蔗糖酶同工酶谱带鉴定

植物研究进展植物中蔗糖酶的研究进展司丽珍等:植物中蔗糖酶的研究进展植物中蔗糖酶的研究进展司丽珍①储成才②(中国科学院遗传与发育生物学研究所北京100101)摘要在大多数高等植物中, 蔗糖是碳水同化产物由源向库运输的主要形式。

在库中, 蔗糖酶可以把蔗糖水解为葡萄糖和果糖, 以满足植物生长发育中对碳源和能源的需求。

本文综述了近年来有关蔗糖酶的一些研究进展, 包括蔗糖酶的分类、基本性质、基因结构、酶活性的调节以及功能等。

关键词植物, 蔗糖酶, 活性调节, 功能称为胞外蔗糖酶。

不同的蔗糖酶进行反应所需的最0 引言植物在叶片中(源组织) 通过光合作用将C O 2固定成碳水化合物, 然后运向非光合组织(库组织) 。

植物大多以非还原性二糖如蔗糖的形式完成碳水同化产物由源到库的运输。

在库组织中, 蔗糖被分解为己糖, 为植物生长发育提供碳源和能源。

蔗糖分解主要由蔗糖合成酶(EC2. 4. 1. 13) 或蔗糖酶(E C3. 2. 1. 26) 来完成。

蔗糖合成酶是一糖基转移酶, 在尿苷二磷酸(UDP ) 存在下把蔗糖转化为尿苷二磷酸葡萄糖和果糖。

蔗糖酶是一水解酶, 把蔗糖水解为葡萄糖和果糖。

蔗糖酶有多种同工酶, 分别处于不同的亚细胞位置, 生化特性也不尽相同[1, 2]。

虽然对它们的功能特异性还不太清楚, 但已确知蔗糖酶在植物中主要参与对蔗糖不同利用途径的调节。

由于糖在植物中不仅是作为能源, 而且也是基因表达的重要调节物质之一, 因此蔗糖酶也间接参与细胞分化和植物发育的调控。

鉴于此, 蔗糖酶的研究无论在理论上还是在实际上都具有重要意义而备受重视。

本文就近年来有关研究进展做一介绍。

适pH 值也有所不同, 由此蔗糖酶又可分为酸性蔗糖酶和中性/碱性蔗糖酶。

液胞型蔗糖酶和细胞壁型蔗糖酶在pH 4. 5至5. 0时催化效率最高, 因此也称为酸性蔗糖酶。

细胞质型蔗糖酶水解蔗糖的最适pH 值为中性或略微偏碱性, 因此称为中性/碱性蔗糖酶。

对啤酒酵母的蔗糖酶的相关测试与研究兰德新（同组：李建鑫）浙江工业大学海洋学院食工1201摘要：目的学习测试与研究蔗糖酶的相关技术，以20克新鲜啤酒酵母菌为原料进行一系列实验。

方法蔗糖酶的提取及初步提纯，蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法，蔗糖酶活力的测定，Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算，微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮，SDS-PAGE测定蔗糖酶中蛋白质的相对分子质量。

结果通过这一阶段性的综合实验，学会了提取及初步提纯酶及胞内酶的提纯，酶活力的测定方法，蛋白质的测定方法和蛋白质相对分子质量的测定方法。

为我们将来的实验奠定了技术上的基础。

关键词：蔗糖酶，Q Sepharose-柱层析法，酶活力，Folin-酚法，微量凯氏定氮法，SDS-PAGE文献综述:蔗糖酶能催化水解蔗糖生成果糖和葡萄糖，果糖的甜度较高，约为蔗糖的1.36~1.60倍，在工业上具有较高的经济价值，葡萄糖也是我们的主要碳源，并且在植物中蔗糖酶分解的果糖和葡萄糖能为植物的生长和发育提供碳源和能源。

因此人们对蔗糖酶的研究越来越多，做了很多的实验来研究蔗糖酶的性质[2] , 其中在“蔗糖酶水解蔗糖的研究”这篇文章中，作者通过一系列对比实验，得出蔗糖酶的几个性质如下：蔗糖酶的活性达1.575×105u/ml；其表观Km（米氏常数）值约为0.015mol/1；初速度反应时间为0~10min；最适酶量为3.152×103~7.88×103 u/mmol；最适底物浓度为0.5mol/l；最适pH在NaAc-HAc体系中为4.4；最适反应温度为50℃。

而在植物体中，蔗糖酶也起到不可代替的作用。

在“蔗糖酶在植物中的生理作用”这篇文章中，作者主要介绍了蔗糖酶在植物体中的5个作用，分别是：1.参与叶片的光合作用 2. 参与贮藏器官碳水化合物组成中的作用 3. 参与细胞对胁迫的响应 4. 参与植物的生长发育 5. 在信号传导中的作用目前，对蔗糖酶的研究已取得了很大的进展，不仅分离、纯化了各种蔗糖酶，建立了活性测定方法，而且也测定了该酶的部分性质及其在植物体内的时空分布。

