PCR经验总结
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pcr核酸检测个人工作总结在进行PCR核酸检测工作期间,我从事样本采集、实验操作、数据分析等工作。
通过这段时间的工作,我总结了一些经验和教训,以便今后在工作中能够更好地进行PCR核酸检测。
首先,我发现在进行样本采集时,要特别注意操作规范和卫生条件。
尤其是在采集呼吸道样本时,要确保采集的样本质量和完整性,避免外界污染。
此外,及时将采集的样本储存和送检,以确保样本的准确性和可靠性。
其次,在进行PCR实验操作时,要严格按照实验流程和操作规范进行。
特别是在制备反应体系、模板DNA提取、PCR扩增和产品分析等环节,要严格控制每一步操作的条件和时间,避免实验误差和污染。
此外,数据分析也是PCR核酸检测工作中的关键环节。
要对实验得到的数据进行准确的分析和解读,以确保检测结果的准确性和可靠性。
同时,要注意对比监测数据,及时发现异常情况并及时处理。
在工作中,我还发现了一些不足之处,比如在实验操作中出现了一些操作失误和技术问题,给实验结果带来了一定的干扰,导致需要重新进行实验。
在今后的工作中,我会加强对实验操作的细节和技术要求的学习和掌握,以提高实验操作的准确性和可靠性。
总的来说,通过这段时间的PCR核酸检测工作,我积累了一些宝贵的经验和教训,也意识到了自己在技术和操作上的不足之处。
今后我会不断努力提高自己的工作能力,以更好地从事PCR核酸检测工作。
自从新型冠状病毒肆虐以来,PCR核酸检测成为一项非常重要的检测手段,在疫情防控和病毒溯源中发挥着至关重要的作用。
在参与PCR核酸检测工作的这段时间里,我深刻认识到了PCR核酸检测工作的重要性,并且也意识到自己在技术和操作上的不足之处。
在这篇工作总结中,我将分享我在这项工作中的经验和教训,以及我对未来工作的规划和思考。
首先,作为PCR核酸检测的关键环节之一,样本采集的质量直接影响着后续检测结果的准确性。
在实际工作中,我发现在采集样本时要特别注意操作规范和操作规程。
尤其是在采集呼吸道样本时,要确保采集的样本质量和完整性,避免外界污染。
pcr工作总结个人
PCR工作总结
在过去的一段时间里,我参与了PCR实验的进行并进行了相
关数据分析。
以下是我的个人总结:
1. 设计合适的引物和探针: 在PCR实验中,选择合适的引物和
探针非常重要,因为它们直接影响到反应的特异性和效率。
我在设计引物和探针时充分考虑了目标序列的特性,并通过生物信息学工具进行了引物的有效性和特异性检验。
2. 优化PCR反应条件: 我进行了一系列的试验,优化PCR反
应条件以提高扩增效率和特异性。
我尝试了不同的温度梯度、不同反应体系的比例和浓度,并通过监测反应产物的大小和纯度评估了优化效果。
3. 建立PCR实验流程: 我详细记录了PCR实验的步骤和条件,并建立了实验流程,以确保实验的重复性和可靠性。
我还优化了DNA提取和PCR反应的操作步骤,减少了潜在的污染和误差。
4. 数据分析和解释: 在PCR反应完成后,我对产生的数据进行
了分析和解释。
我使用统计学方法评估了扩增效率,并将结果与已知的参考数据进行了比较。
通过对扩增曲线和产物的大小进行分析,我能够确定目标序列的特异性和数量。
5. 结果和结论: 基于实验结果和数据分析,我得出了一些结论,
并提出了相应的建议。
我希望进一步优化PCR反应条件,尽量提高扩增效率和特异性。
另外,我还发现一些PCR反应中的问题,并提出了改进的措施。
总的来说,我的PCR工作经验使我对PCR技术有了更深入的理解,并提高了实验设计、操作和数据分析的能力。
在未来的工作中,我将继续应用这些技能,进一步拓展和应用PCR技术。
pcr检测工作总结
PCR检测工作总结。
PCR(聚合酶链式反应)是一种常用的分子生物学技术,用于检测和分析DNA。
在疾病诊断、基因编辑、犯罪调查等领域都有广泛的应用。
在实验室中,PCR检测工作是非常重要的,它可以帮助科研人员快速准确地获取所需的DNA信息。
以下是对PCR检测工作的一些总结。
