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基于白血病分类的流式细胞术数据分析白血病是一种相对较为常见的恶性血液病，其患者人数逐年增加。
其中，淋巴细胞白血病与骨髓增生性疾病的鉴别诊断，尤其是B-淋巴细胞白血病与慢性淋巴细胞白血病的鉴别诊断是白血病分类中最为困难的问题之一。
液体肿瘤的流式细胞术可以快速、准确地定量观察肿瘤细胞的表型及其分布状态，从而为诊断、分型、危险分层、疗效评估和指导个性化治疗提供了重要的参考依据。
一、流式细胞仪及其原理流式细胞仪（flow cytometer）是一种分析生物颗粒的现代化仪器，通过微细水在单细胞水平上分离、激发、检测、采集和分析细胞，使得我们可以从样品中快速、可靠地获得多参数荧光信息。
其主要原理是实现细胞的有效分离、定量、激发和检测，并将其表型指纹信息记录下来，以便科研人员和医生进一步分析和诊断相关问题。
二、流式细胞仪的前处理前处理是流式细胞术的关键环节之一，目的是获得高纯度的单细胞悬液，以方便后续的分离、激发和检测。
其主要包括样本采集、样品制备和细胞洗涤三个方面。
1. 样本采集样本采集是前处理的第一步，样本的质量和数量对后续的分离、检测和数据分析具有重要的影响。
在样本采集过程中，需要注意避免样本污染、细胞凋亡、氧化等对样本品质的影响。
2. 样品制备样品制备是前处理的重要环节之一，主要包括细胞裂解、滤过、质量检测、细胞染色和标记等步骤，在操作过程中，需要严格按照流程要求，精细化操作。
3. 细胞洗涤细胞洗涤是前处理的最后一步，其主要目的是从制备好的样品中，去除多余的细胞碎片、溶质和垃圾等杂质，得到纯净的单细胞悬液。
三、数据分析和诊断数据分析和诊断是液体肿瘤流式细胞术的重要环节之一，通过细胞表型相关分析等手段，展开进一步的诊断、分型以及疾病危险评估。
1. 后续生物信息学分析后续生物信息学分析可以对流式细胞术得到的多参数荧光信息进行进一步的解析和比对，方便分析人员和医生从中挖掘更多的疾病相关指标。
2. 诊断和分型诊断和分型是流式细胞术的重要应用之一，其主要基于患者血液中病理细胞的表型学特征，进一步进行疾病的分类和诊断。
最详细的流式细胞仪实验方法流式细胞仪（Flow cytometry）是一种高精度的细胞分析技术，可用于快速鉴定和分离多种类型的细胞。
本文将介绍一种常用的流式细胞仪实验方法，包括样品准备、细胞染色、细胞分析和数据分析等步骤。
一、样品准备1.收集细胞：制备单细胞悬液，如细胞培养物等。
2.细胞计数：使用细胞计数器或血细胞计数板等工具，计算细胞密度。
3. 调整浓度：根据流式细胞仪系统的要求，将细胞悬液的浓度调整至适当的浓度（一般建议在1×10^5至1×10^6个细胞/ ml之间）。
二、细胞染色1.封闭非特异结合位点：为了减少非特异性结合，可使用FBS（胎牛血清）或BSA（牛血清蛋白）等以阻断非特异位点。
2.添加荧光染料：选择合适的染料，如草酰胺（CFSE）、丙酮染料(ATTO)或FITC等。
按照厂家说明书中建议的浓度将染料添加到样品中，好洗脱或者可用来鉴定细胞的抗体，如表面标记、核酸染色剂或功能性抗体。
3.染色溶液：在4°C下孵育细胞悬液至少30分钟（具体时间根据实验需要决定）。
4.洗涤：向样本管中加入足够的缓冲液，使细胞悬液稀释五倍，并离心沉积细胞。
5.弃去上清液：将上清液弃去，然后用足够的缓冲液再次洗涤沉积的细胞。
6.重悬：向样品管中加入适量的缓冲液，使细胞形成合适的细胞密度。
三、设置流式细胞仪1.打开仪器：确保仪器已开启并运行正常，各通道和检测器已连接好，并预热至适当温度。
2.校正：根据仪器的手册，对流式细胞仪进行校正和标定，以确保流式细胞仪的准确性和稳定性。
3.样品管固定：将样品管插入到流式细胞仪中相应的槽中，以确保准确读取。
4.设置参数：在计算机或流式细胞仪仪器的界面上设置所需参数，如细胞个数、细胞染色等。
四、细胞分析1.利用流式细胞仪：启动流式细胞仪软件，并确保硬件与软件连接正常。
2.定位细胞：在细胞分析开始前，调整激光位置和侦测器的灵敏度，以确保对准确获取细胞。
流式细胞仪结果分析一、获取数据在进行流式细胞仪结果分析之前，首先需要获取实验数据。
流式细胞仪会输出每个样本细胞的荧光强度、散射性质等参数。
这些参数可以代表细胞的表型特征或者亚细胞结构。
根据实验的需要，可以选择一种或多种指标进行数据分析。
二、数据清洗和预处理由于实验过程中可能会受到一些随机因素的干扰，比如机器灵敏度、噪声等，得到的数据可能存在一些异常值。
因此，在进行数据分析之前，首先需要对数据进行清洗和预处理，以减少这些异常值的干扰。
数据清洗可以通过以下几种方法进行：1.去除非细胞事件：流式细胞仪在采集数据时可能会采集到一些非细胞事件，比如细胞碎片、空白颗粒等，可以通过设置或者后续数据处理来去除这些非细胞事件。
2.去除离群值：根据实验的需要和数据的分布情况，可以使用统计学方法或者软件工具来判断和去除离群值。
3.数据归一化：如果实验中使用了多个荧光探针，不同探针之间的信号强度可能有差异。
可以通过归一化处理来消除这种差异，以确保数据的可比性。
三、统计分析数据清洗和预处理之后，可以进行统计分析来描述和解析数据。
流式细胞仪的数据通常是多维的，可以使用多种统计分析方法来从不同角度揭示数据的特点和规律。
