｈꎬ将连接产物转化大肠埃希菌感受态细胞并涂布在含有卡纳霉素(Ｋａｎꎬ５０μｇｍＬ－１)抗性的平板上筛选阳性克隆ꎬ阳性克隆经ＰＣＲ鉴定后ꎬ将含有目的基因的菌液送往擎科生物公司进行ＤＮＡ测序ꎬ获得重组表达质粒ꎮ１.５㊀Ｐ３及Ｐ３￣Ｃ致病性分析将测序成功质粒(Ｐ３㊁Ｐ３￣Ｃ㊁Ｐ３￣Ｃ￣ｄＮ㊁Ｐ３￣Ｃ￣ｄＣ)使用电击法转化到农杆菌ＧＶ３１０１菌株ꎬ２ｄ后表１㊀引物列表Ｔａｂｌｅ１㊀Ｌｉｓｔｏｆｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｓｔｕｄｙ引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ(５ ң３ )扩增基因ＡｍｉｐｉｆｉｃａｔｉｏｎＴＲＶ￣ＷＹＭＶ￣Ｐ３￣ＦＣＴＧＣＡＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＣＡＧＣＡＧＣＣ扩增Ｐ３基因序列ＴＲＶ￣ＷＹＭＶ￣Ｐ３￣ＲＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＧＧＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰ３ｇｅｎｅＴＲＶ￣ＷＹＭＶ￣Ｐ３￣Ｃ(７１２)￣ＦＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＧＴＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＡＴＴ与ＴＲＶ￣ＷＹＭＶ￣Ｐ３￣Ｒ扩增Ｐ３￣Ｃ序列ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰ３￣ＣｗｉｔｈｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒＴＲＶ￣ＷＹＭＶ￣Ｐ３￣ＲＴＲＶ￣ＷＹＭＶ￣Ｐ３￣Ｃ(７１２)￣ＦＭ￣Ｆ:ＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＧＴＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＴＣＴＴ扩增Ｐ３￣Ｃ移码突变序列ＴＲＶ￣ＷＹＭＶ￣Ｐ３￣Ｃ(７１２)￣ＦＭ￣ＲＣＴＧＣＡＧＧＴＴＧＧＡＧＡＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＧＧＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰ３￣ＣｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｍｕｔａｎｔＴＲＶ￣Ｐ３￣Ｃ￣ｄＮ￣ＦＣＴＧＣＡＧＣＡＣＴＣＣＡＴＣＴＡＴＴＴＴ与ＴＲＶ￣ＷＹＭＶ￣Ｐ３￣Ｒ扩增Ｐ３￣Ｃ氨基端缺失跨膜结构域序列ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰ３￣ＣＮ￣ｄｅｌｅｔｉｏｎｔｒａｎｓｍｅｍ￣ｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｗｉｔｈｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒＴＲＶ￣ＷＹＭＶ￣Ｐ３￣ＲＴＲＶ￣Ｐ３￣Ｃ￣ｄＣ￣ＲＣＴＧＣＡＧＴＴＴＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡ与ＴＲＶ￣ＷＹＭＶ￣Ｐ３￣Ｃ(７１２)￣Ｆ扩增Ｐ３￣Ｃ羧基端缺失跨膜结构域序列ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰ３￣ＣＣ￣ｄｅｌｅｔｉｏｎｔｒａｎｓｍｅｍ￣ｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｗｉｔｈｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒＴＲＶ￣ＷＹＭＶ￣Ｐ３￣Ｃ(７１２)￣ＦＰ３为完整蛋白ꎬＰ３￣Ｃ为Ｐ３的７１２￣９８１个核苷酸ꎬＰ３￣Ｃ￣ｄＮ和Ｐ３￣Ｃ￣ｄＣ分别为Ｐ３￣Ｃ缺失Ｎ段的跨膜结构域和缺失Ｃ端的跨膜结构域片段ꎮＰ３ｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｐｒｏｔｅｉｎꎻＰ３￣Ｃｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｒｅｇｉｏｎｏｆ７１２￣９８１ｏｆＰ３ꎻＰ３￣Ｃ￣ｄＮｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｏｆＰ３￣ＣｗｉｔｈＮ￣ｔｅｒ￣ｍｉｎａｌｄｅｌｅｔｉｏｎꎻＰ３￣Ｃ￣ｄＣｗｅｒｅｔｈｅｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｏｆＰ３￣ＣｗｉｔｈＣ￣ｔｅｒｍｉｎａｌｄｅｌｅｔｉｏｎ.