首先,PCR检测工作需要严格的操作规范。
在进行PCR反应时,实验室工作
人员必须严格遵守无菌操作规程,以避免外源DNA的污染。
此外,实验室工作人
员还需要准确地计量反应液中的各种试剂,以确保PCR反应的准确性和可重复性。
其次,PCR检测工作需要精准的实验仪器。
PCR反应需要在特定的温度下进行,因此实验室必须配备高质量的PCR仪器,以确保反应温度的准确控制。
此外,实
验室还需要配备准确的离心机、电泳仪等设备,以进行PCR产物的分离和分析。
另外,PCR检测工作需要严密的数据分析。
在PCR反应结束后,实验室工作
人员需要对PCR产物进行准确的分析和鉴定。
他们需要使用准确的电泳技术,对PCR产物进行分离和检测。
此外,实验室工作人员还需要使用专业的软件对PCR
数据进行处理和分析,以获取准确的实验结果。
总的来说,PCR检测工作是一项需要高度专业技能和严格操作规范的工作。
只
有通过严格的操作规范、精准的实验仪器和严密的数据分析,才能保证PCR检测
工作的准确性和可靠性。
PCR技术的不断发展和完善,将为人类健康和科学研究
带来更多的福祉。
pcr个人工作总结
在过去的一段时间里,我在工作中取得了一些成绩,也遇到了一些挑战。
通过总结自己的工作情况,我想分享一下自己的经验和收获。
首先,在项目管理方面,我注重与团队的沟通和协调。
我定期与团队成员开会,了解每个人的工作进展和困难。
在这个过程中,我学会了倾听和给予支持,帮助团队成员克服困难并实现目标。
通过有效的沟通,我能够确保项目的顺利进行,并及时调整计划以适应变化的情况。
其次,在解决问题方面,我学会了思考和提出解决方案。
当遇到困难和挑战时,我不仅仅抱怨问题的存在,而是积极寻找解决办法。
我会研究相关的信息和资料,与同事讨论交流,以找到最佳的解决方案。
这种积极主动的态度帮助我解决了许多难题,并提高了工作效率和质量。
此外,我也注重不断学习和提升自己的能力。
我定期参加培训和学习新的知识,以跟上行业的发展和变化。
通过学习,我获得了更多的专业知识和技能,并能够更好地应对工作中的挑战。
我也善于利用网络资源和同行的经验,以拓宽自己的视野和思路。
最后,我要感谢团队的支持和合作。
在工作中,我深深体会到团队合作的重要性。
每个人的贡献和努力都是不可或缺的,只有共同合作才能实现更好的成绩。
我非常珍惜团队中的每个成员,并通过分享和帮助来促进团队的发展。
总的来说,这段时间的工作经历让我受益良多。
我学会了与团队合作,解决问题和不断学习提升。
我将继续努力,成长与进步,为公司的发展做出更大的贡献。
PCR年度考核表个人工作总结一、前言过去的一年,对我来说是充实而意义非凡的。
作为一名PCR实验室技术人员,我始终秉持着敬业、严谨、专业的工作态度,为医院提供准确、高效的核酸检测服务。
在此,我将对自己过去一年的工作进行总结和反思,以期在未来的工作中不断进步。
二、工作回顾1. 思想政治方面过去的一年,我始终坚持贯彻党的基本路线方针政策,认真学习国家卫生健康委员会和医院的相关政策法规,严守职业道德,廉洁自律。
在日常工作中,我严格遵守PCR实验室的操作规程,确保实验过程的准确性和可靠性。
2. 业务技能方面在业务技能方面,我通过参加培训、自学和交流,不断提高自己的理论水平和实践能力。
一方面,我熟练掌握了PCR技术的原理和方法,能够独立完成各种核酸检测任务。
另一方面,我积极参与科研项目,开展新技术和新方法的研究,为实验室的创新发展贡献力量。
3. 工作质量方面在保证工作质量方面,我始终坚持以病人为中心,以医疗质量为核心,严格按照国家标准和医院要求开展核酸检测工作。
在日常工作中,我认真对待每一个样本,确保检测结果的准确性和可靠性。
同时,我积极参加实验室的质量控制和内部培训,提高自己的业务水平。
4. 团队协作方面在团队协作方面,我始终保持团结友爱的态度,与同事之间相互支持、相互帮助。
在遇到困难时,我积极寻求同事和领导的帮助,共同解决问题。
同时,我积极参与实验室的各项活动,为实验室的和谐氛围贡献力量。
