生物化学技术与原理 (2)

第一章生物化学基本操作与要求1.洗涤剂的种类配置与应用（1）铬酸洗液由重铬酸钾与浓硫酸组成，具强酸性、强氧化性，适合用于玻璃器皿的洗涤。

棕褐色，用久了之后颜色变绿，失效（2）30％硝酸洗涤CO2测定仪器及微量滴管（3）45％尿素洗涤蛋白制剂、血样（4）有机溶剂（5）去污粉2.化学试剂的分级3.什么是准确度、精密度？1. 准确度与误差准确度的高低可用误差衡量绝对误差＝测定值－真实值相对误差＝绝对误差/真实值×100％2. 精密度与偏差精密度指多次测量结果相互吻合的程度，表示测定的再现性。

精密度的高低用偏差衡量。

绝对偏差＝测定值－算术平均值相对偏差＝绝对偏差/算术平均值×100％4.如何提高实验的准确度、精密度？准确度——系统误差（1）仪器校正（2）空白实验（3）对照实验精密度——偶然误差（1）平均取样（2）多次取样第二章层析技术1.层析技术及其原理层析（色谱）技术是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。

层析都是由互不相溶的两个相组成:一是固定相，一是流动相。

层析时，利用混合物中各组分理化性质的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（Kd）不同，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。

2.名词固定相：固定相是层析的基质。

它可以是固体物质（如吸附剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。

流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。

分配系数：分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用Kd来表示。

混合物各组分的分配系数差异越大，越容易分离开。

Kd =固定相中的总量/流动相中的总量3.层析法的分类(一)根据流动相的形式分类气相色谱法：气固色谱法和气液色谱法液相色谱法：液固色谱法和液液色谱法（二）按固定相的形式分类柱层析法：柱层析法是将固定相装在一金属或玻璃柱中做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法。

纸层析法：纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。

薄层层析法：薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。

(三)按分离原理分类1.吸附层析2.分配层析（正相色谱、反相色谱）3.凝胶排阻层析4.离子交换层析5.亲和层析法4.几种主要凝胶的名称、型号、及型号数字代表的含义1）交联葡聚糖凝胶，Sephadex 的主要型号G-10 ~ G-200，后面的数字是凝胶的吸水率（单位是ml/g干胶）乘以10。

如Sephadex G-50，表示吸水率是5ml/g干胶。

2）聚丙烯酰凝胶，Bio-gel P，p值表示不同的交联度，p越大，孔径越大。

P后的数字乘1000相当于凝胶排阻极限。

3）琼脂糖凝胶，常见的主要有Amersham(Pharmacia)(GE) 生产的Sepharose（2B ~6B）和Bio-Rad 生产的Bio-gel A4) Ultragel 聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶5）Sephacryl凝胶6） Superdex凝胶、Superrose凝胶7）聚乙烯醇凝胶toyopearl8）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel5.凝胶层析及其基本原理、操作过程和主要应用凝胶色谱也称为凝胶排阻层析、凝胶过滤和分子筛层析。

它是60 年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。

原理：由于被分离物质的分子大小不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。

操作过程：1）凝胶的选择：粒子大小与孔径的选择分组分离、分级分离2）层析柱：柱内径、长度；比值1:25~1003）凝胶处理：吸水膨化，要对凝胶进行纯化，排除气泡4）装柱：避免气泡，漏出粒子，防止分层5）柱填充的检查凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果。

凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。

通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000上柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。

如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的凝胶填装情况较好，可以使用；如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。

6）加样要尽量快速、均匀。

另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。

一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％－10％左右。

7）洗脱和其它层析方法相比，凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。

一般采用低离子强度的盐溶液一般凝胶的流速是10 cm / hr8）再生：洗脱完毕9）保存凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂，通常加入0.02％的叠氮化钠，4°C下保存。

如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、干燥。

应用：1）脱盐及去除小分子杂质2）蛋白质的分离、生物大分子的纯化3）分子量测定，K ＝－b lg MW＋c Ve＝－b'lg MW＋c‘4）去热源物质5）溶液的浓缩6.离子交换层析的原理、离子交换剂的类型依据各种带电离子或生物大分子与带相反电荷离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。

