结核分枝杆菌最新检测技术

肺结核实验室检测方法金标准
肺结核实验室检测的金标准是基于培养和鉴定结核分枝杆菌。

以下是具体步骤：
1.痰液样本收集：患者需要提供早晨醒来时的深咳痰液样本，
以获得有效的细菌数量。

2.痰液预处理：痰液样本经过预处理，包括离心和去除杂质。

这一步通常包括液体化和浓缩痰液。

3.痰液培养：将预处理后的痰液接种到培养基上，通常是液体
培养基。

培养基中的结核分枝杆菌将逐渐增殖形成菌落。

4.鉴定：通过常规培养、染色和生化试验等方法，鉴定已培养
的菌落是否为结核分枝杆菌。

5.药敏试验：对已鉴定的结核分枝杆菌进行药敏试验，以确定
哪些药物对其具有抗菌作用，从而为治疗方案的选择提供依据。

此方法被认为是金标准，因为它能够准确检测到结核分枝杆菌，并且可以确定其对药物的敏感性，为结核病的诊断和治疗提供可靠的结果。

但是，该方法需要相对较长的时间（通常需要几周）来进行培养和鉴定，因此在临床实践中可能需要其他更快速的检测方法来尽早确诊结核病。

ELIspot技术检测结核分枝杆菌感染检测原理检测原理是：机体感染结核分枝杆菌后，存在于血液中的特异性效应T淋巴细胞会在再次接触结核分枝杆菌特异抗原时，产生和分泌IFN-γ，通过检测能够释放IFN-γ的T淋巴细胞数量，用于结核分枝杆菌感染及结核病的辅助诊断。

该检测方法相对于结核菌素试验，具有更高的特异性。

由于结核菌素试验中用的结核菌素是从结核分枝杆菌中提取的非种属特异的性分子，因此存在与卡介苗（BCG）的交叉，接种过BCG的人群即使没有感染结核也可能会出现结核菌素试验阳性。

而ELIspot检测所用的结核分枝杆菌特异抗原与BCG抗原无交叉，不受BCG接种的影响，未接种BCG和接种BCG的人群均可用该法进行结核病感染的筛查和结核病的辅助诊断。

目前应用的ELIspot检测试剂盒是由英国Oxford Immunotec公司生产的T-SPOT®TB试剂盒。

其检测方法如下：1.抗体包被将适量人IFN-γ抗体预先包被于96孔ELIspot板上。

2.标本采集及准备采集8小时内的肝素抗凝血，用Ficol离心分离外周血单核细胞（PBMC），用细胞培养液洗涤2次后，重悬于细胞培养液中。

3.细胞计数及稀释用台盼蓝染色计数法对PBMC细胞悬液计数，将细胞悬液浓度调整至2.5×105个细胞/100μl。

4.抗原刺激及孵育每个待检样本均需设阳性对照孔、阴性对照孔和检测孔。

阳性对照孔加入植物血凝素（PHA）作为阳性刺激抗原，阴性对照孔不加任何抗原刺激，检测孔加入结核特异性抗原。

若有几个特异性抗原进行分别刺激，检测孔可根据需要设置多个孔。

向阳性、阴性对照孔及检测孔内各加入100μl的PBMC细胞悬液，将ELIspot板置于37℃5%CO2培养箱内静置孵育16～20小时。

孵育期间不能移动ELIspot板，必须保证板静置不动。

5.斑点显色及计数弃除板内的细胞培养液，每孔加入200μl的PBS缓冲液洗涤3～5次，弃净板内的液体，向每孔加入100μl稀释好的生物素标记抗体，37℃孵育1小时。

《结核分枝杆菌和人类免疫缺陷病毒感染双向筛查技术应用专家共识》（2024）要点1 TB/HIV双向筛查技术手段1.1 在HIV感染者/AIDS患者中开展活动性TB/结核感染筛查目前WHO推荐用于HIV感染者/AIDS患者活动性TB筛查的方法有TB症状筛查、CXR、C-反应蛋白（CRP）检查、尿脂阿拉伯甘露聚糖抗原侧流（LF-LAM）免疫检测以及MTB 分子快速诊断方法。