1.基本统计分析：包括均值、标准差、中位数等指标，可以帮助了解数据的集中趋势和离散程度。
2.相关性分析：通过计算各个参数之间的相关系数，可以研究不同指标之间的关系。
例如，可以使用皮尔逊相关系数来衡量两个参数之间的线性相关性。
3.差异分析：比较不同样本或不同组的数据之间的差异。
常用的差异分析方法有t检验、方差分析等。
四、数据可视化为了更好地理解和传达数据的结果，可以使用数据可视化技术将数据以图表、图像等形式展示出来。
常用的数据可视化方法包括散点图、条形图、箱线图等。
通过数据可视化，可以帮助研究者直观地观察数据的分布情况、群体几何形状和特征变化趋势等。
五、结果解读在进行流式细胞仪结果分析时，需要根据实验目的和样本特性进行结果的解读。
流式细胞术实验技巧及数据分析一、实验技巧1.细胞样本的准备在进行流式细胞术之前，首先需要准备好细胞样本。
对于悬浮细胞，可以通过离心分离获得单细胞悬浮液；对于贴壁细胞，需要利用胰酶等方法将细胞从培养皿上剥离。
样本的细胞浓度需要适当调整，以保证在实验过程中细胞数目在仪器检测范围内。
2.细胞标记与染色3.样本的处理与染色控制为了减少噪音和误差，需要进行相应的样本处理和染色控制。
常用的处理包括细胞固定、膜破裂和核酸溶解等。
另外，对照组的设置也非常重要，包括负对照、单标对照和血细胞淋巴细胞控制等，以校正仪器和标记的相关性。
4.流式细胞仪的设置与操作流式细胞仪是进行流式细胞术的关键仪器，需要正确设置和操作。
首先，要校准仪器的激发光源、滤光片和检测器等参数，以确保获得准确的荧光信号。
其次，要根据标记物的激发光和发射光波长选择合适的检测通道。
最后，通过检测标记物阳性细胞的信号强度和分布，调整仪器的敏感度和流速，以获得符合实验要求的数据。
二、数据分析1.数据获取与记录在流式细胞术实验结束后，需要用相应的软件（如FlowJo、CellQuest等）获取和记录仪器所产生的原始数据。
这些数据包括细胞整体的荧光信号和散点图等。
2.质量控制与后处理对于数据质量的控制，首先需要排除掉背景信号。
通过设置负对照，根据荧光信号的阈值来确定阳性细胞的比例。
另外，还需要剔除激活的、死亡的和颗粒干扰的细胞等。
3.数据可视化通过制作直方图、散点图和轮廓图等，可以直观地展示细胞的其中一种特定特征（如表达一些蛋白质、细胞周期等）在整个细胞群体中的分布情况。
从图形中可以得出相应的统计结果，并可以进一步比较不同样本之间的差异。
4.数据统计与分析对于一些研究问题，需要计算不同细胞亚群的百分比、中位数、平均值和标准差等。
此外，还可以利用双参数散点图，通过计算相关系数（如Pearson相关系数）来分析两个特征之间的相关性。
总结：流式细胞术作为一种快速、高通量和灵敏的细胞分析技术，对于研究细胞标记物的表达和功能等提供了有力的手段。
一、实验目的本实验旨在通过流式细胞术技术，对细胞群体进行快速、精确的分析和定量测定，研究细胞的物理与化学性质，并对细胞进行分类和分选。
通过本次实验，掌握流式细胞仪的工作原理，了解其在细胞生物学研究中的应用。
二、实验原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。
其基本原理是将经过荧光标记的细胞或微粒，在流动系统中以高速通过，同时利用激光束照射细胞，通过光散射和荧光信号来获取细胞的大小、形态、表面标记物等信息。
最后，通过数据分析和可视化展示，对细胞进行计数、分类和分析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细胞样本：小鼠脾细胞、Jurkat细胞- 荧光标记抗体：CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC- 溶液：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、荧光染料（如PI）2. 实验仪器：- 流式细胞仪（如BD FACS Calibur）- 离心机- 恒温培养箱- 移液器四、实验步骤1. 细胞制备：- 收集小鼠脾细胞或Jurkat细胞，用PBS洗涤后，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
- 加入荧光标记抗体，室温下孵育30分钟。
- 用PBS洗涤细胞两次，去除未结合的抗体。
2. 流式细胞术分析：- 将处理好的细胞加入流式细胞仪，设置合适的参数进行检测。
- 收集数据，进行细胞分类和分析。
3. 数据分析：- 利用流式细胞术分析软件（如CellQuest、FlowJo）对数据进行分析，包括细胞计数、分类、DNA含量分析等。
五、实验结果与分析1. 细胞分类：- 通过流式细胞术，成功将小鼠脾细胞和Jurkat细胞分为不同的亚群，如T细胞、B细胞等。
2. DNA含量分析：- 通过PI染色，检测细胞的DNA含量，发现小鼠脾细胞和Jurkat细胞均处于G0/G1期。
3. 表面标记物分析：- 通过CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC抗体检测，发现Jurkat细胞为T细胞，小鼠脾细胞中含有B细胞和T细胞。