９７７ 张岩ꎬ等.小麦黄花叶病毒Ｐ３蛋白致病功能域的鉴定和分析经菌落ＰＣＲ鉴定成功后挑取单菌落摇菌ꎬ集菌后用缓冲液(１０ｍｍｏｌ Ｌ－１ｐＨ５ ８的ＭＥＳ㊁１０ｍｍｏｌ Ｌ－１ＭｇＣｌ２和２００μｍｏｌ Ｌ－１乙酰丁香酮)重悬农杆菌沉淀ꎬ２８ħ静置２ｈ注射９或１０叶期的本氏烟ꎮ注射后持续观察烟草症状表现ꎮ１.６㊀Ｐ３￣Ｃ移码突变将ＷＹＭＶＰ３￣Ｃ肽段中第一个翻译起始密码子ＡＴＧ之后的第一个碱基进行缺失突变ꎬ使后续的氨基酸发生移码突变ꎮ利用移码突变后的Ｐ３￣Ｃ基因序列构建ＴＲＶ重组载体ꎬ经农杆菌浸润后ꎬ持续观察本氏烟的症状ꎮ１.７㊀Ｐ３￣Ｃ跨膜结构域突变为了研究Ｐ３￣Ｃ两个跨膜结构域(ＴＭＤ１和ＴＭＤ２)对Ｐ３￣Ｃ功能的重要性ꎬ我们将ＴＭＤ１和ＴＭＤ２中的重要氨基酸用脯氨酸替代ꎬ从而破坏跨膜结构域的功能ꎮ突变被设计为减少ＴＭＤ的疏水性ꎬ将ＴＭＤ１中的２个亮氨酸以及一个酪氨酸(ＬＬＹ)ꎬＴＭＤ２中异亮氨酸ꎬ酪氨酸ꎬ苯丙氨酸以及亮氨酸(ＩＹＦＬ)分别用连续的脯氨酸替代产生ｍＰ３￣Ｃ突变体ꎮ另外ꎬ我们同时设计了分别缺失ＴＭＤ１和ＴＭＤ２的２个突变体ꎬ命名为Ｐ３￣Ｃ￣ｄＮ和Ｐ３￣Ｃ￣ｄＣꎮ利用突变后的基因序列分别构建ＴＲＶ重组载体ꎬ经农杆菌浸润后ꎬ持续观察本氏烟的症状ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＷＹＭＶＰ３及Ｐ３￣Ｃ基因克隆与序列分析为获取Ｐ３及Ｐ３￣Ｃ目的片段ꎬ从ＷＹＭＶ侵染的小麦叶片中提取总ＲＮＡꎬＲＴ￣ＰＣＲ扩增得到了ＷＹＭＶＰ３(ＴＲＶ￣ＷＹＭＶ￣Ｐ３￣Ｆ/Ｒ)及Ｐ３￣Ｃ(ＴＲＶ￣ＷＹＭＶ￣Ｐ３￣Ｃ(７１２)￣Ｆ/Ｐ３￣Ｒ)ｃＤＮＡ片段(图１￣Ａ)ꎬ割胶回收ＰＣＲ产物并将其分别构建到ＰｓｔⅠ酶切的ＴＲＶ载体上ꎬＰＣＲ检测并挑取阳性克隆送测ꎮ测序结果表明ꎬＰ３基因全长由９８１个核苷酸组成ꎬ共编码３２７个氨基酸ꎬＰ３￣Ｃ核苷酸长度为２７０ꎬ编码９０个氨基酸ꎮ通过ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ同源比对明确了扩增的确实为ＷＹＭＶＰ３序列ꎮ经ＤＮＡＭＡＮ蛋白质跨膜结构域分析发现ꎬＰ３编码的蛋白氨基酸含有多个疏水性区域ꎬ且含有３个跨膜结构域ꎬＰ３￣Ｃ(７１２￣９８１)含有两个跨膜结构域(图１￣Ｂ)ꎮ２.２㊀ＷＹＭＶＰ３￣Ｃ在本氏烟上具有致病效应将Ｐ３及Ｐ３￣Ｃ成功构建到ＴＲＶ载体后ꎬ与ＴＲＶ￣ＲＮＡ１农杆菌共浸润本氏烟植株ꎮ结果表明ꎬ农杆菌浸润５ｄ后ꎬ与对照组相比ꎬＴＲＶ￣Ｐ３￣Ｃ在浸润烟草２ｄ时(图２￣Ａ㊁Ｄ)ꎬ接种叶即开始出现萎蔫失水ꎬ接种后４ｄ接种叶片坏死且紧挨接种叶的茎部开始萎蔫坏死(图２￣Ｂ㊁Ｅ)ꎬ接种５ｄ整个茎部进入失水萎蔫坏死状态ꎬ植株已无法正常生长发育ꎬ直至整株植物死亡(图２￣Ｆ)ꎮ有意思的是ꎬ构建的Ｐ３全长载体ＴＲＶ￣Ｐ３与对照组相比则没有明显表型差异ꎬ均未引起本氏烟致病表型(图２￣Ｃ)ꎮ２.３㊀Ｐ３￣Ｃ的致病有效因子为多肽由于Ｐ３￣Ｃ致病性可能由病毒来源的小干扰ＲＮＡ或病毒编码的多肽引起ꎬ为进一步明确Ｐ３￣Ｃ致病性是否由Ｐ３￣Ｃ编码的氨基酸引起ꎬ我们将ＭꎬＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ泳道１ꎬＷＹＭＶＰ３ꎻ泳道２ꎬＷＹＭＶＰ３￣ＣꎮＭꎬＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻＬａｎｅ１ꎬＷＹＭＶＰ３ꎻＬａｎｅ２ꎬＷＹＭＶＰ３￣Ｃ.图１㊀ＲＴ￣ＰＣＲ扩增结果(Ａ)及Ｐ３编码的氨基酸序列分析和跨膜结构域预测(Ｂ)Ｆｉｇ.１㊀ＲＴ￣ＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓ(Ａ)ａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰ３ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｉｔｓｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓ(Ｂ) ０８７ 浙江农业学报㊀第３１卷㊀第５期Ａ￣ＢꎬＴＲＶ￣ＧＵＳ分别侵染烟草２和５ｄ症状图ꎬ作为阴性对照ꎻＣꎬＴＲＶ￣Ｐ３症状图ꎻＤ￣ＦꎬＴＲＶ￣Ｐ３￣Ｃ分别侵染烟草２㊁４和５ｄ症状图ꎮＡ￣ＢꎬＳｙｍｐｔｏｍｓｏｆＮ.ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａｉｎｄｕｃｅｄｂｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＵＳｇｅｎｅ(ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ)ｆｏｒｔｗｏａｎｄｆｉｖｅｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎꎻＣꎬＳｙｍｐｔｏｍｓｏｆＴＲＶ￣Ｐ３ꎻＤ￣ＦꎬＳｙｍｐｔｏｍｓｏｆＮ.ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａｉｎｄｕｃｅｄｂｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰ３￣Ｃｆｏｒｔｗｏꎬｆｏｕｒａｎｄｆｉｖｅｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎ.图２㊀ＴＲＶ分别表达ＷＹＭＶＰ３和Ｐ３￣Ｃ在本氏烟上引起的症状Ｆｉｇ.２㊀ＳｙｍｐｔｏｍｓｏｆＮ.ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａｉｎｄｕｃｅｄｂｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＷＹＭＶＰ３ａｎｄＰ３￣ＣｉｎａＴＲＶｖｅｃｔｏｒＰ３￣Ｃ进行移码突变ꎬ并命名为Ｐ３￣Ｃ￣ＦＭ(图３￣Ａ)ꎮ通过农杆菌侵染本氏烟５ｄ后观察症状ꎬ结果表明移码突变后的Ｐ３￣Ｃ(即Ｐ３￣Ｃ￣ＦＭ)和对照症状类似ꎬ无法在本氏烟上引起Ｐ３￣Ｃ的萎蔫坏死表型(图３￣Ｄ)ꎬ表明Ｐ３￣Ｃ的致病性确实是由其编码的氨基酸引起的ꎮ２.４㊀跨膜结构域对ＷＹＭＶＰ３￣Ｃ的致病性具有重要作用为研究Ｐ３￣Ｃ两个跨膜结构域(ＴＭＤ１和ＴＭＤ２)对Ｐ３￣Ｃ功能的重要性ꎬ我们将Ｐ３￣Ｃ中两个跨膜结构域中疏水性氨基酸用脯氨酸替代ꎬ重新构建ＴＲＶ￣ｍＰ３￣Ｃ重组载体(图４￣Ａ)ꎮ同时ꎬ我们还将两个跨膜结构域分别单独缺失ꎬ构建突变体ＴＲＶ￣Ｐ３￣Ｃ￣ｄＮ和ＴＲＶ￣Ｐ３￣Ｃ￣ｄＣ(图４￣Ａ)ꎮ农杆菌浸润后持续观察本氏烟上引起的症状ꎬ结果表明ꎬ浸润５ｄ后无论是ＴＲＶ￣ｍＰ３￣Ｃ还是ＴＲＶ￣Ｐ３￣Ｃ￣ｄＮ/ＴＲＶ￣Ｐ３￣Ｃ￣ｄＣ均和对照类似ꎬ无明显症状ꎬ不具备致病性(图４￣Ｂ)ꎬ表明这两个跨膜结构域对ＷＹＭＶＰ３￣Ｃ的致病性均有十分重要的作用ꎮ３㊀讨论植物病毒编码的复制酶㊁运动蛋白㊁外壳蛋白等均有可能是病毒的致病因子ꎬ多种植物病毒中曾报道过复制酶导致的寄主致病性[１８]ꎮ同时有研究表明ꎬ寄主ＲＮＡ干扰产生的病毒来源的小干扰ＲＮＡ除剪切病毒自身基因组外ꎬ也可能靶ＡꎬＰ３￣Ｃ移码突变示意图ꎻＢꎬＴＲＶ￣ＧＵＳ为阴性对照ꎻＣꎬＴＲＶ￣Ｐ３￣Ｃ为阳性对照ꎻＤꎬＴＲＶ￣Ｐ３￣Ｃ移码突变(ＴＲＶ￣Ｐ３￣Ｃ￣ＦＭ)症状图ꎮＡꎬＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆＰ３￣ＣｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｍｕｔａｔｉｏｎꎻＢꎬＴＲＶ￣ＧＵＳｗａｓｕｓｅｄａｓａｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌꎻＣꎬＴＲＶ￣Ｐ３￣Ｃｗａｓｕｓｅｄａｓａｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎ￣ｔｒｏｌꎻＤꎬＴＲＶ￣Ｐ３￣Ｃｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｍｕｔａｔｉｏｎ(ＴＲＶ￣Ｐ３￣Ｃ￣ＦＭ)ｓｙｍｐｔｏｍ.图３㊀移码突变示意图及烟草症状图Ｆｉｇ.３㊀ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｍｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄｔｈｅｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆｉｎｆｅｃｔｅｄＮ.ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ１８７ 张岩ꎬ等.