设计一个蔗糖酶专一性实验
当设计一个蔗糖酶（也称为葡萄糖醛酸酶）的专一性实验时，可以遵循以下步骤：
1. 实验目的：确定蔗糖酶对于蔗糖的特异性反应，以此来评估其专一性。

2. 实验材料：
- 蔗糖酶溶液
- 蔗糖溶液
- 葡萄糖溶液
- 缓冲液（适量）
- 试管
- 称量器具
- 恒温水浴
- 吸光度计
3. 实验步骤：
a. 准备工作：
- 为蔗糖酶溶液和蔗糖溶液分别设置适当的浓度，根据实验需求调整。

- 准备缓冲液，以确保反应的pH值适合蔗糖酶的活性。

b. 实验操作：
- 取一组试管，每个试管中加入相同体积的蔗糖酶溶液和缓冲液。

- 将第一个试管中加入蔗糖溶液，作为正对照组。

- 将第二个试管中加入等体积的葡萄糖溶液，作为阴性对照组。

- 将其余的试管中添加其他碳水化合物（如淀粉酶、乳糖酶等）作为非特异性对照组。

- 将所有试管放置在恒温水浴中，使其保持在适宜的温度，维持一定的反应时间。

c. 反应结束后，使用吸光度计测量每个试管中的吸光度，并记录下来。

d. 分析结果：
- 与正对照组相比较，如果蔗糖酶溶液在蔗糖试管中显示出显著较高的吸光度，则表明蔗糖酶对蔗糖具有专一性。

- 与阴性对照组和非特异性对照组相比较，如果蔗糖酶溶液在这些试管中显示较低的或无显著差异的吸光度，则表明蔗糖酶对其他碳水化合物没有显著反应。

请注意，这只是一个示例实验设计，确保在实验过程中遵守实验室安全操作规范，并根据具体研究需求进行适当的修改和优化。

一、实验目的1. 了解蔗糖酶的特性和功能；2. 掌握蔗糖酶提取和纯化的方法；3. 学习测定蔗糖酶活力和专一性的实验技术；4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。

二、实验原理蔗糖酶是一种水解酶，可以将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。

本实验通过提取和纯化蔗糖酶，测定其活力和专一性，并分析影响其活性的因素。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：酵母菌、蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素、麦芽糖等；2. 实验试剂：氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铜、硫酸锌、碘液、斐林试剂等；3. 实验仪器：旋光仪、离心机、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计、移液器、容量瓶、烧杯、试管等。

四、实验步骤1. 蔗糖酶提取（1）将酵母菌接种于含有葡萄糖的培养基中，37℃培养24小时；（2）收集培养液，离心分离菌体；（3）将菌体悬浮于磷酸缓冲溶液中，加入一定量的氯化钠和磷酸氢二钠，超声波破碎菌体；（4）离心分离酶液，得到粗提蔗糖酶。

2. 蔗糖酶纯化（1）将粗提蔗糖酶溶液通过硫酸铵分级沉淀法进行纯化；（2）收集沉淀，用磷酸缓冲溶液溶解，透析去除小分子物质；（3）通过凝胶过滤色谱法进一步纯化蔗糖酶。

3. 蔗糖酶活力测定（1）采用硫酸铜法测定蔗糖酶活力，以葡萄糖生成量为指标；（2）设置不同浓度的蔗糖溶液，在特定条件下测定酶活力；（3）绘制酶活力曲线，确定最适酶浓度和反应时间。

4. 蔗糖酶专一性实验（1）将蔗糖酶分别作用于蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素、麦芽糖等底物；（2）通过比色法测定反应产物的生成量；（3）分析酶对不同底物的催化效率，确定蔗糖酶的专一性。

5. 影响蔗糖酶活性的因素实验（1）考察pH、温度、离子强度等因素对蔗糖酶活性的影响；（2）设置不同pH、温度、离子强度等条件，测定酶活力；（3）分析影响蔗糖酶活性的因素。

五、实验结果与分析1. 蔗糖酶提取和纯化通过超声波破碎菌体和离心分离，成功提取出粗提蔗糖酶。

经过硫酸铵分级沉淀、透析和凝胶过滤色谱法，纯化得到较高纯度的蔗糖酶。

蔗糖合成酶的测定方法[方案]蔗糖合成酶的测定方法一、仪器设备冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计二、试剂HEPES-NaOH(50mmol/L，pH7.5)缓冲液，包括50mmol/L MgCI;2mmol/LEDTA;20.2%(W/V)BSA;2%PVP;0.1%间苯二酚:称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。

30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖三、操作方法1、粗酶液制备称取0.5g样品(植物叶片去掉主叶脉)，洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH缓冲液，冰浴研磨，10000×g离心10min。