我国工作实施方案中还要求对于HIV感染者/AIDS患者定期进行TB 病原学检查。

1.1.1 TB症状筛查我国对于感染HIV病毒的人群（PLHIV）的TB症状筛查主要基于门诊随访时的问卷调查，筛查症状包括：咳嗽、咳痰持续2周以上；痰中带血、反复发热持续2周以上；反复夜间出汗、无法解释的体重明显下降、经常容易疲劳或呼吸短促、淋巴结肿大。

1.1.2 胸部影像学检查胸部影像学检查是筛查、诊断或排除活动性肺结核的重要手段之一。

胸部影像学检查包括CXR、胸部CT断层扫描等，是普及性较广的一种检测手段。

1.1.3 TB细菌学检查TB细菌学检查是诊断活动性肺结核的重要检测方法，主要包括痰涂片和痰培养，临床上广泛用于一般人群肺结核的诊断和鉴别诊断。

目前尚无其他检测手段能代替痰培养作为TB实验室确诊的“金标准”。

1.1.4 快速分子生物学检查随着核酸检测技术的迅速发展，快速分子生物学检测已广泛应用于TB诊断，国外研究显示其在HIV感染者/AIDS患者中开展结核筛查也具有较高的灵敏度和特异度。

1.1.5 CRP检查CRP是一种非特异性的炎性标志物，与机体的感染或应激状态相关。

CRP检测简便、价廉、易操作，是POCT的常用项目，普及性高。

1.1.6 LF-LAM免疫检测我国尚未引进该项技术。

1.1.7 结核感染检查WHO和我国推荐用于HIV感染者/AIDS患者LTBI筛查的方法有结核菌素皮肤试验（TST）、γ-干扰素释放试验（IGRA）和基于结核分枝杆菌抗原的皮肤试验（TBST）。

结核分枝杆菌诊断技术的发展及目前临床应用的新型诊断技术产品分析快速准确地诊断出结核分枝杆菌感染是控制和治疗结核病的前提和关键。

多年来，结核杆菌的诊断技术在不断地发展和创新，近年来，一些针对结核杆菌检测的新方法陆续被报道，一些新型的诊断技术产品也陆续上市。

本资料综述了结核杆菌的主要诊断方法，并对目前国际市场上广泛应用的商业化诊断技术产品进行了简要分析。

标签：结核分枝杆菌；诊断技术；分析Advance in diagnosis techniques of Mycobacterium tuberculosis and analysis of new diagnostic technologies and products in clinical applicationFENG?Meimei1??SU?Wenqin21.Haikou VTI Biological Institute,Haikou 570311,China;2.Department of Pharmacy,Hainan Medical College,Haikou 571199,China[Abstract] Fast and accurate diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection is the key and prerequisite to control and treatment tuberculosis.For many years,the diagnostic techniques of Mycobacterium tuberculosis have been developing and innovating.In recent years,some new techniques for Mycobacterium tuberculosis detection were reported and some new diagnostic products have been listed.This paper reviewed the main diagnosis techniques of Mycobacterium tuberculosis,and analysed briefly the commercialized diagnostic products which are used widely in the international market now.[Key words] Mycobacterium tuberculosis;Diagnosis;Analysis结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，以肺结核最多见。