小麦黄花叶病毒Ｐ３蛋白致病功能域的鉴定和分析ＡꎬＰ３￣Ｃ跨膜结构域突变示意图ꎻＢꎬＴＲＶ￣ＧＵＳ为阴性对照ꎻＣꎬＴＲＶ￣Ｐ３￣Ｃ为阳性对照ꎻＤ㊁ＦꎬＰ３￣Ｃ跨膜结构域突变症状图ꎮＡꎬＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆＰ３￣ＣｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｍｕｔａｔｉｏｎꎻＢꎬＴＲＶ￣ＧＵＳｗａｓｕｓｅｄａｓａｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌꎻＣꎬＴＲＶ￣Ｐ３￣ＣｗａｓｕｓｅｄａｓａｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌꎻＤ－ＦꎬＰ３￣Ｃｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｍｕｔａｔｉｏｎｓｙｍｐｔｏｍ.图４㊀跨膜结构域突变示意图及烟草症状图Ｆｉｇ.４㊀ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｍｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄｔｈｅｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆＮ.ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ向寄主内源性靶标并对其进行转录后水平调控ꎬ导致寄主症状的产生[１９－２０]ꎮ由于ＷＹＭＶ在小麦上的研究缺乏反向遗传学工具ꎬ同时禾谷多黏菌传毒体系在室内建立较困难ꎬ因此目前ＷＹＭＶ的相关研究进展较慢ꎮ本研究利用ＴＲＶ介导的本氏烟基因沉默系统ꎬ明确了ＷＹＭＶ的Ｐ３碳端在本氏烟上具有致病相关功能域Ｐ３￣Ｃꎬ且其致病性是由多肽引起的ꎬ同时其两个跨膜结构域对致病性具有重要作用ꎬ有助于后续对ＷＹＭＶ致病机理的深入研究ꎮ本研究发现ꎬＰ３￣Ｃ在本氏烟上有致病活性ꎬ而完整Ｐ３蛋白则不具备ꎬ推测是由于Ｐ３￣Ｃ比Ｐ３缺少一个跨膜结构域ꎬＰ３￣Ｎ端的区域在结构上可能会掩盖Ｐ３￣Ｃ端的致病能力ꎬ这一推测还有待进一步实验验证ꎮ先前研究表明ꎬＰ３氨基酸序列在马铃薯Ｙ病毒属中具有较高保守性ꎬＰ３氨基酸序列在ＷＹＭＶ不同分离物中也具有很高保守性(未发表数据)ꎬ这可能和Ｐ３在病毒侵染过程中具有多种重要功能有一定关系ꎮ已有研究表明ꎬＰ３蛋白除了对宿主具有致病性外ꎬ其在病毒的复制[１０]ꎬ克服宿主抗性[１１－１２]ꎬ细胞间移动[１４－１５]等方面均有重要功能ꎮ与ＷＹＭＶ同一家族中的不同病毒相比ꎬ不同病毒编码的Ｐ３在寄主内的亚细胞定位有所不同ꎮ如烟草叶脉斑点病毒(ＴｏｂａｃｃｏｖｅｉｎｍｏｔｔｌｉｎｇｖｉｒｕｓꎬＴＶＭＶ)的Ｐ３蛋白与ＣＩ蛋白在寄主的细胞质中发生相互互作[２１]ꎬ而烟草蚀纹病毒(ＴｏｂａｃｃｏｅｔｃｈｖｉｒｕｓꎬＴＥＶ)的Ｐ３蛋白则在细胞核内与病毒编码的ＮＩｂ和ＮＩａ蛋白发生互作[２２]ꎮ这些现象表明ꎬ不同病毒的Ｐ３蛋白可能在寄主中发挥不同功能ꎬ而ＷＹＭＶ病毒Ｐ３蛋白在寄主内的亚细胞定位情况及发挥的生物学功能还有待进一步的探索研究ꎮ参考文献(Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ):[１]㊀向荣ꎬ孙丽英ꎬ孙炳剑ꎬ等.小麦黄花叶病毒Ｐ１蛋白原核表达㊁抗血清制备及其检测[Ｊ].浙江农业学报ꎬ２０１１ꎬ２３(２):３２４－３２８.ＸＩＡＮＧＲꎬＳＵＮＬＹꎬＳＵＮＢＪꎬｅｔａｌ.ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＰ１ｐｒｏｔｅｉｎｅｎｃｏｄｅｄｂｙＷｈｅａｔｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＲＮＡ２ꎬｕｓｉｎｇｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｒａｉｓｅｄａｇａｉｎｓｔｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰ１ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ[Ｊ].ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＺｈｅｊｉａｎｇｅｎｓｉｓꎬ２０１１ꎬ２３(２):３２４－３２８.(ｉｎＣｈｉｎｅｓｅｗｉｔｈＥｎｇｌｉｓｈａｂｓｔｒａｃｔ)[２]㊀陈剑平ꎬ阮义理ꎬ董玛佳.我国一些地区发生的小麦土传病毒病的病原研究[Ｊ].病毒学杂志ꎬ１９８９ꎬ４(２):１７６－１８１.㊀２８７ 浙江农业学报㊀第３１卷㊀第５期ＣＨＥＮＪＰꎬＲＵＡＮＹＬꎬＤＯＮＧＭＪ.Ｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｏｆａｗｈｅａｔｓｏｉｌ￣ｂｏｒｎｅｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＶｉｒｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉ￣ｃａꎬ１９８９ꎬ４(２):１７６－１８１.