竭诚为您提供优质文档/双击可除流式细胞仪实验报告篇一：流式细胞术实验报告流式细胞术实验目的掌握流式细胞仪的工作原理掌握用流式细胞仪测量细胞群体DnA含量分布的方法了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用实验原理流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。
在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。
通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、Dn(:流式细胞仪实验报告)A、RnA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。
细胞内的DnA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如g0/g1期的DnA含量为2c，而g2期的DnA含量是4c。
利用pI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DnA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。
仪器、材料与试剂仪器：流式细胞仪、离心机。
材料：hela细胞样品、试管、离心管、封口膜、微量移液器、Tip头、eppendorf管。
试剂：70％乙醇（保存于4℃），Rnase（-20℃保存），pI染液（避光保存于-20℃），pbs(ph7.4，保存于4℃)实验步骤样品细胞由老师于课前收集并置于70%(预冷)乙醇中4℃下固定过夜。
2000rpm15min收集固定细胞，pbs洗2次。
用100μLpbs重悬细胞并转至试管中轻轻吹打（防止细胞破碎）。
加pI染液50μL和Rnase约2μL室温放置15min。
上机检测。
样品测定并使用modFitLT软件分析结果。
实验结果与讨论:所测样品中各周期时相的百分比：g1期68.48%g2/m期16.63%s期14.89%g2：g1=1:1.77cV12.16提示结果可能不可靠或存在多倍体细胞。
流式细胞术是一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。
用以分析细胞大小、细胞周期、DnA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。
这种技术具有以下特点1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法（Fcm综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
流式细胞仪数据分析5.1 数据采集及显示光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。
流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。
根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。
4参数（FSC，SSC，FITC和PE）的单细胞分析会生成8位数据。
当单个样品累计收集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB。
数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。
单参数如FSC或FITC（FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道。
纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量（如图5-1）。
处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。
通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。
图5-1 流式数据分析图双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1（FL1），Y轴显示通道2（FL2）。
3维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量（如图5-1）。
习题：数据采集及显示1 在直方图中横轴和纵轴分别表示。
2 二维点图用于显示参数。
3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表。
5.2 设门通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。
如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。
图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图习题：设门1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。
（对错）5.3 细胞亚群的数据分析数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。