结核分枝杆菌的微生物学诊断方法
1.痰液涂片染色：这是最常用的方法之一、将痰液制备成涂片，进行
酸性染色，如抗酸杆菌染色和耐酸染色。

结核分枝杆菌是抗酸杆菌，其细
胞壁富含脂质，可以抵抗酸性染料的脱色作用。

这种方法可以快速检测出
结核分枝杆菌的存在。

2.结核分枝杆菌的培养：这是鉴定结核分枝杆菌的“金标准”。

痰样
品通常会涂在含有富含营养物质的培养基上，并在适当的温度和湿度条件
下孵育。

结核分枝杆菌需要一个相对较长的孵育时间（通常需要数周）才
能生长和生成可见的菌落。

分枝杆菌的培养是确诊结核病的关键步骤，同
时还可以进行对特定抗结核药物的药敏试验。

3.伊红染色：这种方法旨在鉴定酸酒杆菌属分枝杆菌和其他酸杆菌的
超微结构。

伊红染色可使细胞壁和细胞内储存的色素显现为红色或粉红色。

该方法可以帮助确定分枝杆菌的类属。

4.PCR检测：聚合酶链反应（PCR）能够通过扩增目标基因片段来检
测和诊断结核分枝杆菌。

这种方法具有高度特异性和灵敏度，并可以通过
荧光标记的探针来定量检测。

5.蛋白质组学：蛋白质组学技术通过检测和分析结核分枝杆菌内部蛋
白质的组成和变化，可以为诊断和治疗提供信息。

质谱法是一种常用的蛋
白质组学技术，可以通过检测菌落样品中的特定蛋白质来鉴定结核分枝杆菌。

总的来说，微生物学诊断方法在结核分枝杆菌检测和鉴定中起着至关
重要的作用。

这些方法可以帮助医生确定结核病的诊断和治疗方案，并对
结核分枝杆菌的流行病学研究和控制提供重要的科学依据。

肺结核属于肺部慢性传染疾病，临床发病率高，该病的主要致病菌为结核分枝杆菌，病程相对较长，会向全身多个脏器累及。

菌阴肺结核指的是通过一次结核杆菌培养以及三次痰涂片检查，结果均显示为阴性的肺结核患者，具有较低的传染性。

大多数患者不了解菌阴肺结核的相关性知识，如果没有采取及时有效的诊断、治疗，患者的病情就会延误，继而转变为阳性，对患者的预后造成不利影响。

目前，临床中对于菌阴肺结核的特异性诊断措施相对缺乏，最常用的方法就是痰或呼吸道采集标本中结核分枝杆菌的检验。

近年来，结核病的发病率及死亡率呈现逐年上升的趋势。

筛选出一种能有效确诊早期结核病的检验方法十分重要。

目前临床上应用于辅助结核病诊断的检验方法以结核分枝杆菌培养和抗酸染色涂片为主，其中培养法作为结核疾病诊断的金标准具有准确性高、特异性高的优势。

结核分枝杆菌痰的分离培养，消耗时间较长，如果利用固体改良罗氏培养基进行培养，一般会需要至少20d，最长可需要60d，如果使用先进的全自动分枝杆菌进行检测，至少需要7d，至多需要20d。

实验室一般会通过痰涂片法进行检测，该方法的操作相对简单，价格较低，但是，操作费时，在基层痰检实验室涂片量过大的时候，一天内无法得到实验结果，这种现象无法满足目前的结核病防治工作。

近些年来，随着染色技术的逐渐先进，荧光染色技术作为新型的实验手段，已经在医学科学领域中广泛应用。

目前，涂片染色法已经成为无菌体液的主要检查方法，但是，通过传统制片以及染色法的检出率相对较低，误诊率以及漏诊率较高。

主要是因为染色时制片以及标本固定环节容易出现误差，而细胞沉淀仪法、改良的抗酸染色法、萋-尼氏抗酸染色法、金胺O荧光染色法、PCR等技术的应用越来越多。

传统方法：获取痰标本后，排除口水痰，然后纳入研究范围，确认纳入的当天，需要在每份痰标本相同位置，取两份，制成痰涂片。

离心处理标本，再在洁净的玻片上涂抹沉渣，涂完一层之后，使其自然干燥，再次涂抹，形成厚涂片，先使用萋尼抗酸染色法进行染色，随后使用石炭酸复红溶液初染，再使用盐酸酒精脱色，然后用美兰复染，寻找红色区域，待涂片干燥后置于显微镜镜检，于蓝色背景中寻找红色的杆状、分枝状细菌。

