α-半乳糖苷酶活性测定方法的研究

饲用α-半乳糖苷酶稳定性及酶学特性的研究王春林;陆文清【摘要】本试验系统研究了通过固态发酵法生产的饲用α-半乳糖苷酶粗酶的稳定性及其酶学特性.结果显示,该酶具有较强的耐酸性能,稳定pH范围在3.5～6.5.酶的最适温度在50～60℃,在70℃以下时基本稳定,酶在干热条件下稳定性比湿热高.α-半乳糖苷酶经过猪胃肠液处理活力下降,但仍能保持活力70%以上.较高浓度(1×10-3mol/L)的各种金属离子均抑制酶活,在低离子浓度(1×10-4mol/L)时,Co2+和Mn2+对酶活力有促进作用,两种浓度的Ag+和Hg2+均强烈抑制酶活.粗酶制剂在常温储存6个月时仍保留原始活力的90.30%,到9个月时有80.58%,可见酶制品在储存条件下稳定.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2010(000)006【总页数】3页(P14-16)【关键词】α-半乳糖苷酶;温度;pH;胃肠液【作者】王春林;陆文清【作者单位】中国农业大学动物科技学院;中国农业大学动物科技学院【正文语种】中文【中图分类】S816.7α-半乳糖苷酶是消除饲料原料中α-半乳糖苷聚糖类抗营养因子的饲用外源酶类（张丽英，2000；Leske和 Coon，1999）。

但酶在加工应用过程中先经受原料混合加工、高温制粒、运输和储存等环节后，才在动物胃肠道溶解发生作用，所以酶制剂的稳定性倍受关注。

α-半乳糖苷酶理化性质的研究对其在饲料中的应用具有指导意义。

本试验对α-半乳糖苷酶粗制品的耐酸、耐温和耐储存性能进行了测定，体外研究了动物消化液对酶活力的影响，探讨了粗酶-底物作用的动力学特征。

1 材料与方法1.1 酶样与酶活测定酶样取自青霉菌（Penicillium sp.MAFIC-6）固态发酵生产的α-半乳糖苷酶粗酶制剂，测试样品为原酶干粉或原酶稀释液。

酶活分析方法参照Wang等（2004）。

1.2 pH对酶活力及稳定性的影响用醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH 3.6 ～ 5.6，0.05 mol/L）、NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液（pH 5.7 ～8.0，0.10 mol/L）、Tris-盐酸缓冲溶液（pH 6.8 ～9.2，0.10 mol/L）和 Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液（pH 9.2～10.7，0.10 mol/L）配制pH为2.5～12.5的缓冲体系，测定相同酶液在不同pH条件下的酶活力，确定最适pH。