2、酶活性测定依次加入50μL粗酶液，50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5，20μL 50 mmol/LMgCI， 220μL 100mmol/L UDPG，20μL 100mmol/L6-磷酸果糖(20μL 100mmol/L果糖)， 30?中反应30min后，加入200μL 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚，摇匀后置于80?水浴保温10min，冷却后置于480nm 处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。

同时取50μL粗酶液，加入200μL 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。

3、蔗糖标线制作:取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。

4、计算,1,1样品中酶活性(μg?g?h)=式中 C—反应液催化产生的蔗糖总量(μg);V—提取酶液时加入的缓冲液体积(ml); 1V—酶反应时加入的粗酶液体积(ml) 2淀粉酶活性的测定1方法1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液:0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液:用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制;标准麦芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2mol?L-1 NaOH溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000 mL。

一、实验目的和要求1．学习SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)的基本原理和操作方法。

2．蔗糖酶分离纯化产物的SDS－PAGE检测分析。

二、实验内容和原理含α-醇酮基的糖具有还原性．在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原为有色甲臜(formazan)，后者在可见光区有最大吸收。

该反应在一定条件下可定量完成，且生成的有色甲臜具有一定的稳定性。

三、实验材料和试剂1．实验材料：蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）。

2．实验试剂：（1）30.8%凝胶贮液：丙烯酰胺(Acr) 30g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，加水溶解，并加水定容到100ml，过滤。

贮于棕色瓶，可在4℃保存一个月。

丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体及溶液是中枢神经毒物，要小心操作。

（2）分离胶缓冲液：3mol/L Tris-HCl pH8.9。

（3）浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl pH6.7。

（4） 10% SDS。

（5） TEMED（N,N,N′,N′－四甲基乙二胺）（增速剂）。

（6） 10%过硫酸铵（引发剂）。

（7）0.1%Triton X-100溶液。

（8）含5%蔗糖的0.2 mol/L乙酸缓冲液（pH4.6）。

（9）0.1 mol/L碘乙酰胺。

（10）现配的含0.2%（w/v）2,3,5-triphenyltetrazolium chloride monohydrate (TTC) 的1mol/L NaOH 溶液。

（11）7.5%乙酸。

（12）5×蛋白质上样缓冲液。

四、实验器材与仪器1．电泳仪、垂直电泳槽及配件（长短玻璃板各1块、封胶条2条、梳子1个）。

2．微量移液器：10μl、200μl、1000μl。

3．烧杯、长滴管。

4．恒温水浴50℃、100℃。

5．高速台式离心机。

6．离心管（1.5ml、0.5ml）及离心管架。

7．￠15cm培养皿（染色、脱色用）。

五、操作方法和实验步骤1. 准备电泳装置：电泳槽、电泳仪。

蔗糖是重要的光合产物，是植物体内运输的主要物质，优势碳水化合物的暂贮形式之一。

蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物体内催化蔗糖合成的两种酶。

对这两种酶活性的测定，可以了解植物组织合成蔗糖能力的高低。

【实验原理】蔗糖合成酶催化游离果糖与葡萄糖工体UDPG反应生成蔗糖。

UDPG+果糖---蔗糖+UDP这是一个可逆反应，平衡常数为1.3-2.0。

该酶在分解方向的Km值相对较高（30-150mmol/L），细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。

蔗糖合成酶活性测定既可在合成方向进行测定（外加底物UDPG和果糖，测产物蔗糖的量表示酶活性），也可以在分解方向进行测定（外加蔗糖和UPD，测定果糖含量表示酶活性）。

蔗糖磷酸合成酶（SPS）催化UDPG与果糖-6-磷酸（F6P）结合形成磷酸蔗糖：UPDG+F6P---蔗糖-6-P+UDP+H+6-磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶（SPP）水解后形成蔗糖。

实际上最近有证据证明SPS 和SPP可以在体内形成一个复合体，因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。

酶活性测定是外加UDPG和F6P，测定产物蔗糖的量表示酶活性。

一般把SPS-SPP系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分解的。

果糖是酮糖，可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物，在一定范围内糖的含量与反应液颜色成正比。

蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖，也能生成红色产物，在480nm处可比色测定。

【实验材料】植物茎【仪器设备及设备】冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量0.01mg），0.1、0.5、1、5ml移液管各1个，10ml具塞试管10支，5ml量瓶一个，冰箱【试剂药品】1.提取缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含5mmol/LMgCl 2,2mmol/LEDTA-Na 2,2%乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSP），2%PVP，5mmol/LDTT。

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。

本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。

在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。

在实验过程中，虽然我们很努力,但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。

关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离 DEAE-Cellulose柱层析分子筛层析Km前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。

随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。

这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。

由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。

各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。

酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。

就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。

其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。