分枝杆菌检测方法总结分枝杆菌检测方法主要有以下几种：1. 痰涂片：这是最常用的方法，优点是快速、低廉、操作简便，但无法区分死活菌，尤其是无法区分结核分枝杆菌（MTB）和非结核分枝杆菌（NTM），而且受制于痰液中分枝杆菌数量，敏感性较低，漏检率很高。

2. 结核培养：与痰涂片相比，培养法灵敏度增加了不少，结核培养阳性是诊断抗酸杆菌的金标准，但缺点在于培养时间周期过长，一般需要8周左右时间，这样很耽误医生用药和患者及时治疗。

3. 结核杆菌IgG抗体检测：感染结核分枝杆菌后，体内可产生特异性抗体。

将结核分枝杆菌抗原包被在固相载体上，与待测血清反应，血清中相应的抗体可结合于其上，再以胶体金（或酶）标记，显示反应，可检出血清中结核分枝杆菌抗体。

结核杆菌IgG抗体检测特异性较好，对于排除结核阳性有利，但无法确诊活动性结核。

4. Xpert MTB/RIF：通过检测MTB基因组中的rpoB基因及其突变情况，实现MTB核酸和利福平耐药检测的全自动实时荧光定量核酸扩增技术。

具有以下优势：特异性好，能准确区分MTB和NTM；灵敏度高，检测快速，仅需要两个小时就完成检查了；适用于各种标本，痰液、肺泡灌洗液、肺组织、脑脊液、淋巴结、关节液以及尿液等均可用于检测；同时可以检测利福平耐药，检测对一线抗结核药物利福平的耐药情况，敏感性特异性极高，可及时为临床用药提供有效参考。

5. IGRA：γ-干扰素释放试验（IGRA）是检测结核分枝杆菌（MTB）特异性抗原刺激T细胞产生的γ-干扰素（IFN-γ），以判断是否存在MTB感染。

IGRA适应证主要包括结核潜伏感染（LTBI）的诊断和活动性结核（ATB）的辅助诊断。

与结核菌素皮肤试验（TST）相比具有明显优势：特异度高，不受卡介苗接种及大多数非结核分枝杆菌（NTM）的干扰；使用单一阈值作为阳性判断标准；作为体外诊断方法，更适用于疫情检测和流行病学调查。