α半乳糖苷酶标准
α-半乳糖苷酶是一种重要的糖苷酶，它能够催化半乳糖苷水解为半乳糖和糖基。

以下是α-半乳糖苷酶的标准：
1. 定义：α-半乳糖苷酶是一种能够催化半乳糖苷水解为半乳糖和糖基的酶。

2. 分子量：该酶的分子量通常为40-50 kDa。

3. 活性：α-半乳糖苷酶的活性受到底物浓度的影响，当底物浓度增加时，酶的活性也会增加。

4. 特异性：该酶对半乳糖苷具有特异性，但对其他糖苷的亲和力较低。

5. 最适pH值：α-半乳糖苷酶的最适pH值通常为4.0-5.5。

6. 最适温度：该酶的最适温度通常为40-50℃。

7. 抑制剂：一些金属离子（如铜离子、锌离子）和酚类物质可以抑制α-半乳糖苷酶的活性。

8. 来源：α-半乳糖苷酶可以从不同的来源中提取，如细菌、真菌、植物和动物组织等。

9. 应用：α-半乳糖苷酶在食品工业、生物技术和医药等领域中具有广泛的应用。

以上是α-半乳糖苷酶的标准，希望能对您有所帮助。

网络出版时间：２０２３－０３－２０１５：５４：２６　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２３０３１９．２３５４．０５４．ｈｔｍｌ◇药检药理学◇重组人α 半乳糖苷酶在悬浮ＣＨＯ Ｓ细胞中的表达、纯化及功能活性鉴定邓木兰，周泓宇，郑可欣，李昭阳，郭婉怡，王艳苹，梁志成，李芳红，穆云萍，赵子建（广东工业大学生物医药学院，广东广州　５１０００６）收稿日期：２０２２－１０－１０，修回日期：２０２３－０１－２２基金项目：国家重点研发计划项目（Ｎｏ２０１８ＹＦＡ０８００６０３）；广东省重点领域研发计划项目（Ｎｏ２０１９Ｂ０２０２０１０１５）；广东省“珠江人才计划”项目（Ｎｏ２０１６ＺＴ０６Ｙ４３２）；国家自然科学基金青年项目（Ｎｏ８２１０００６４）作者简介：邓木兰（１９９３－），女，博士生，研究方向：基因工程蛋白表达及溶酶体贮积症的治疗，Ｅ ｍａｉｌ：２１１１７０６１３９＠ｍａｉｌ２．ｇｄｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ；穆云萍（１９８８－），女，博士，讲师，硕士生导师，研究方向：心肺疾病及纤维化疾病发病机制及创新药物研发，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｍｕｙｕｎｐｉｎｇ２０１８＠ｇｄｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ；赵子建（１９６２－），男，博士，教授，博士生导师，研究方向：生殖、肥胖、代谢性疾病、肿瘤病理诊断和创新药物研发，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ａｚｚｈａｏ＠ｇｄｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２２０５０２２文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０４－０７７４－０８中国图书分类号：Ｒ３２９ ２４；Ｒ３４５ ６２；Ｒ３９４ ２；Ｒ５８９；Ｒ９７７ ３摘要：目的　运用无血清可高密度悬浮培养的中国仓鼠卵巢细胞（Ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ，ＣＨＯ Ｓ）表达体系，分泌表达并纯化重组人α半乳糖苷酶（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎα ｇａｌａｃ ｔｏｓｉｄａｓｅＡ，ｒｈα ＧａｌＡ），验证其对法布雷病贮积底物神经酰胺三己糖苷（ｇｌｏｂｏｔｒｉａｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ，Ｇｂ３ｏｒＧＬ３）的清除效果。

产α-半乳糖苷酶唾液乳杆菌XH4B筛选、性质、应用及高密度培养研究的开题报告1. 研究背景和意义α-半乳糖苷酶作为一种消化酶，在人类和动物的消化系统中起到关键作用。

同时它也是一种广泛用于食品、饲料工业和医疗领域的酶。

对于高效筛选和大规模生产α-半乳糖苷酶的菌株，具有重要意义。

唾液中含有大量细菌，其中乳杆菌是唾液中数目最多的细菌之一。

通过对唾液中乳杆菌的筛选，可以获得产α-半乳糖苷酶的高效菌株。

由此，本研究将从唾液样品中筛选出高效产α-半乳糖苷酶的厌氧乳杆菌XH4B，进一步探究其性质和应用，以及实现其高密度培养的研究，为α-半乳糖苷酶的应用和生产提供科学依据。

2. 研究内容和方法2.1 筛选产α-半乳糖苷酶的厌氧乳杆菌XH4B采集健康人唾液，利用微生物学方法筛选出产α-半乳糖苷酶的厌氧乳杆菌XH4B，并通过分子生物学方法鉴定其种属和亲缘关系。

2.2 分析产α-半乳糖苷酶的性质和应用通过对XH4B产α-半乳糖苷酶的生化特性、受底物和抑制剂的影响以及温度、pH等环境因素的影响进行分析，并探究其在食品工业和医疗领域的应用前景。

2.3 实现高密度培养研究通过优化培养基成分和培养条件，采用发酵罐等高密度培养设备，实现XH4B的高密度培养，并检测其产α-半乳糖苷酶的产量和活性。

3. 预期成果及意义3.1 预期成果本研究将从唾液中筛选出高效产α-半乳糖苷酶的厌氧乳杆菌XH4B，并对其性质和应用进行深入研究，同时实现其高密度培养，预计取得以下主要成果：（1）成功筛选并鉴定出产α-半乳糖苷酶的乳杆菌XH4B；（2）明确XH4B产α-半乳糖苷酶的物理化学性质和应用前景；（3）实现XH4B的高密度培养，提高产α-半乳糖苷酶的产量和活性。

3.2 意义本研究实现了从自然唾液中筛选出具有产α-半乳糖苷酶活性的乳杆菌，并探究了其性质和应用。

同时，通过高密度培养，实现了α-半乳糖苷酶的高效生产，并为其在食品、饲料和医疗领域的应用提供科学依据。

产α-半乳糖苷酶菌株的筛选、酶学特性和固定化研究
赵晴潇;魏群
【期刊名称】《东北电力大学学报》
【年(卷),期】2015(000)003
【摘要】为解决目前工业用α-半乳糖苷酶耗能大、成本高的难题,研究泡菜汁中筛选出产α-半乳糖苷酶的菌株,而后对其进行紫外诱变和亚硝酸钠进一步诱变,并在不同温度和不同pH下测定α-半乳糖苷酶酶活力。

结果表明：获得一株酶活高达36.9 U/mL的α-半乳糖苷酶菌株,该菌株所产α-半乳糖苷酶的最适反应温度为50℃,最适pH为5.5。

利用4%海藻酸钠做为固定剂对α-半乳糖苷酶进行固定化,可以使酶活保持在70%左右,此α-半乳糖苷酶高产菌株的发现及其酶学特性的研究为α-半乳糖苷酶的工业化应用奠定了基础。

