植物细胞工程

植物细胞工程①生物工程(b i o t e c h n o l o g y)：以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理，生产生物制品和创造新物种的一种综合技术。

②植物细胞工程的概念(plant cell engineering)：在离体培养条件下，在细胞水平上对植物材料进行遗传操作的技术③包括：器官培养，胚胎培养，组织培养，原生质体培养。

④植物细胞的全能性（t o t i p o t e n t)：每个植物细胞具有该植物体的全部遗传信息，在适合条件下具有发育成完整植物个体的潜在能力。

⑤受精卵最大，，生殖细胞大于体细胞⑥分化：细胞在形态、结构和功能上发生永久性的适度变化的过程。

⑦脱分化：有高度分化能力的组织或器官产生愈伤组织的过程。

成熟的细胞转变为分生状态，进而分裂形成无分化的细胞团，即形成愈伤组织的过程。

⑧再分化：脱分化后的细胞再次分裂、分化并形成不同组织、进而构成器官和植株的过程。

⑨愈伤组织(c a l l u s)：离体组织或器官进行离体培养时，进行细胞分裂，形成一种高度液泡化的无定形的薄壁细胞。

⑩外植体——是指用于植物组织培养的接种材料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体等。

11 胚状体: 指植物细胞、组织或器官的离体培养中，起始于一个非合子细胞，并经过胚胎发育过程分化出的类似胚一样的细胞群。

12 1902年，德国植物学家Haberlandt 根据细胞学说，提出单个细胞的植物细胞全能性理论。

并进行了细胞培养试验，提出了激素作用理论和看护培养设想。

后人称之为¡°植物组培之父¡±。

13 1943年，W h i t e明确提出“植物细胞全能性”学说：每个植物细胞具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。

14 1958年，英国科学家Steward 等悬浮培养胡萝卜根的愈伤组织细胞，成功诱导完整的小植株，首次使细胞全能性理论得到证实。

15 1962 Murashige & Skoog 在烟草培养中筛选出卓有成效的MS培养基。

16 快速繁殖：运用组织培养和细胞培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株，而且均来自一单一的个体，遗传性状一致。

17 组培技术应用：快速繁殖，种苗脱毒，细胞育种，花药培养，药用植物代谢产物工厂化生产，种质保存18 植物次生代谢产物：植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。

（紫杉醇，紫草宁）19 高压蒸气灭菌锅工作原理：在密闭的蒸锅内，0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。

在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

20 培养基的成分包括：无机盐；有机物；碳源和能源；植物激素；琼脂（凝固剂）；辅助物质。

21 微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。

22 碳源和能源的作用:作为碳源和能源；维持一定的渗透压23 2，4—D用于诱导愈伤和增值；NAA,IBA用于生根培养。

细胞分裂素（Kt;BAP;Zt）CTK用于脱分化，细胞增殖，诱导愈伤组织芽分化。

24 细胞分裂素生长素=低：有利于芽的分化中：有利于根芽的分化愈伤组织的形成高：有利于根的形成和25 赤霉素（GAs ）:促茎的生长，促胚发育成植株，打破休眠，一般在器官形成后加入。

26 抗生素对组织生长有抑制作用，使用应慎重。

（不耐热，需过滤灭菌。

）27 pH 高于6时一般培养基变硬，低于5时培养基不凝固。

28 母液配制方法:单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。

混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液。

（stock solution ）29 无机大量母液配制时因其所需要的量大，故可以采用百分天平或托盘天平，无机微量母液配制时因其量极少，故需要采用万分天平。

有机母液的配制采用万分电子天平。

30 无机大量母液中的各种物质在混合过程中有些离子之间发生反应易形成沉淀，故需每种物质先充分溶解，再进行混合，而且钙盐最后缓慢加入进去。

31 铁盐选用硫酸亚铁而不用硫酸铁，因硫酸铁溶解后易形成氢氧化铁沉淀，配制方法为：在装有800ml 蒸馏水的烧杯中加入两粒氢氧化钠(C.P.),溶解后加入3.73g/L 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na 2）,加热使其溶解，然后边搅拌边缓慢加入2.78g/LFeSO 4.7H 2O 直至全部溶解，冷却后定容至1L,置于冰箱备用。

32 NAA,IBA,IAA 配制时一般应先用无水乙醇（A.R.）助溶,2,4-D 可用0.1mol/L 的氢氧化钠助溶，细胞分裂素一般先用0.1mol/L 的盐酸助溶，然后加入温水冷却后定容。

33 母液稀释计算：吸取量=母液浓度需要配制的浓度×需要配制的培养基体积 34 培养基配制方法：取所需量的母液稀释和蔗糖溶解定容至所需的体积，加所需量的琼脂，高压灭菌，于无菌条件下分装。

取所需量80%的蒸馏水和所需琼脂于锅中煮沸，至琼脂完全溶解，边加热边搅拌，待琼脂完全溶解后再加入所需量的母液（可先取所需母液混合于小烧杯中，加少量的水稀释），再加入所需量的蔗糖，边加热边搅拌，待蔗糖溶解后，趁热定容至所需体积（不足加水补足，并混合均匀），分装，灭菌。