IGRA是世界卫生组织（WHO）推荐的用于诊断MTB感染的体外免疫学方法。

结核xpert操作方法结核xpert是一种用于检测结核病的快速和准确的诊断工具。

它采用了分子生物学技术，可以检测结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的DNA。

结核xpert可用于疑似结核病患者的诊断和治疗监测，对于结核病的控制和预防具有重要意义。

以下是结核xpert操作的一般步骤：1.样本收集：从痰液中收集样本，以确保能够检测到结核分枝杆菌的存在。

痰液样本应该是早晨在患者清洁口腔后的第一次咳嗽产生的，这样可以最大程度地提高结核分枝杆菌的检出率。

2. 样本处理：将收集到的样本加入到结核xpert试剂盒中，并进行必要的处理步骤，如离心和稀释。

这些处理步骤旨在提高结核分枝杆菌的浓度和纯度，从而提高检测的灵敏度和准确性。

3. DNA提取：使用结核xpert试剂盒中提供的化学试剂对样本进行DNA提取。

结核分枝杆菌的DNA是进行后续PCR扩增反应的关键物质。

4. PCR扩增反应：将提取的DNA加入到结核xpert试剂盒中的扩增反应体系中，并进行PCR扩增反应。

PCR反应是一种用于扩增目标DNA的技术，通过特定的引物和酶使得目标序列按照模板DNA进行复制，从而大量增加了目标DNA的数量。

5. 结果分析：结核xpert设备会自动分析PCR扩增反应产生的结果，并给出结核分枝杆菌的检测结果。

结果以阳性、阴性或无效进行分类。

阳性表示样本中存在结核分枝杆菌的DNA，阴性表示样本中不存在结核分枝杆菌的DNA，无效表示检测过程中出现了问题，无法得出准确的结果。

1. 快速：结核xpert可以在2小时内提供结核分枝杆菌的检测结果，远远快于传统的痰涂片检测方法，节省了患者等待时间和诊断周期。

2. 准确：结核xpert的敏感性和特异性都很高，可以准确识别结核分枝杆菌的存在，大大降低了误诊和漏诊的风险。

3. 简便：结核xpert的操作相对简单，只需对样本进行处理和处理，并将试剂盒放入设备中进行PCR扩增反应，设备会自动分析结果，无需其他复杂的实验步骤。

结核分枝杆菌的耐药性及检测方法结核病是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的慢性传染病，主要累及肺部，但也可侵犯其他器官。

然而，近年来出现了结核分枝杆菌对抗生素的耐药性问题，给结核病的防治带来了巨大挑战。

本文将就结核分枝杆菌的耐药性机制以及常用的检测方法进行论述。

一、耐药性机制1.多重耐药（MDR）多重耐药是指结核分枝杆菌对两种最主要的抗结核药物——异烟肼和利福平同时产生耐药现象。

这种耐药形式使得传统治疗手段无法有效控制感染，并且增加了传播风险。

2.延迟耐药（XDR）延迟耐药是在MDR基础上，又产生对氟喹诺酮类等二线抗结核药物的耐药性。

这使得治疗选择更加有限，且通常需要使用更昂贵和毒副作用更大的抗结核药物。

3.全耐药（TDR）全耐药是指对所有一线和二线抗结核药物都产生耐药现象，这种情况下仅能依靠其他的药物才能进行治疗。

然而，这些替代治疗方案费用昂贵且可行性有限。

二、检测方法1.传统的抗生素敏感性测试传统的抗生素敏感性试验使用培养分枝杆菌，并将其接种于含有抗生素的琼脂平板上。

通过观察细菌在不同浓度抗生素下的生长情况来判断其对该抗生素是否具有耐药性。

尽管这种方法简单易行，但其确诊时间较长，且容易出现误判。

2.分子检测方法随着分子生物学技术的进步，利用PCR技术可以更快速地检测结核分枝杆菌的耐药基因突变。

这种方法通过检测与耐药性相关基因序列的存在与否来确定细菌对特定抗生素是否具有耐药性。

由于PCR技术高灵敏度和高特异性，它已成为常用的结核分枝杆菌耐药性检测方法之一。

3.流式细胞术流式细胞术利用荧光标记的结核分枝杆菌单个细胞对特定抗生素的反应进行测定。

通过测量细胞内荧光信号的变化来判断其对抗生素是否产生了耐药性。

这种方法具有高通量和快速的优势，但需要对样本进行前期处理以获得单个菌落。

4.质谱法质谱法利用MALDI-TOF质谱仪检测结核菌代谢产物图谱与数据库匹配，从而快速确定结核分枝杆菌的耐药类型。

聚合酶链反应检测结核分枝杆菌结核分枝杆菌可以导致全身性疾病，特别是在发展中国家，其发病率较高，危害性极大。

近几年结核杆菌的变异性较大，对抗结核药物的耐药性增加，从而使结核病的发病大幅度增高。

虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检查对大部分结核能作出正确的诊断，但对某些患者亦可造成误诊或漏诊；动物接种虽特异性较高，但因时间较长，不能满足临床快速诊断的需要。