三、工作反思过去的一年,我在工作中取得了一定的成绩,但同时也暴露出了一些问题。
首先,我在业务知识方面还有待提高,需要进一步加强学习,充实自己的专业知识。
其次,我在时间管理方面还有待加强,需要更合理地安排工作和生活,提高工作效率。
最后,我在团队协作方面还有待提升,需要更加注重与同事的沟通与交流,共同提高实验室的整体实力。
四、展望未来展望未来,我将继续保持敬业精神,严谨态度,不断提升自己的业务能力和综合素质。
一方面,我将积极参加各类培训和学习,充实自己的专业知识,提高自己的学术水平。
实验室个人工作总结pcr在实验室进行PCR实验是一个常见的实验操作。
本人在过去的一段时间内在实验室里从事了PCR实验,并进行了一些个人工作总结。
首先,进行PCR实验前,我认真阅读了PCR实验的操作手册,了解了PCR实验的原理、步骤和注意事项。
在实验操作过程中,我十分注重实验操作的规范性和准确性,严格按照操作规程进行。
在实验仪器和设备的使用上,我也进行了充分的练习和熟悉,保证了实验操作的顺利进行。
其次,我在实验中积极参与了实验数据的采集和记录工作,及时整理和归档实验数据。
在实验数据分析上,我也做了一定的探索和总结,提出了一些实验数据的规律和特点,为实验结果的解释和讨论提供了有力的支持。
另外,我还在实验过程中发现了一些实验操作上的错误和问题,并及时记录和报告,以及时纠正错误,提高了实验的准确性和可靠性。
在实验结果的解释和呈现上,我也积极与实验室的其他成员进行交流和讨论,充分吸收并借鉴他们的意见和建议。
总的来说,通过这段时间的PCR实验工作,我深刻地体会到了实验操作的重要性和规范性,也提高了自己的实验技能和实验数据分析能力。
我将不断努力,积极参与实验室的实验工作,为科研工作的开展做出更大的贡献。
在进行PCR实验的过程中,我深刻认识到了实验室工作的重要性以及严谨性。
首先,我学会了严格遵守实验操作规程,严谨认真地准备试剂和实验仪器,确保实验操作的准确性和可靠性。
在配制PCR反应体系时,我严格按照配方比例和步骤进行,避免了试剂配制上的误差。
其次,我在PCR实验的温度控制和反应时间把握方面进行了反复的实践和调整,最终找到了适当的PCR条件,确保了PCR反应的高效进行。
在PCR产物的检测和分析上,我熟练掌握了琼脂糖凝胶电泳和实时荧光定量PCR等技术,准确地检测和分析了PCR产物,并保留了准确的记录和分析结果。
另外,我也积极参与了实验室的讨论和交流活动,充分借鉴和学习了其他实验员的经验和技巧。
通过与他们的交流,我不断积累了实验操作的技巧和经验,提高了自己的实验操作水平。
pcr个人工作总结全程
PCR个人工作总结全程。
在过去的一段时间里,我一直在进行PCR个人工作。
这项工作需要我不断地进行实验、分析数据,以及撰写报告。
在这个过程中,我遇到了许多挑战,但也取得了一些重要的成就。
首先,我花了大量的时间和精力进行实验。
我需要准确地操作PCR仪器,以确保实验结果的准确性。
在实验过程中,我遇到了一些技术性的问题,但通过不断地学习和实践,我逐渐掌握了PCR技术的精髓,能够熟练地进行实验操作。
其次,我需要对实验结果进行数据分析。
这项工作需要我具备一定的统计学知识,以及对实验结果的深入理解。
我利用统计软件对数据进行分析,得出了一些重要的结论,并将这些结论整理成报告,以便后续的研究工作。
最后,我需要不断地学习和更新知识。
PCR技术在不断地发展和演进,我需要时刻关注最新的研究成果,以及技术的更新。
我参加了一些相关的学术会议和研讨会,与同行交流经验,不断地提升自己的专业水平。
通过这段时间的工作,我不仅掌握了PCR技术,也提升了自己的实验和数据分析能力。
我深刻地体会到,科研需要不断地学习和实践,只有不断地提升自己,才能在科学研究的道路上走得更远。
我相信,在未来的工作中,我会继续努力,不断地追求科学的真理。
PCR个人工作总结全程,这段经历将成为我科研之路上宝贵的财富。
pcr工作总结个人PCR工作总结个人。
PCR(聚合酶链式反应)是一种用于复制DNA的技术,它在医学、生物学和法医学等领域都有着广泛的应用。