（1）根据离子交换剂的基质分离小分子物质：聚苯乙烯离子交换剂分离大分子物质：葡聚糖离子交换剂（2）离子交换剂的电荷基团：阴离子交换剂:AE-纤维素（弱碱型）PAB-纤维素（弱碱型）DEAE-纤维素DEAE -SephadexDEAE -纤维素（强碱型）QAE-纤维素（强碱型）阳离子交换剂:CM-纤维素（弱酸型）P-纤维素（中强弱酸型）SE-纤维素（强弱酸型）SP-纤维素（强弱酸型）7.离子交换色谱的操作和应用操作：1）剂型的选择：根据分子大小、电荷、基质2 ）离子交换剂的预处理洗涤：阳离子交换剂用碱处理，阴离子交换剂用酸处理3 ）柱的规格4 ）装柱5 ）加样6 ）洗脱应用：1. 水处理：制备纯水2. 分离纯化小分子物质3. 分离纯化蛋白质等生物大分子物质8.何谓亲和层析利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。

9.各种层析原理和载体的综合比较第三章电泳技术1.电泳技术的概念电泳：：带电物质在电场中向相反电极移动的现象电泳技术：不同的物质正在一定的电场强度下，由于所带电荷、分子大小形状等性质的差异，向相反电极泳动速度不同，进而达到分离目的的一项技术。

2.电泳的分类按其分离原理：区带电泳、自由界面电泳、等速电泳、等电聚焦电泳按支持介质的不同分类：纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按支持介质形状不同：薄层电泳、板电泳、柱电泳按用途不同分类：分析电泳、制备电泳、定量免疫电泳、连续制备电泳按所用电压不同分类：低压电泳、高压电泳3.什么是迁移率？影响迁移率、电泳分离的主要因素（1）电泳迁移率是指在单位电场强度时带电分子的迁移速度。

（2）迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成正比。

（3）电泳分离的主要因素：1、首先决定于带电颗粒的性质：即颗粒所带净电荷的数量，大小及形状。

2、缓冲液的pH值3、缓冲液的离子强度4、电场强度5、电渗作用6. 支持介质的筛孔3.如何制备聚丙烯酰胺凝胶？1.化学聚合（1）化学聚合的催化剂通常采用过硫酸铵（Ap），此外还需要加速剂TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。

微量TEMED的加入，可使过硫酸铵形成自由基：S2O82- 2SO4-这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。

（2）光聚合：光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。

TEMED的存在，可以加速聚合。

4.聚丙烯酰胺凝胶电泳和不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别、分离效率区别：不连续的：1. 凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。

2. 缓冲液离子组成、各层凝胶的pH不同。

3. 在电场中形成不连续的电位梯度分离效率：1. 样品的浓缩效应2.电荷效应3.凝胶的分子筛效应5.简述等点聚焦及其优缺点在电泳凝胶中加入两性电解质载体(如，Ampholyte ），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。

两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其pI相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。

优点是：1.有很高的分辨率，可将pI相差0.01pH的蛋白质分开；2.一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走的距离加长，区带越走越宽，而等电聚焦能抵消扩散作用，使区带越走越窄；3. 由于这种电聚焦作用，可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01pH单位。

缺点是：1.等电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀，2. 样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。

6.什么是双向电泳？双向电泳由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)组成，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。

用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。

第四章离心技术1.离心技术的概念离心（centrifugation）技术是利用转头旋转产生的离心力，根据物质颗粒沉降系数、质量、密度的差异将其分离的方法。

2.名词：相对离心力：在离心力场的作用下，颗粒所受离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度沉降速度：在离心力作用下，单位时间内物质颗粒运动的距离。

沉降系数：单位离心力下的沉降速度，（沉降系数与颗粒的大小、形状、密度，与介质的密度、粘度有关，与离心的速度无关。

）沉降常数：颗粒在20℃水中的沉降系数，s 20，w以S表示，1S＝10－13 s（单位是秒）3.离心机和离心转头的种类离心机：1）离心机可按转速分为低速、高速、超速离心机。

2）又分为制备性离心机和分析性离心机，制备性离心机主要用于分离各种生物材料，分离的样品容量比较大，分析性离心机一般都带有光学连续监测系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，能推断物质的纯度、形状和分子量等。

低速、高速、超速离心机冷冻离心机台式、地式离心机制备性、分析性离心机离心转头：角度转头FA、甩平式转头SW、垂直转头V、区带转头Z、连续流动转头CF4.简述离心分离的方法差速离心法：采用不断改变离心速度，使沉降速度不同的颗粒在不同的离心速度及不同的离心时间下分批分离的方法。