(ｉｎＣｈｉｎｅｓｅｗｉｔｈＥｎｇｌｉｓｈａｂ￣ｓｔｒａｃｔ)[３]㊀ＩＮＯＵＹＥＴ.Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｐａｒｔｉｃｌｅｓａｓｔｈｅｃａｕｓａｌａｇｅｎｔｏｆｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｄｉｓｅａｓｅｏｆｗｈｅａｔ[Ｊ].ＮｏｇａｋｕＫｅｎｋｙｕꎬ１９６９ꎬ５３:６１－６８.[４]㊀ＨＯＬＴＺＹꎬＢＯＮＮＥＦＯＹＭꎬＶＩＡＤＥＲＶꎬｅｔａｌ.Ｅｐｉｓｔａｔｉｃｄｅ￣ｔｅｒｍｉｎｉｓｍｏｆｄｕｒｕｍｗｈｅａｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｔｈｅｗｈｅａｔｓｐｉｎｄｌｅｓｔｒｅａｋｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ[Ｊ].ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１７ꎬ１３０(７):１４９１－１５０５.[５]㊀ＣＨＥＮＪＰ.ＯｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｆｕｎｇａｌｌｙｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｗｈｅａｔｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｅｓｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＡｎｎａｌｓｏｆＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｌｏｇｙꎬ１９９３ꎬ１２３(１):５５－６１.[６]㊀ＳＯＨＮＡꎬＳＣＨＥＮＫＰꎬＳＩＧＮＯＲＥＴＰＡꎬｅｔａｌ.Ｓｅｑｕｅｎｃｅａ￣ｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅ３ᶄ￣ｔｅｒｍｉｎａｌｈａｌｆｏｆＲＮＡ１ｏｆｗｈｅａｔｓｐｉｎｄｌｅｓｔｒｅａｋｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ[Ｊ].ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ１９９４ꎬ１３５(３/４):２７９－２９２.㊀[７]㊀于嘉林ꎬ晏立英ꎬ冯继东ꎬ等.一种中国发生的真菌传小麦花叶病毒ＲＮＡ￣１３ 末端核苷酸序列分析[Ｊ].病毒学报ꎬ１９９５ꎬ１１(３):２４８－２５４.ＹＵＪＬꎬＹＡＮＬＹꎬＦＥＮＧＪＤꎬｅｔａｌ.Ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅ３ᶄ￣ｔｅｒｍｉｎａｌｏｆｆｕｎｇｕｓ￣ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｗｈｅａｔｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｒｎａ￣１ｉｓｏｌａｔｅｄｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ１９９５ꎬ１１(３):２４８－２５４.(ｉｎＣｈｉｎｅｓｅｗｉｔｈＥｎｇｌｉｓｈａｂｓｔｒａｃｔ) [８]㊀ＮＡＭＢＡＳꎬＫＡＳＨＩＷＡＺＡＫＩＳꎬＬＵＸꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｕｃｌｅ￣ｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｗｈｅａｔｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｂｙｍｏｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｉｃＲＮＡｓ[Ｊ].ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ１９９８ꎬ１４３(４):６３１－６４３. [９]㊀ＣＨＥＮＪꎬＣＨＥＮＪＰꎬＹＡＮＧＪＰꎬｅｔａｌ.ＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｃｕｌｔｉｖａｒｒｅｓｐｏｎｓｅａｎｄｃｏｍｐｌｅｔｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｗｏｉｓｏｌａｔｅｓｏｆｗｈｅａｔｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｂｙｍｏｖｉｒｕｓｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏ￣ｇｙꎬ２０００ꎬ４９(３):３７０－３７４.[１０]㊀ＭＥＲＩＴＳＡꎬＧＵＯＤＹꎬＪÄＲＶＥＫÜＬＧＬꎬｅｔａｌ.ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎｐｏｔａｔｏＡｐｏｔｙ￣ｖｉｒｕｓ￣ｅｎｃｏｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓＰ１ａｎｄＰ３ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｔｈｅｐｕｔａｔｉｖｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘ[Ｊ].Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ１９９９ꎬ２６３(１):１５－２２. [１１]㊀ＣＨＵＭＨꎬＬＯＰＥＺ￣ＭＯＹＡＪＪꎬＬＬＡＶＥ￣ＣＯＲＲＥＡＳＣꎬｅｔａｌ.Ｔｗｏｓｅｐａｒａｔｅｒｅｇｉｏｎｓｉｎｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆｔｈｅｔｏｂａｃｃｏｅｔｃｈｖｉｒｕｓｃｏｎｔａｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓｏｆｔｈｅｗｉｌｔｉｎｇｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆｔａｂａｓｃｏｐｅｐｐｅｒ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔ￣ＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ１９９７ꎬ１０(４):４７２－４８０.[１２]㊀ＳÁＥＮＺＰꎬＲＩＥＣＨＭＡＮＮＪＬꎬＤＡＬＬＯＴＳꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎｏｆａｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｏｆＰｌｕｍｐｏｘｖｉｒｕｓｉｎｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅＣ￣ｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｇｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎＰ３＋６Ｋ１[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０００ꎬ８１(３):５５７－５６６. [１３]㊀ＨÄＭÄＬÄＩＮＥＮＪＨꎬＫＥＫＡＲＡＩＮＥＮＴꎬＧＥＢＨＡＲＤＴＣꎬｅｔａｌ.Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅａｎｄｄｏｍｉｎａｎｔｇｅｎｅｓｉｎｔｅｒｆｅｒｅｗｉｔｈｔｈｅｖａｓｃｕｌａｒｔｒａｎｓｐｏｒｔｏｆｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓａｉｎｄｉｐｌｏｉｄｐｏｔａｔｏｅｓ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔ￣ＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ２０００ꎬ１３(４):４０２－４１２. [１４]㊀ＤＡＬＬＯＴＳꎬＱＵＩＯＴ￣ＤＯＵＩＮＥＬꎬＳÁＥＮＺＰꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉ￣ｃａｔｉｏｎｏｆｐｌｕｍｐｏｘｖｉｒｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓｉｍｐｌｉｃａｔｅｄｉｎｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔＰｒｕｎｕｓｓｐｐ.[Ｊ].Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ２００１ꎬ９１(２):１５９－１６４.[１５]㊀ＪＯＨＡＮＳＥＮＩＥꎬＬＵＮＤＯＳꎬＨＪＵＬＳＡＧＥＲＣＫꎬｅｔａｌ.