在过去的几年里,我有幸能够参与PCR实验的工作,并且积累了一些经验和心得。
在这篇文章中,我将总结一下我个人在PCR工作中的一些体会和心得。
首先,PCR实验的准备工作非常重要。
在进行PCR实验之前,我们需要准备好所有的试剂和设备,确保它们的质量和准确性。
此外,要做好实验前的样品处理工作,确保样品的纯度和完整性,这对于PCR实验的成功至关重要。
其次,PCR实验中的反应条件和参数设置也非常重要。
在进行PCR实验时,我们需要根据所需扩增的DNA片段的大小和特性,来确定反应体系的组成和PCR程序的参数。
这包括反应体系中的引物浓度、模板DNA的浓度、反应缓冲液的成分和pH值等。
此外,PCR程序的温度梯度和时间设置也需要根据实验的需要进行调整,以确保PCR反应的高效和特异性。
另外,在PCR实验中,我们也需要注意避免污染和交叉污染。
PCR实验中的试剂和设备都需要经过严格的消毒和清洁处理,以防止外源DNA的污染。
此外,在进行PCR实验时,我们也需要避免试剂和样品之间的交叉污染,这需要在实验过程中严格遵守操作规程和实验室的规定。
最后,对PCR实验结果的分析和解读也是非常重要的。
在PCR实验完成后,我们需要对PCR产物进行准确的分析和鉴定,以确保PCR反应的成功和产物的特异性。
此外,对PCR实验结果的解读也需要结合实验的目的和背景知识,以做出科学和合理的结论。
总的来说,PCR实验是一项复杂而重要的实验技术,在进行PCR实验时,我们需要做好实验的准备工作,严格控制反应条件和参数设置,避免污染和交叉污染,以及对PCR实验结果进行准确的分析和解读。
通过这些工作总结和个人体会,我相信我在PCR实验中的技术和经验会不断提高,为科研工作和实验室工作贡献更多的力量。
pcr个人工作总结本人已于2020年7月至2021年8月参与PCR实验室的工作,期间主要负责PCR试剂盒的研发与优化,并从中获得了一定的经验与收获。
通过这一年的工作,我对PCR技术的理解更加深入,对实验操作也更加熟练。
以下是我的个人工作总结:一、研发与优化PCR试剂盒作为PCR试剂盒的研发人员,我首先需要对PCR技术的原理、反应体系和常见问题有深入的理解。
我通过学习文献、参与内部研讨会和与同事交流,不断提高自己对PCR技术的掌握程度。
在PCR试剂盒的研发中,我参与了引物和探针的设计、酶的筛选与优化以及反应体系的优化等工作。
在引物和探针的设计方面,我通过分析目标基因的序列和各种引物设计软件,设计出了多个具有较高特异性和灵敏度的引物和探针。
在酶的筛选与优化方面,我使用了不同的酶并进行了比较实验,最终确定了适合我们实验室的最优酶。
在反应体系的优化方面,我对PCR反应液的组成进行了调整,优化了PCR反应的条件和效果。
二、质量管理与控制在PCR试剂盒的研发阶段,我注重对实验过程的质量管理与控制。
我对实验所用的试剂进行了充分的质量评估,并确保试剂的质量符合要求。
在实验操作过程中,我注重反应管的清洗和消毒,严格按照操作规程进行操作,并对实验环境进行了合理的控制。
我还学习了PCR试剂盒的质量管理知识,参与了内部质量控制和质量评估工作,确保PCR试剂盒的稳定性和可靠性。
三、数据分析与结果解读作为PCR试剂盒的研发人员,我负责对实验结果进行数据分析和结果解读。
我掌握了PCR结果的判断标准和数据分析方法,并通过统计学软件对实验数据进行了分析。
在结果解读方面,我需要综合考虑实验的可重复性、特异性和敏感性等因素,以及潜在的干扰因素,做出合理的结果解读,并撰写实验报告和技术总结。
四、团队合作与交流在PCR实验室工作的过程中,我与实验室的其他同事保持良好的沟通和合作。
我们定期开展研讨会和讨论会,分享实验经验和技术进展,并相互交流解决实验中遇到的问题。
pcr实验室个人年终总结《pcr 实验室个人年终总结》时光荏苒,转眼间一年即将过去。
在这一年里,我在 pcr 实验室的工作经历让我收获颇丰。
在这个充满挑战和机遇的环境中,我不断学习、成长和进步。
在此,我想对过去一年的工作进行一个全面的总结。