近几年也出现了几种快速诊断方法，但也存在较大的缺陷，如短期培养后抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶联免疫吸附试验（ELISA）检测BACTEC培养瓶中被培养标本所分泌的抗原，该方法可在BACTEC瓶本身鉴定出细菌之前，结合ELISA和涂片抗酸染色有效地鉴别典型和非典型分枝杆菌，敏感性较高，但存在培养时间长，重复性尚差的缺点。

另一种是短期培养后核酸探针杂交法，即用特异性DNA探针与BACTEC瓶中培养的细菌染色体DNA杂交。

该方法能有效地防止培养的假阴性结果，但却易发生假阳性结果，加之采用的方法较为复杂和繁琐，又有涉及放射性核素操作之嫌等，因而近来已较少应用。

上面两种方法都要借助细菌培养来进行，虽然在时间上比传统培养大大缩短，但缺乏快速诊断的优势。

近几年兴起的PCR方法基本实现了快速、灵敏、准确地诊断结核（TB）的目的，并且该方法正趋于常规化地应用于临床一般实验室。

应用PCR方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特异性DNA引物，该引物所引导的DNA扩增序列应是结核分枝杆菌独有的，且是结核分枝杆菌的保守序列，这样才能保证检测结果的特异性。

一、标本的采集（一）痰液标本的收集1.患者清晨刷牙漱口。

2.用力咳出气管深部第一口痰于一次性干燥无菌的50ml带盖痰杯内，1小时内送检。

3.对于无痰或少痰的患者，可用45℃加温的100g/L NaCl水溶液雾化吸入或改变体位以使痰液易于咳出。

4.小儿可以轻压胸骨柄上方以诱导咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集标本。

结核杆菌检测：从涂片、培养到T-SPOT，再到核酸肺结核是一个人人谈之色变的传染性疾病，传染性极强，可通过空气中的飞沫传播至他人。

当一个感染者咳嗽或打喷嚏时，周围的人很容易接触到携带病原体的飞沫，进而感染结核分枝杆菌。

结核杆菌检测是为了及早发现和诊断结核病，防止其传播和控制疫情的蔓延。

目前许多人对结核杆菌检测了解的并不多，下面我们来聊一聊这方面的知识，让更多的人来认识和了解它。

一、涂片法涂片操作是结核杆菌检测中的一项重要步骤，可以帮助明确是否存在结核杆菌感染。

由于结核杆菌主要通过呼吸道传播，痰液中往往含有较高浓度的结核杆菌，所以痰液是最常用的标本。

在进行涂片操作之前，需要准备好干净的玻璃片和玻璃杯，以及标准的染色试剂，如抗酸染色试剂和碱性染色试剂。

此外还需要一支细胞刮取棒或细胞刮取刷，用于采集患者的痰样液。

接下来将玻璃片放入玻璃杯中，倒入适量的痰样液。

使用细胞刮取棒或刷子，将痰样液均匀地涂抹在玻璃片上，确保涂片的厚度均匀一致。

然后将涂片晾干。

涂片晾干后，便可以进行染色，抗酸染色是常用的染色方法之一，它可以将结核杆菌染成红色，而其它细菌则染成蓝色。

二、培养法培养法是结核杆菌检测中一种常用且可靠的方法，用于检测结核病的存在和病原体的生长。

培养法的操作步骤为：先从患者的痰液中采集样本，并尽快送到实验室进行处理，以保证样本的新鲜度。

接下来，对采集到的样本进行稀释，这样做的目的是为了减少样本中的其它细菌和微生物的干扰。

通常稀释的方法是将样本与生理盐水混合，以达到适当的浓度。

之后将稀释后的样本接种到含有适当培养基的培养皿中，培养基通常包含有利于结核杆菌生长的营养物质。

接种时操作人员应该尽量避免污染，以确保只有结核杆菌生长在培养皿中。

上述操作完成后，需将培养皿密封，并置于恒温培养箱中。

结核杆菌通常在37摄氏度下生长，所以恒温箱的温度应设定为适当的温度。

在培养过程中操作人员应定期观察培养皿的变化，以检测结核杆菌的生长。