Ｒｅ￣ｃｅｓｓｉｖｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍａｎｄｐｏｔｙｖｉｒｕｓｐａｔｈｏｔｙｐｅｒｅｓｏｌｖｅｄｉｎａｇｅｎｅ￣ｆｏｒ￣ｃｉｓｔｒｏｎｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｈｏｓｔａｎｄｖｉｒｕｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２００１ꎬ７５(１４):６６０９－６６１４.㊀[１６]㊀ＳＵＥＨＩＲＯＮ.ＡｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｏｆｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆＴｕｒ￣ｎｉｐｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｔｏｉｎｆｅｃｔＢｒａｓｓｉｃａｓｐｐ.ａｎｄ/ｏｒＲａｐｈａｎｕｓｓａ￣ｔｉｖｕｓｉｓｉｎｉｔｓＰ３ｐｒｏｔｅｉｎ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２００４ꎬ８５(７):２０８７－２０９８.[１７]㊀ＥＩＡＭＴＡＮＡＳＡＴＥＳꎬＪＵＲＩＣＥＫＭꎬＹＡＰＹＫ.Ｃ￣ｔｅｒｍｉｎａｌｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｒｅｇｉｏｎｌｅａｄｓＰＲＳＶＰ３ｐｒｏｔｅｉｎｔｏｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅ￣ｔｉｃｕｌｕｍ[Ｊ].ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓꎬ２００７ꎬ３５(３):６１１－６１７. [１８]㊀ＧＡＲＣÍＡＪＡꎬＰＡＬＬÁＳＶ.Ｖｉｒａｌｆａｃｔｏｒｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ１１:２１－３０.㊀[１９]㊀ＳＨＩＢＢꎬＬＩＮＬꎬＷＡＮＧＳＨꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｕ￣ｌａｔｉｏｎｏｆｈｏｓｔｇｅｎｅｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｒｉｃｅｓｔｒｉｐｅｖｉｒｕｓｓｙｍｐｔｏｍｐｒｏ￣ｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０１６ꎬ２０９(３):１１０６－１１１９. [２０]㊀ＳＭＩＴＨＮＡꎬＥＡＭＥＮＳＡＬꎬＷＡＮＧＭＢ.Ｖｉｒａｌｓｍａｌｌｉｎｔｅｒ￣ｆｅｒｉｎｇＲＮＡｓｔａｒｇｅｔｈｏｓｔｇｅｎｅｓｔｏｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｅａｓｅｓｙｍｐｔｏｍｓｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇｅｎｓꎬ２０１１ꎬ７(５):ｅ１００２０２２. [２１]㊀ＲＯＤＲＩＧＵＥＺ￣ＣＥＲＥＺＯＥꎬＡＭＭＡＲＥＤꎬＰＩＲＯＮＥＴＰꎬｅｔａｌ.Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎｏｎ￣ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌＰ３ｖｉｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｃｙ￣ｌｉｎｄｒｉｃａｌｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓｉｎｐｏｔｙｖｉｒｕｓ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ１９９３ꎬ７４(９):１９４５－１９４９.[２２]㊀ＬＡＮＧＥＮＢＥＲＧＷＧꎬＺＨＡＮＧＬＹ.ＩｍｍｕｎｏｃｙｔｏｌｏｇｙｓｈｏｗｓｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｔｏｂａｃｃｏｅｔｃｈｖｉｒｕｓＰ３ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｎｕｃｌｅａｒｉｎｃｌｕ￣ｓｉｏｎｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ１９９７ꎬ１１８(３):２４３－２４７.(责任编辑㊀张㊀韵)３８７张岩ꎬ等.小麦黄花叶病毒Ｐ３蛋白致病功能域的鉴定和分析。