年初,我怀着满心的期待和紧张踏入了 pcr 实验室。
对于我来说,这是一个全新的领域,充满了未知和挑战。
但我深知,这也是一个能够让我发挥专业技能、实现自我价值的地方。
工作伊始,我面临的最大挑战就是熟悉实验室的各种操作流程和规章制度。
PCR 实验的要求极为严格,每一个步骤都需要精确无误,否则就可能导致实验结果的偏差。
为了尽快上手,我花费了大量的时间和精力去学习相关的理论知识,同时积极向同事请教,观察他们的操作技巧。
在日常工作中,样本的采集和处理是至关重要的环节。
我们需要确保样本的质量和完整性,这就要求我们在采集过程中严格遵守操作规程,避免交叉污染。
记得有一次,在采集一个重要样本时,由于我一时疏忽,没有按照标准流程进行操作,导致样本受到了轻微的污染。
虽然最终没有对实验结果产生重大影响,但这件事给我敲响了警钟,让我更加深刻地认识到规范操作的重要性。
从那以后,我在每一次样本采集和处理时都格外小心谨慎,不敢有丝毫的懈怠。
实验设备的维护和管理也是我们工作的重要组成部分。
PCR 实验设备精密且昂贵,需要定期进行维护和校准,以确保其性能稳定和准确性。
我积极参与设备的维护工作,定期检查设备的运行状态,及时更换易损部件,做好设备的清洁和消毒工作。
通过这些努力,我们有效地降低了设备故障的发生率,保障了实验的顺利进行。
数据的记录和分析是 pcr 实验中不可忽视的环节。
每一次实验的数据都需要准确无误地记录下来,并进行详细的分析。
在这方面,我始终保持着严谨的态度,认真对待每一个数据,不放过任何一个异常值。
通过对数据的深入分析,我们能够及时发现问题,调整实验方案,提高实验的成功率。
在这一年里,我也参与了多次紧急任务和项目。
PCR经验总结
实验注意事项:
(1)DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上,所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高温高压处理,常规消耗用品用后作一次性处理,避免反复使用造成污染。
(2)PCR操作应戴手套并勤于更换,必要时应戴好帽子和口罩,就像做手术一样,要有“无菌观念”。
(3)成套试剂,小量分装,专一保存,防止它用。
配制试剂用新器具,用后作一次性处理。
(4)试剂管用前先瞬时离心(10s),使液体沉于管底,减少污染手套与加样器机会。
(5)最后加模板DNA,马上盖好,混匀,瞬时离心(10s),使水相与有机相分开。
加入模板且忌喷雾污染,所有非即用管都应盖严。
加模板DNA后应更换手套。
(6)实验设阳性、阴性对照。
还有诸如:移液枪用完要放到最大计量位置,防止久了弹簧失灵;防止RNA酶污染标本;低温下操作,防降解;试剂有致癌致畸作用,做好个人防护;头脑中各操作步骤要清楚,不要加错试剂。
问题及解决方案汇总:
一、假阴性,扩增无条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及活性④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。
物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失
使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。
二、假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。
引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。
需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决:①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。
可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR来减轻或消除。