35 培养基按其态相分为固体培养基和液体培养基，按其培养过程分为初代培养和继代培养。

根据作用可分为诱导培养基，增值培养基，生根培养基。

按其营养水平分为基本培养基和完全培养基。

36 外植体的选择需要考虑的因素有：取材部位，季节。

器官的生理状态和发育年龄，大小等。

37 污染：在组织培养过程中培养基或培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。

38 常用的灭菌方法分为物理方法和化学方法，其中物理方法有干热灭菌法，湿热灭菌法，射线灭菌，过滤除菌和流水冲洗。

化学方法有甲醛，高锰酸钾，过氧化氢，来苏尔，漂白粉，次氯酸钠，0.1%升汞和酒精（70%-75%)39 不耐热的物质需选用过滤灭菌的方式。

40 接种：把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官，组织，细胞，并将它们转放到无菌培养基上的全部操作过程。

41 培养条件包括，光照，温度，湿度，氧气，pH 等。

42 培养基灭菌前要比灭菌后高0.2-0.3个单位43 褐变：外植体在培养过程中，自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之变褐而死亡的现象。

44 褐变的原因：外植体组织中含有的酚类氧化物和多酚氧化酶正常情况下是分隔存在的，比较稳定，但是当切割外植体的时候，切口附近的分割作用被破坏，酚类和多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下，酚类迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类物质又会在酪氨酸酶的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致组织代谢紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。

45 影响褐变的因素:培养材料，培养条件，培养基种类，材料转瓶周期。

46 木本植物中因其含有木质素，单宁含量和色素含量比较高，导致其比草本植物容易发生褐变。

47 成龄材料中含有的酚类物质比幼龄材料高导致其比较容易发生褐变。

48 分化部位的醌类物质比分生部位的积累多。

49 温度过高或光照过强，易导致多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。

50 液体培养基中，外植体溢出的有毒物质可以很快扩散，因而对外植体的伤害较轻。

51 无机盐中的锰，铜等离子是参与酚类合成与氧化酶类的组成成分及辅助因子。

其含量高易导致褐变。

52 细胞分裂素不仅能促进酚类物质化合物的合成，而且还能刺激多酚氧化酶的活性。

53 活性炭或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为吸附剂可以去除酚类氧化造成的毒害效应，抗氧化剂（半胱氨酸，维生素C,硫代硫酸钠）可以改变外植体周围氧化还原电势，从而抑制酚类氧化，减轻褐变。

54 对于易褐变的材料，转瓶时间长，伤口周围积累醌类物质增多，褐变加重，以致全部死亡。

55 褐变预防措施：选择合适的外植体，采用适宜的培养基和光温条件，加入吸附剂、抗氧化剂和其他抑制剂，缩短转瓶周期。

56 玻璃化（vitrification）:组培过程中出现的叶片失绿，脆弱，成透明现象含有较高水分，蛋白质纤维素等含量较低的现象。

57 玻璃化的原因：激素浓度，琼脂用量，温度，离子水平，光照时间，通风条件等58 细胞分裂素的浓度提高时，易导致玻璃化苗的产生。

琼脂浓度低时，玻璃化比例增加。

温度低时，玻璃化比例高。

光照时间大于15h时玻璃化比例明显增加。

气体交换不良，易形成玻璃化。

离子种类及比例不平衡也会出现玻璃化现象。

59 玻璃苗发生的机理：1，乙烯产生后引发了其他激素质和量上的改变及酶类的变化。

2.植物光呼吸作用和磷酸戊糖途径受到抑制易形成玻璃苗。

60 预防玻璃化的措施：适当提高蔗糖和琼脂的浓度，适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度，适当控制培养基中无机营养成分，增加自然光照控制光照时间，控制好温度，改善培养器皿的气体交换状况，添加其他物质。

61 试管苗驯化的目的：提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用的能力，促使试管苗健壮，最终达到提高试管苗的移栽成活率。

62 愈伤组织形成可以分为三个时期，分别为：起始期，分裂期，形成期。

63 优良愈伤组织具备的特性：1.高度的胚性，易于得到再生植株2.分散性好，易于建立优良悬浮系，3.增值能力旺盛4.经过长期继代培养不丧失胚性。

64 愈伤组织形态发生方式有：形成不定根或不定芽，通过体细胞形成再生植株。

65 形成不定芽或不定根：植物激素的作用和外植体自身的因素作用66 胚状体与不定芽的区别：1.具有两极性，即有茎端和根端2.胚状体的微管组织与外植体的微管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的微管组织相联系3.胚状体的微管组织独立分布呈Y形，而不定芽的微管组织无此现象。

67 体细胞胚状体诱导的影响因素：1.生长素2.其他植物生长物质的作用3.氨源形态的影响（铵根和水解酪蛋白优于硝酸根或谷氨酰胺）4.其他培养条件的影响(光照，温度等)68 形成体细胞胚的关键因素是除去或降低培养基中的生长素成分，4-D等生长素可以诱导内源乙烯产生，内源乙烯不影响愈伤增值，但抑制愈伤组织进一步分化成胚。

69 细胞分裂素有利于胚状体的形成。

70 诱导胚状体途径再生植物的优点：1.数量比不定芽多，2.获得速度快3.结构完整4.胚状体可以制成人工种子，便于运输和保存5.胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。

71 人工种子：外面包裹一层有机薄膜的植物胚状体。

72 人工种子的优点：1.结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直接播种，易于机械化操作2.不受季节限制，不受环境制约，胚状体数量多，繁殖快，有利于工厂化生产3.有利于繁殖生育周期长，自交不亲和，珍贵稀有的一些植物，也可大量繁殖无病毒材料4.可在人工种子中加入抗生素，农药，菌肥等成分，提高种子活力和品质5.由无性繁殖体系产生胚，可以固定杂种优势。