【总页数】5页(P77-81)
【作者】赵晴潇;魏群
【作者单位】东北电力大学化学工程学院，吉林吉林132012;东北电力大学化学工程学院，吉林吉林132012
【正文语种】中文
【中图分类】Q93-33
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1.5 β—半乳糖苷酶粗酶液的提取将菌株接种于产酶培养基中，30℃培养60h，过滤收集菌体，充分洗涤，加柠檬酸--磷酸氢二钠缓冲液（0.1mol/L，pH5.0）研磨，破壁菌液离心所得上清液即为粗酶液。

1.6 酶活力的测定在试管中加入100µl邻硝基苯酚-β-D半乳糖苷（ONPG），800µL 10.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，100µl酶液，混匀，50℃水浴中反应10分钟，加2ml 1mol/L终止反应，测定计算酶活力。

酶活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟分解ONPG，生成1µ mol邻硝基苯酚（ONP）所需的酶量为1个酶活力单位（U）。

1.2.1 酶活力的测定以ο-NPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。

酶活力单位定义为以ο-NPG为底物37℃保温酶解，每分钟释放出1µmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。

β-半乳糖苷酶活测定采用Genstar 的β-半乳糖苷酶检测试剂盒法。

在有β-半乳糖苷酶存在的条件下，无色的反应底物会转化生成黄色的硝基酚(o-nitrophenol)。

向各管中加入一定量的反应终止液，离心测定420 nm 和550 nm 下的吸光度。

β-半乳糖苷酶活性单位数(U)=1000- (OD420 -1.7 OD550)/Time(min)×V(mL)×1.5 酶活力测定方法将pH6.5的磷酸缓冲液500µl和0.25%的ONPG 200µl加入比色管,在25℃的温度下温浴5min,加入适当稀释的粗酶液0.5ml,反应10min,加入800µl 5%Na2CO3终止反应,蒸馏水定容至10ml,用分光光度计420nm测定OD值,通过标准曲线方程计算酶活。

在上述条件下1ml粗酶液1min催化水解ONPG生成1µmol邻硝基苯酚(ONP)的量,定义为1U。

1.2培养基初筛培养基：乳糖0.5%，硫酸镁0.007%，磷酸氢二钾0.01%，氯化钙0.004%，硫酸铵0.01%，琼脂1.5%，自然pH，每100mL培养基中加入20mg/mL X-gal溶液200µL；复筛培养基：乳糖1.5%，蛋白胨1.0%，酵母浸膏0.3%，氯化钠0.1%，pH值7.0；发酵培养基：乳糖3.0%，蛋白胨1.5%，酵母浸膏1.0%，氯化钠0.3%，pH值7.0。

α-半乳糖苷酶酶活力的测定方法1.α-半乳糖苷酶酶活力单位定义在pH5.5并37℃条件下，每分钟内底物降解释放1μmol对硝基酚所需要的酶量为一个酶活单位U。

2.测定原理α-半乳糖苷酶能将对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖降解成对硝基酚。

通过400nm比色测定释放的对硝基酚的量，可以计算反应液中α-半乳糖苷酶的活力。

3.试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均符合GB/T6682中规定的三级水。

3.1 0.05mol/L醋酸钠缓冲液：A液：称取无水醋酸钠4.2g定容至1000mL；B液：冰醋酸3.0 mL定容至1000 mL。

用B液调节A液至pH5.5。

3.2 0.2mol/L碳酸钠溶液：准确称取21.198g无水碳酸钠，定容至1000mL。

3.3 对硝基酚标准溶:(10 mmol/ L)称取0. 1391 g对硝基苯酚，精确到0. 001 g ,用碳酸钠溶液定容至100 mL，低温保存。

依次移取对硝基苯酚标准贮备液1 mL 、2 mL 、3 mL 、4 mL 、5 mL 、7 mL 、9 mL ,用碳酸钠溶液定容至100 mL ,配成浓度为0.1 mmol/ L 、0.2 mmol/ L 、0.3mmol/ L 、0.4mmol/ L 、0.5mmol/ L 、0.7mmol/ L 、0.9mmol/ L 的对硝基苯酚标准工作液。

3.4 10mmol/L对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液：称取3.031g对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖，用醋酸钠缓冲液定容至1000mL，置棕色试剂瓶于4 ℃以下保存。

4.仪器与设备4.1实验室用样品粉碎机或碾体。

4.2分样筛：孔径为0.25mm（60目）。

4.3分析天平：感量为0.001g。

4.4 pH计：精确至0.01。

4.5磁力搅拌器：附加热功能。

4.6电磁震荡器4.7烧结玻璃过滤器：孔径为0.45μm。

4.8离心机：2000g以上。

4.9恒温水浴锅：温度控制范围在30-60℃之间，精度为0.1℃。