三、出现非特异扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有:①必要时重新设计引物。
②减低酶量或调换另一来源的酶。
③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。
④适当提高退火温度或采用两步法。
四、出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。
其对策有:①减少酶量,或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
③适当降低Mg2+浓度。
④增加模板量,减少循环次数。
五、出现大量引物二聚体
1. 从引物自身着手,重新设计引物,这是最根本解决这一问题的办法;
2. 可能模板有问题;
3. 模板浓度过小,适当加大模板量;
4. Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高,可降低它们的浓度;
5. 取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出置于冰上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的;
6. 所配Mix中加5%的甘油或者5%的DMSO,可以增强特异性;
7. PCR反应体系的配制在冰上进行,最后加Taq酶,PCR结束后,产物勿放置在室温下过长时间,有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。
8. 增加循环数;
9. 降低退火温度后有条带,则应逐渐提高温度,若提高温度的同时产物量减少,则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度而定,片段长则相应镁离子浓度应该高一些);
10. 若降低退火温度,发现还是只有引物二聚体,而且镁离子的浓度在20-25mM没有区别,则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀,导致吸取的试剂浓度不对。
11. 以上次的PCR产物作模板二次PCR,可以提高引物与模板的特异性,减少引物二聚体,如果两次时间间隔短的话,可以把原产物稀释100-1000倍,如果间隔较长可以稀释50-100倍;
六、高GC与复杂结构的模板处理
将模板置于95℃水浴锅中处理10分钟以上,然后置于冰上瞬时冷却,可大大降低二级结构对PCR的影响。
七、长片段与短片段拼接失败(定点突变)
在做定点突变时,倘若突变位点距离基因的某一侧较近(短片段<200bp)时,通常拼接困难或者难以通过电泳结果直观判断是否拼接成功。
此时,可在短片段的上方(突变近5’端)或下方(突变近3’端)选取一条载体通用引物与基因另一条引物PCR(控制产物大小>300bp),然后再做基因拼接。
确认大小无误后,再以此产物为模板,用基因首尾引物PCR即可。
八、Long PCR无条带
对于>5Kb片段扩增,常规PCR很难得到较好的条带,建议①更换更适合于Long PCR的聚合酶;②添加PCR Enhancer调整体系;③设计多对引物分段扩增。
PCR增强剂(PCR Enhancer):
常见的添加剂有:DMSO,甘油,甲酰胺,硫酸铵,甜菜碱,BSA等,它们对PCR反应的影响虽然有所不同,但都可提高PCR的扩增效率。
1. DMSO:解除模板DNA局部二级结构,增加引物与模板的特异性结合,使聚合酶更容易在二级结构处延伸,但是对酶活有抑制作用,且当其浓度大于10%时还会降低保真性。
2. 甘油:可降低模板溶解温度(Tm),提高产量,但是对酶活有抑制作用。
3. 甲酰胺:促进某些“引物-模板”退火,降低带有二级结构的DNA的变性温度。
4. 硫酸铵:增加反应体系的离子强度,改变DNA的变性及退火温度,调节酶活。
5. 甜菜碱:有利于DNA双链的解开,Polymerase的结合,提高PCR的效率。