如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。
如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。
图5-3 选定淋巴细胞亚群设门门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。
在下面的实例中，我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法。
我们可以通过单参数直方图，二维点图和三维图来分析结果。
单参数直方图可定位边界，二维点图可设置象限标志。
如果需要，还可以建立数据统计表以输出结果。
直方图可直观单个参数的细胞数量。
阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界（见图5-4）。
左图中M1为阴性对照峰。
右图中M2为CD3 FITC阳性峰。
图5-4 阴性对照峰M1（NORM001）和CD3 FITC阳性峰M2（NORM002）图5-5的统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内淋巴细胞2891个。
其中M1（阴性）细胞619个，M2（CD3阳性）细胞2272个细胞。
淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为：M2：2272/2891=78.59%。
图5-5 直方图统计结果二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。
图5-6为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。
左下象限（LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19 PE），左下象限（LR）为X轴阳性细胞（CD3 FITC），右上象限（UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）。
图5-6 阴性对照组(NORM001)和CD3 FITC/CD19 PE双染样本(NORM002) 如图5-7所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞（CD19+/CD3+）的百分含量为：296/2839=10.43%。
图5-7 散点图统计结果另一个分析方法是划定区域，也就是设门。
我们可以用不同形状的绘图工具定义所选区域（如图5-8所示）；然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量。
在图5-9中，R4门内为CD4阳性，CD3阴性的淋巴细胞亚群，其结果为：40/2866=1.40%。
图5-8 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本分析图图5-9 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本数据统计结果这种方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷，因为如果事先定义好细胞亚群的区域或边界，在随后的文件中，下一个样本的细胞亚群位置会发生变化，这就需要操作者重新调整区域或边界位置。
为避免这种情况的发生，我们采用一种称为集群分析（cluster analysis）的新方法。
BD公司的MultiSETTM 和AttractorsTM软件就属于集群分析软件。
该软件的特点是会随着整个细胞亚群的移动而移动，自动变换区域或边界到相应的细胞亚群位置（见图5-10）。
图5-10 使用Attractors分析软件时二维点图的前后变化对比5.4 流式细胞仪的其它应用以及数据分析这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量，对于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用。
因为单克隆细胞株是单个细胞群，在大多数情况下，既不是100%阴性，也不是100%阳性，所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度和阳性率。
如果样本的统计结果远远大于阴性对照组，那么我们认为其结果是阳性的，两者间的差异越大，说明细胞的表达越高，阳性率越高。
如图5-11所示，左图为单细胞群的散射光信号，右图为阴性对照组和两种不同抗体染色样本的峰叠加图。
每个峰的几何均值分别为2，5和20（从左至右）。
图5-11 单细胞株分析图除检测阳性率，几何均值法和中位法还用于分子（接合子）定量分析。
QuantiCALCTM软件就是使用中值法计算每个细胞的抗体结合位点数。
如图5-12所示，Y轴上的圆圈代表从标准曲线获取的信息，用于计算每个细胞的接合点位数。
图5-12 使用QuantiCALC软件计算每个细胞的抗体结合位点数我们使用ModFit LTTM软件进行DNA定量分析。