中国小麦花叶病毒全基因组序列分析及CP、CRP蛋白的原核表达和抗血清制备中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)属于帚状病毒科(Virgaviridae)真菌传杆状病毒属(Furovirus),由禾谷多黏菌(Polymyxa gramins)传播。

其基因组为两条正单链RNA,包装在不同的粒子内。

CWMV在我国山东烟台、威海等地发生普遍,严重威胁小麦的产量和质量。

为了明确CWMV的进化规律和致病机理,本研究测定了CWMV烟台分离物与临沂分离物的全基因组序列,分析了CWMV的遗传进化特点,并利用原核表达的衣壳蛋白及富含半胱氨酸蛋白分别制备了特异性抗血清;同时,获得了CWMV RNA2的侵染性克隆载体。

本文的主要研究内容如下:1、扩增获得CWMV烟台与临沂分离物的全基因组序列。

经分析发现其RNA1为7 147 nt,RNA2分别为3 563 nt和3 564 nt,RNA1与RNA2均含有3个开放阅读框。

在利用RNA1、RNA2全基因及其ORF序列构建的系统进化树中,CWMV均分为两个组(I和II)。

烟台分离物RNA1、RNA2及其ORF均被聚类到I组,临沂分离物除CP外均聚类到II组,CP聚类到了I组。

我们通过RDP 4软件进行重组分析,发现CWMV临沂分离物RNA2的CP区域发生了重组。

2、利用原核表达的衣壳蛋白及富含半胱氨酸蛋白制备了特异性抗血清。

采用RT-PCR方法克隆CWMV烟台分离物的外壳蛋白及富含半胱氨酸蛋白基因,并将其连接到原核表达载体pEHISTEV,转化大肠杆菌Rosetta。

经IPTG诱导,产生了分子量均为19 kDa的CP和CRP。

将二者从凝胶中切下,经乳化后免疫新西兰大耳兔4次,获得了CWMV CP及CRP的多克隆抗体。

ELISA检测结果表明,CWMV CP和CRP抗血清的效价分别为1:4096和为1:2048。

Western Blot分析表明,该抗血清能与CWMV侵染的小麦发生特异性反应,而与健康小麦或小麦黄花叶病毒侵染的小麦均无反应。