因为DNA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是离散的，所以我们对曲线以下的面积进行积分，以得到每个细胞亚群的百分含量结果。
图5-13 细胞周期的DNA直方图习题：数据分析1二维点图和一维直方图的作用分别是什么？2 见图5-4和图5-5，CD3阴性和阳性的百分含量分别是多少。
3 LL象限代表双阳性细胞亚群。
（对错）4 见图5-6和图5-7，淋巴细胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多少。
5 只能使用矩形设定细胞区域范围。
（对错）6 使用区域设定法分析样本有哪些不足。
7 避免细胞亚群移动的分析方法是什么。
8 在定量分析中我们使用哪些分析方法检测阳性率。
5.5 CellQuest和CellQuest Pro软件使用CellQuest和CellQuest Pro软件是目前运用最为广泛的流式细胞仪采集及分析软件。
它运行于苹果电脑上，优质的矢量图显示使得操作界面特别优美。
现最新的微软公司的Vista 软件也是仿苹果操作系统界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuest Pro时的强大功能及视觉质感。
CellQuest和CellQuest Pro软件主安装在BD FACSCalibur型流式细胞仪上。
1．软件数据流程在CellQuest和CellQuest Pro软件的数据流分为二个部分：方案和数据包。
方案是指用户可以建立采集或分析所需的直方图或散点图、设门并定义门与门、门与图之间的逻辑关系。
可以使用方案进行数据采集或分析以往已有的数据。
每个采集方案分析样本后会生成数据包，该数据包中包括了样本中每个颗粒在各个检测参数上的数值，格式为FCS2.0或FCS3.0。
数据包必须由方案文件打开，无法单独显示，或者可由第三方软件进行分析，如WinMDI 。
2.软件与仪器的连接流式细胞仪需要加电开启后会向计算机发出信息，所以如要进行实验需要先开启流式细胞仪，然后再开启计算机。
1、 先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常通讯。
2、 在苹果菜单下点击CellQuest 和CellQuest Pro 软件。
3、 从Aquire 菜单下选择connet to cytometer 。
3．方案与数据之间的关系CellQuest 和CellQuest Pro 软件的方案与数据相互独立保存，数据包可以由任一方案文件进行分析，分析后不改变数据包中的任何数据。
CellQuest 和CellQuest Pro 软件中方案内的直方图或散点图有三种状态：Acquire ，Analysis 和Acquire-Analysis 。
当图的属性为Acquire 时，此图只限于采集下用，即只当进行检测时它才能显示颗粒；当图的属性为Analysis 时，此图只限于分析已保存的数据包，它不能用于采集数据。
当图的属性为Acquire-Analysis 时，此图即可用于采集数据也可用于分析已有数据。
所以方便起见，我们一般将方案中的直方图或散点图全部设为Acquire-Analysis 属性。
CellQuest 和CellQuest Pro 方案文件的图标CellQuest 和CellQuest Pro 数据文件的图标CellQuest 和CellQuest Pro 软件中还会有关于仪器设置的文件，保存所有的实验条件。
它只能由CellQuest 和CellQuest Pro 软件打开。
CellQuest Pro CellQuest 4．方案的建立A 选择实验参数默认情况下，FACSCalibur 流式细胞仪开机后只打开一根激光器，及五个参数供选择使用：FS 、SS 、FL1、FL2、FL3。
当我们要使用第二根激光器及FL4通道时需要勾选FL4的选项，仪器自动打开633nm 激光器。
B,建立散点图或直方图，命名坐标的页面上进行编辑建立各种直方图或散点图。
使用工具条可以建立散点图、直方图并在图上设立各种门。
在CellQuest 软件下，需在选择Plot 菜单，选择Format 来打开图的属性对话框，其中包括了关于该图所有选项。
建立好直方图或散点图后，我们需要对所选的参数进行命名，如不修改软件自动命名为FS 、SS 、FL1、FL2、FL3和FL4。
在CellQuest Pro 软件中，如果Inspector 窗口开着的话，选中任意直方图或散点图就会出现该图的属性，其中包括有X 、Y 轴的参数、是否多色显示、图的分析或采集属性等等。
在菜单上选择Acquire 栏目，选择Parameter Description ，可出现关于文件存储和参数命名的对话框。
在这个对话框中用P 字母来代表每个参数，并在此对每个采集参数进行命名，FL1为CD3FITC ，FL2为CD4P E ……。
C,设门并建立门与图之间的关系R 与G 的关系R 是Region 的首个字母，Region 一般是指一个闭合形的区域，如矩形区、自由区和圆形区。
区域与区域之间可以进行逻辑运算，如AND 、OR 、NOT 等关系。
当区域进行运算时软件引进了算术公式的管理概念：Gate 实际了个代数式，简称G ，其运算式默认如下：G1 = R1，或G2=R2当我们要进行逻辑运算时，可变更为G1=R1 AND R2。
